李珺瑩，聶振華，李雋，張俊，李蕓蕓，李悅，張理濤

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)免疫介導(dǎo)的慢性復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病[1]，中醫(yī)稱為“白疕”。其發(fā)病率逐年升高，病程遷延，一直是皮膚科研究的重點(diǎn)。目前中醫(yī)治療本病有較為公認(rèn)的證候分類標(biāo)準(zhǔn)。眾多中醫(yī)皮膚科先輩總結(jié)出“從血論治”尋常型銀屑病辨證論治經(jīng)驗(yàn)，其中血熱證、血瘀證、血燥證的證候分型方法得到廣泛認(rèn)可[2]，但證候的生物學(xué)基礎(chǔ)一直沒(méi)有完全闡明。已有研究表明miRNA可以作為多種疾病的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。本研究將miRNA引入銀屑病中醫(yī)證候研究，檢測(cè)不同中醫(yī)證型尋常型銀屑病患者血漿miR-146a、miR-155、miR-326的表達(dá)水平，以探尋和銀屑病證候相關(guān)的miRNA生物學(xué)標(biāo)志物，為銀屑病的早期診斷和中醫(yī)分型提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 尋常型銀屑病患者均來(lái)源于2019年2月—2019年8月天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院皮膚科住院患者，其中血熱證30例、血瘀證15例、血燥證15證。男44例，女16例。年齡22～65歲，平均47.4歲。病史2個(gè)月～36年，平均35.3個(gè)月。入組要求：1個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)中藥、維A酸類藥物、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等藥物，未進(jìn)行過(guò)光療治療；無(wú)腫瘤、免疫缺陷、心血管病、痛風(fēng)、自身免疫性疾病等系統(tǒng)性疾病。健康對(duì)照組30例，來(lái)源于本院健康管理中心體檢正常人群。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 尋常型銀屑病診斷參照《中國(guó)銀屑病診療指南》（2018簡(jiǎn)版）制定。皮疹為覆有銀白色鱗屑性斑（塊）丘疹，刮之有薄膜現(xiàn)象和Auspitz征陽(yáng)性。

1.1.3 中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn) 參照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》及《尋常型銀屑?。ò庄H）中醫(yī)藥循證臨床實(shí)踐指南（2013版）》中銀屑病血熱、血瘀及血燥證辨證標(biāo)準(zhǔn)。（1）血熱證：主癥：①皮損鮮紅；②新出皮疹不斷增多或迅速擴(kuò)大。次癥：①心煩易怒；②小便黃；③舌質(zhì)紅或絳；④脈弦滑或數(shù)。（2）血瘀證：主癥：①皮損暗紅；②皮損肥厚浸潤(rùn)，經(jīng)久不退。次癥：①肌膚甲錯(cuò)，面色黧黑或唇甲青紫；②女性月經(jīng)色暗，或夾有血塊；③舌質(zhì)紫暗或有瘀點(diǎn)、瘀斑；④脈澀或細(xì)緩。證候確定：具備全部主癥和1項(xiàng)以上次癥。（3）血燥證：主癥：①皮損淡紅；②鱗屑干燥。次癥：①口干咽燥；②舌質(zhì)淡，舌苔少或薄白；③脈細(xì)或細(xì)數(shù)。以上證候確定需具備全部主癥和1項(xiàng)以上次癥及由2名副主任醫(yī)師職稱以上醫(yī)生確定。

1.3 血漿miRNA檢測(cè)方法

1.3.1 總RNA提取 各組研究對(duì)象均在清晨空腹自肘靜脈以EDTA-k2抗凝管采集5 mL靜脈血，2 h內(nèi)離心（5 000轉(zhuǎn)/min，4℃，10 min）分離血漿，分裝于1.5 mL EP管于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。?yīng)用Trizol試劑（購(gòu)自美國(guó)Norgen公司）提取樣本血漿中的RNA，血漿miRNA提取根據(jù)miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒（DP503）操作指南進(jìn)行。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè) 采用HaiGene公司一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，基于Peter改良的miR-Q技術(shù)完成反轉(zhuǎn)錄程序（新?；駾1801試劑盒）。Real-time PCR采用25 μL反應(yīng)體系，SYBR Green PCR混合液為康為世紀(jì)產(chǎn)品，反應(yīng)體系為：12.5 μL SYBR Mix，1 μL cDNA，上下游引物各 1 μL，ddH2O 體積 9.5 μL，合計(jì) 25 μL。儀器為ABIStep-plus系統(tǒng)。

