符 麗，趙福瑞，鄭希龍，李榕濤，顧雅坤，吳 怡，曾 琳

（1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570311；2海南醫(yī)學(xué)院，海口 571199）

0 引言

紫金?？谱辖鹋?ArdisiaSwartz)是由Swtarz在1788年建立的植物分類[1]，本屬植物多供藥用，種子可榨油，主要生長在2400 m以下的疏、密林下或陰濕的灌木叢中，全球約300種[2]，中國有72種、12變種，主要分布在長江流域以南地區(qū)[3]。紫金牛屬植物在民間一直有著豐富的藥用價(jià)值，具有較強(qiáng)的殺菌、抑制腫瘤等活性[4]，因而備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。如硃砂根所含皂苷對腫瘤、HIV等都有著治療作用[5]；密鱗紫金牛在孕婦產(chǎn)后使用可增強(qiáng)體質(zhì)。紫金牛屬植物多為常綠灌木和地被植物，具有較高的觀賞價(jià)值，經(jīng)常被用于園林建設(shè)和室內(nèi)裝飾[6]中，如海南三亞名花公園就曾利用野生植株進(jìn)行構(gòu)建[7]。在紫金牛屬植物其他研究方向中，有對化學(xué)成分進(jìn)行研究，如梅玲等[8]對紫金牛屬植物化學(xué)成分的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了分析，對該屬植物中化學(xué)成分的深入研究有較高參考價(jià)值；有對該屬植物種群分布研究的，如王軍等[9]對海南省各市縣紫金牛屬植物的分布進(jìn)行聚類分析，確認(rèn)海南省紫金牛屬植物種類及分布；有對該屬分支分類學(xué)關(guān)系進(jìn)行研究的，如夏念和[10]基于形態(tài)學(xué)性狀，運(yùn)用分支分析方法對中國紫金牛屬90個(gè)分類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，為紫金牛屬的分類修訂提供依據(jù)；亦有對植物栽培技術(shù)及條件進(jìn)行探索的，如邱迎君等[11]對4種紫金牛屬植物種子的萌發(fā)條件進(jìn)行了探索，為紫金牛屬植物的栽培提供有力依據(jù)，但其栽培技術(shù)尚屬稚嫩，未有進(jìn)行大規(guī)模栽培。目前該屬植物藥用價(jià)值的開發(fā)依賴于野生資源，使得其數(shù)量急劇下降，想要合理利用其豐富的藥用價(jià)值，必須有充足的種質(zhì)資源作支撐，而對物種之間有明確的鑒別則對該屬植物的種植和成分研究都有著重要意義。

種子從胚珠形成到果實(shí)脫落的整個(gè)發(fā)育過程是在植物的繁殖器官中進(jìn)行的，其生長環(huán)境相對封閉，受到外界環(huán)境因素影響較小，因此種子的特征性狀可作為植物科、屬、種的鑒別依據(jù)[12-13]。在植物學(xué)上，種子是指由胚珠發(fā)育而成的繁殖器官，它的最外面是種皮，內(nèi)含胚和胚乳[14]。而胚是一株植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)部分，形態(tài)各有不同，也可以單獨(dú)作為植物種間鑒別的依據(jù)之一。一系列的相關(guān)研究不斷地填充著紫金牛屬植物的研究領(lǐng)域，該屬植物研究領(lǐng)域雖然較為寬廣，但尚未發(fā)現(xiàn)有對該屬植物種間鑒別的研究。在紫金牛屬植物探究中發(fā)現(xiàn)，硃砂根、矮紫金牛、銅盆花、東方紫金牛、密鱗紫金牛等植物種子在形態(tài)上相似度較高，該屬植物種子之間大小形態(tài)差異不明顯，種子普遍小且外觀相似，易產(chǎn)生混淆，對種間鑒別易造成較大阻礙。解決種子之間的異同不僅對植物各領(lǐng)域研究方面有深遠(yuǎn)意義，對于物種間鑒別也起著重要作用。本研究主要使用體視顯微鏡和石蠟切片技術(shù)對紫金牛屬植物的種子進(jìn)行微形態(tài)觀察和種子胚細(xì)胞排列探索，以期找出其中的差異。為紫金牛屬植物物種鑒別提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2018年3—4月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料（表1）為采自海南各地的紫金牛屬植物（硃砂根、矮紫金牛、東方紫金牛、銅盆花、密鱗紫金牛）的種子，由國家南藥基因資源庫提供。試驗(yàn)試劑無水乙醇（純度＞99.5%）、二甲苯、甲醛，分析純，購自海南悅峰生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子外觀性狀觀察 通過眼看、手摸、體式顯微等方式對5種紫金牛屬植物種子進(jìn)行測量、觀察，主要觀察比較種子的形狀、顏色、大小、表面紋理和質(zhì)地[15]。