主要試劑和儀器：TRIzol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANScript RT kit）及2×TapPCRMasterMix購(gòu)于天根生化科技有限公司，PCR儀購(gòu)于ABI公司，引物由天津迪恩生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3.3 miRNA表達(dá)水平計(jì)算 以健康組作為對(duì)照，miRNA以U6作為內(nèi)參。miRNA表達(dá)Ct值（反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，其值越大，即表達(dá)量越低）：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt試驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，采用 2-ΔΔCt表達(dá)量法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0軟件，計(jì)量資料數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采取ANOVA檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采取χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Pearson分析血漿miRNA表達(dá)量與銀屑病皮損面積與嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 循環(huán)血漿miR-146a、miR-155在不同證型尋常型銀屑病患者中的表達(dá)水平均升高，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與健康對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。循環(huán)miR-326在尋常型銀屑病患者中的表達(dá)水平降低，與健康對(duì)照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表 1～3。

2.2 3種不同證型間比較，銀屑病血熱證較血瘀證和血燥證患者循環(huán)血漿miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)量顯著升高；血燥型銀屑病患者循環(huán)血漿miR-326的表達(dá)量明顯降低；組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表 1～3。

表1 各組血漿miR-146a表達(dá)水平比較 （±s）

表1 各組血漿miR-146a表達(dá)水平比較 （±s）

注：與健康對(duì)照組同項(xiàng)目比較，*P<0.05；與血熱型同項(xiàng)目比較，△P<0.05。

組別 n miR-146aCt 2-ΔΔCt PASI血熱證 30 28.88±1.14 58.49±11.70*△ 22.12±2.13血瘀證 15 30.65±0.55 17.39±1.21*△ 20.53±1.76血燥證 15 31.81±1.07 7.73±0.90*△ 8.36±1.34健康對(duì)照 30 34.76±1.82

表2 各組血漿miR-155表達(dá)水平比較 （±s）

表2 各組血漿miR-155表達(dá)水平比較 （±s）

注：與健康對(duì)照組同項(xiàng)目比較，*P<0.05；與血熱型同項(xiàng)目比較，△P<0.05。

組別 n miRNA-155Ct 2-ΔΔCt PASI評(píng)分血熱證 30 28.12±1.18 41.36±6.06*△ 22.12±2.13血瘀證 15 30.20±1.32 9.92±0.99*△ 20.53±1.76血燥證 15 31.93±1.34 3.01±0.31* 8.36±1.34健康對(duì)照 30 33.51±1.58

表3 各組血漿miR-326表達(dá)水平比較 （±s）

表3 各組血漿miR-326表達(dá)水平比較 （±s）

注：與健康對(duì)照組同項(xiàng)目比較，*P<0.05；與血熱型同項(xiàng)目比較，△P<0.05。

組別 n miRNA-326Ct 2-ΔΔCt血熱證 30 21.66±0.84 1.45±0.11血瘀證 15 22.99±0.52 3.66±0.23血燥證 15 23.86±0.80 6.68±0.68*△健康對(duì)照 30 21.12±0.41

3 討論

miRNA是一類長(zhǎng)度約22 nt的非編碼RNA，通過(guò)抑制特異性mRNA靶標(biāo)而介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA在進(jìn)化上有極高的保守性、時(shí)序性、組織特異性及穩(wěn)定性等特點(diǎn)。miRNA可以穩(wěn)定釋放到血液、體液循環(huán)中，即循環(huán)miRNA，其可介導(dǎo)全身細(xì)胞和組織之間的交流，其在血液體液中穩(wěn)定存在并易于獲取[3]。近年來(lái)，已有研究表明在腫瘤、心血管等多種疾病的血液及體液中可檢測(cè)不同表達(dá)水平的循環(huán)miRNA，使得循環(huán)miRNA有望成為疾病診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物[4]。目前已有報(bào)道多個(gè)miRNA在銀屑病皮損或外周血單核細(xì)胞中異常表達(dá)[5]，但血漿miRNA在銀屑病患者中的表達(dá)變化報(bào)道極少。