表1 5種紫金牛屬植物種子采集地

1.3.2 種子微性狀觀察 周建理等[16]曾對210種常用的中藥材進(jìn)行初步觀察記錄，確定了微性狀鑒定方法的可行性[17]。體視顯微鏡主要觀察的是物體表面的反射光線所生成的影像特征，能夠很好地觀察比較種子的表面起伏、紋理等。比如微性狀鑒定法在觀察表皮細(xì)胞時(shí)雖無法看清細(xì)胞內(nèi)的后含物，但對其表面的起伏、紋理和顏色則比生物顯微鏡看得更加清楚[18]。因此，本實(shí)驗(yàn)主要采用周建理提出的方法，運(yùn)用體視顯微鏡(Nikon SMZ745T)對硃砂根、矮紫金牛、東方紫金牛、銅盆花、密鱗紫金牛種子的表面胚乳、切面等進(jìn)行觀察，連接電腦進(jìn)行拍照記錄，總結(jié)5種紫金牛屬植物種子在微性狀上的差異。

1.3.3 石蠟切片顯微觀察 不同紫金牛屬植物種子由于其軟硬程度不同，所需的石蠟切片條件也有所不同[19]，本試驗(yàn)主要在潘葉等[20]的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法優(yōu)化，切片方向?yàn)榭v切，對影響因素固定的方法（常規(guī)法、微波固定法）、脫水時(shí)間、切片厚度、脫蠟時(shí)間等進(jìn)行探索，得出每種種子石蠟切片的最佳實(shí)驗(yàn)方案。具體操作如下：

（1）固定：FAA固定液（70%乙醇90 mL，冰醋酸5 mL，福爾馬林5 mL）對材料進(jìn)行浸泡，微波固定，10 min換一次固定液，固定10～15次。

（2）脫水與硬化：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇、無水乙醇各2 h。

（3）浸蠟埋蠟：硬脂酸:石蠟(1:20)65℃ 2 h，換新的硬脂酸:石蠟(1:20)67℃2 h，將熔好的硬脂酸:石蠟(1:20)倒入紙盒，依次做好標(biāo)記，冷凝后，修整成正方形或長方形小蠟塊待用。

（4）切片：利用切片機(jī)（半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)feica/Rm2245）進(jìn)行切片，HI1210攤片機(jī)、HI1220烤片機(jī)制片。（溫度均為40℃）。

（5）脫蠟：二甲苯、二甲苯、無水乙醇、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇各5 min。

（6）染色：1%番紅溶液37℃ 2.5 h、70%乙醇、85%乙醇各5 min、0.5%固綠溶液6 s后換至95%乙醇。

（7）脫水透明：無水乙醇30 s、無水乙醇1 min、二甲苯30 s、二甲苯15 min。

（8）膠封：晾干后，在材料上滴1滴加拿大樹膠，蓋上蓋玻片，輕敲將氣泡壓出，待膠干后除去多余樹膠清潔好，制成永久切片。

其中，硃砂根、矮紫金牛種子因材質(zhì)較軟，上述方案為其最佳方案。東方紫金牛、銅盆花種子的浸蠟時(shí)間調(diào)整為每次4 h。密鱗紫金牛種子浸蠟時(shí)間為每次4 h，脫蠟步驟中每種試劑浸泡時(shí)間調(diào)整為每次10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀性狀鑒別結(jié)果

由圖1可見，5種紫金牛屬植物種子均呈球形，基部內(nèi)凹，直徑4～8 mm，東方紫金牛和銅盆花種子比其他3種略小。5種紫金牛屬植物種子均沒有特殊氣味，沒有顯色反應(yīng)。東方紫金牛種子外種皮呈棕褐色、表面有縱向紋絡(luò)凸起（見圖1-A）；銅盆花種子外種皮呈棕色、表面有縱向紋絡(luò)凸起（見圖1-B）；硃砂根種子外種皮呈淺棕色、表面光滑有縱條紋（見圖1-C）；矮紫金牛種子外種皮呈淺棕色、表面有密集縱向紋絡(luò)凸起（見圖1-D）；密鱗紫金牛種子外種皮呈紅棕色、表面有縱向條紋絡(luò)微凸、密集（見圖1-E）。5種紫金牛屬植物種子中，內(nèi)種皮都呈紅棕色，密鱗紫金牛種子質(zhì)地最硬，硃砂根種子較軟。

圖1 5種紫金牛屬植物種子外觀體視圖

2.2 微性狀鑒別結(jié)果

2.2.1 種子胚乳表面鑒別結(jié)果 東方紫金牛種子胚乳表面光滑有金黃色粉末、粉末量較矮紫金牛種子多；硃砂根種子胚乳表面光滑、無鑲嵌物，易剝開。銅盆花和矮紫金牛種子表面凹凸明顯，而矮紫金牛種子凹陷處有金黃色粉末鑲嵌，銅盆花種子無鑲嵌物。密鱗紫金牛種子胚乳表面有蠟樣光澤，顏色較其它種子深，有深棕色條紋，易區(qū)分。

2.2.2 種子切面鑒別結(jié)果 矮紫金牛和硃砂根種子切面相似度高，呈透明蠟樣光澤，矮紫金牛種子胚為白色圓柱狀，直立型，貫穿整個(gè)種子，而硃砂根種子胚是透明黃色圓柱狀，較短。東方紫金牛和密鱗紫金牛種子切面呈白色，而銅盆花種子切面呈棕褐色蠟樣光澤。東方紫金牛種子胚為白色圓柱狀，直立型，胚乳外周有塊狀金黃色粉末，數(shù)量比矮紫金牛種子多，密鱗紫金牛種子胚乳有棕色溝壑鑲嵌。

圖2 5種紫金牛屬植物種子胚乳表面體視圖

圖3 5種紫金牛屬植物種子切面體視圖

2.3 石蠟切片顯微鑒別結(jié)果

硃砂根種子胚細(xì)胞形狀多為方形，中部有紡錘形細(xì)胞，可觀察出為環(huán)狀縱向排列，排列較為混亂（見圖4-A）。東方紫金牛種子胚比其他幾種植物種子胚長且細(xì)，基本上呈不規(guī)則形狀，排列緊湊，其中紡錘形細(xì)胞呈長條形縱向排列（見圖4-C）。銅盆花種子胚細(xì)胞均由長方形構(gòu)成，外層細(xì)胞與矮紫金牛相似，但比矮紫金牛的寬且短，中間細(xì)胞細(xì)長，呈紡錘形縱向排列，銅盆花種子胚的細(xì)胞排列是5種植物中最為整齊的（見圖4-D）。密鱗紫金牛種子胚細(xì)胞整體呈細(xì)長形，個(gè)體形狀不一，結(jié)構(gòu)較為緊密，排列雜亂，細(xì)胞重疊較明顯，未發(fā)現(xiàn)有紡錘形細(xì)胞（見圖4-E）。5種紫金牛屬植物種子胚細(xì)胞排列由齊到亂為銅盆花種子、矮紫金牛種子、東方紫金牛種子、硃砂根種子、密鱗紫金牛種子。

3 結(jié)論與討論

由于設(shè)備光源有限，導(dǎo)致圖片明亮程度稍有不同，但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。5種種子基部均有凹槽，其中密鱗紫金牛種子凹槽不明顯。石蠟切片實(shí)驗(yàn)中，切片太厚，容易發(fā)生細(xì)胞重疊[21]，尤其是密鱗紫金牛種子的胚，細(xì)胞較小，排列緊密，普通切片厚度不能滿足結(jié)果需要，本實(shí)驗(yàn)采用6 μm。換試劑過程中，要避免材料與空氣接觸太久，否則易產(chǎn)生材料脫落或脫色。固綠染色時(shí)，密鱗紫金牛種子胚部分比其他種子胚部分易上色。膠封時(shí)，材料會隨著與樹膠的接觸而濕潤，盡快趕走氣泡固定蓋玻片，否則易發(fā)生材料位移。在石蠟切片顯微鑒別實(shí)驗(yàn)中，由于紫金牛屬植物種子軟硬程度不同，所需的石蠟切片條件也有所不同，在前人的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法優(yōu)化，對東方紫金牛、銅盆花種子的浸蠟時(shí)間，密鱗紫金牛種子脫水時(shí)間等過程均進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，得出種子石蠟切片的最佳實(shí)驗(yàn)方案，能對以后相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供參考。顯微鑒別部分只進(jìn)行了石蠟切片的研究，如果能增加粉末鑒定方面的研究，相信會得到令人滿意的效果。在研究中發(fā)現(xiàn)，5種紫金牛屬植物種子胚位置長度略有不同，可從以上特征尋找改善種子萌發(fā)特性的方法。

種子微性狀研究主要是借助低倍儀器對材料進(jìn)行觀察，在這層面上種子微形態(tài)的特征得以展示，不會破壞種子結(jié)構(gòu)，可用在種子的鑒別與利用中[22]。紫金牛屬植物種子的性狀和顯微鑒別的研究，對其物種鑒別有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，且對植物分類學(xué)研究、生態(tài)適應(yīng)性研究，以及藥用價(jià)值的研究與應(yīng)用都有重要的意義。5種紫金牛屬植物種子在外觀上較為相似，但在種子表皮紋飾[23]、胚細(xì)胞排列上有顯著差異。

本研究對5種紫金牛屬植物種子的外觀性狀等進(jìn)行觀察，體式顯微鏡下觀察可見5種紫金牛屬植物種子均呈球形，直徑4～8 mm，東方紫金牛和銅盆花種子明顯比其他3種種子略??；東方紫金牛和硃砂根種子胚乳表面光滑，但是東方紫金牛種子胚乳表面有金黃色粉末，而硃砂根種子胚乳表面無鑲嵌物；銅盆花和矮紫金牛種子胚乳表面凹凸明顯，銅盆花種子胚乳表面無鑲嵌物，矮紫金牛種子胚乳表面有金黃色粉末鑲嵌；密鱗紫金牛種子胚乳表面顏色較深，有深棕色條紋，易區(qū)別。矮紫金牛和硃砂根種子切面相似，呈透明蠟樣光澤；東方紫金牛和密鱗紫金牛種子切面呈白色。5種紫金牛屬植物種子質(zhì)地由硬到軟排列為密鱗紫金牛種子、東方紫金牛種子、銅盆花種子、矮紫金牛種子、硃砂根種子。密鱗紫金牛、東方紫金牛、銅盆花和矮紫金牛種子表面有縱向紋路凸起，其中密鱗紫金牛和矮紫金牛種子紋路較為密集，硃砂根種子表面光滑有條紋，種皮呈淺棕色。因此，上述差異可作為5種紫金牛屬植物種子鑒別特征，有效避免了種子之間的混淆，對該屬植物的種植和成分研究都有著重要意義。

致謝：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所的李偉杰在種子采集和實(shí)驗(yàn)過程中給予幫助，特此謝意！