證候研究一直是中醫(yī)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。中醫(yī)對(duì)銀屑病有著獨(dú)特的見(jiàn)解和良好的療效，其中血熱證、血瘀證、血燥證的證候分型方法得到廣泛認(rèn)可，實(shí)踐證明是有效的，但證候的生物學(xué)基礎(chǔ)一直沒(méi)有完全闡明。證候是有其本質(zhì)的，辨證是有一定分子生物學(xué)基礎(chǔ)的，在基因組水平，特別是后基因組上可能存在結(jié)合點(diǎn)。基因表達(dá)的改變導(dǎo)致了病理變化，而證候則是某一階段病理變化表現(xiàn)于外的綜合描述。miRNA作為系統(tǒng)生物學(xué)中功能基因組學(xué)一部分，具有時(shí)序性、整體性等特點(diǎn)，與中醫(yī)證候?qū)W的整體觀念、恒動(dòng)觀不謀而合。由于miRNA及其調(diào)控紊亂在不同時(shí)空條件下的差異，使得不同的靶基因產(chǎn)生各自的異常蛋白，表現(xiàn)在宏觀層次則出現(xiàn)不同的癥狀和體征，即不同的證候?，F(xiàn)有研究證實(shí)，銀屑病的發(fā)生發(fā)展與miRNA表達(dá)異常引起相應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的紊亂密切相關(guān)，miRNA的表達(dá)水平和銀屑病臨床上表現(xiàn)的癥狀和體征存在密切的內(nèi)在聯(lián)系[6]。因此采用miRNA研究銀屑病中醫(yī)證候，其相關(guān)性可能更高。

目前研究表明，miR-146a在銀屑病皮損表皮和真皮以及外周血單核細(xì)胞中表達(dá)升高且特異性表達(dá)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞），并與細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-17密切相關(guān)。且miR-146a通過(guò)IRAK1，TRAF6，EGFR等靶點(diǎn)調(diào)控腫瘤壞死因子（TNF）通路和天然免疫反應(yīng)，對(duì)銀屑病的發(fā)生、發(fā)展起到調(diào)節(jié)作用[5]。miR-155已被證實(shí)在固有免疫和適應(yīng)性免疫過(guò)程中，包括各類T細(xì)胞分化、抗原提呈、炎癥介導(dǎo)、細(xì)胞因子產(chǎn)生等生物過(guò)程中有著重要作用。而且與Th17細(xì)胞關(guān)系尤為密切。研究表明銀屑病皮損中miR-155的表達(dá)上調(diào)，與細(xì)胞增殖等多種過(guò)程關(guān)系密切。miR-155通過(guò)靶向SOCS1和PTEN促進(jìn)了銀屑病皮膚炎性反應(yīng)的維持。此外研究發(fā)現(xiàn)miR-155在銀屑病皮損中表達(dá)增高，通過(guò)抑制其靶基因CTLA-4的表達(dá)可促進(jìn)新生血管的生成和介導(dǎo)炎性反應(yīng)而參與銀屑病的發(fā)病[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)血漿miR-146a、miR-155在不同證型尋常型銀屑病患者中的表達(dá)水平均升高，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這與以往研究二者在銀屑病皮損的表達(dá)情況一致，提示miR-146a、miR-155和銀屑病的發(fā)病及病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)；血漿循環(huán)miR-146a、miR-155可能是尋常型銀屑病的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，有望為銀屑病的早期診斷和病情判定提供新的靶點(diǎn)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)與其他證型相比，血熱型銀屑病患者血漿中miR-146a、miR-155的相對(duì)表達(dá)量有顯著性差異，尤其是miR-146a的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，提示其可作為銀屑病中醫(yī)辨證分型的潛在客觀指標(biāo)，有一定臨床意義。

近年來(lái)miR-326在自身免疫性疾病中的作用逐漸受到關(guān)注，其在多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中均有異常表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miR-326可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，從而參與多種免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，并與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Th17細(xì)胞也與銀屑病的發(fā)病密切相關(guān)，但miR-326與銀屑病的相關(guān)性極少有報(bào)道[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)血漿miR-326在尋常型銀屑病患者中的表達(dá)水平有降低趨勢(shì)，雖然與健康對(duì)照相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但miR-326在不同證型銀屑病間的相對(duì)表達(dá)水平還是有所差異，尤其在血燥型銀屑病中miR-326的相對(duì)表達(dá)量明顯減少，提示miR-326在銀屑病的發(fā)病尤其是病情的維持期發(fā)揮了一定作用，并可作為銀屑病臨床辨證分型的潛在客觀指標(biāo)。同時(shí)也提示筆者銀屑病的免疫發(fā)病機(jī)制及其復(fù)雜，在病情的進(jìn)展期和穩(wěn)定期可能存在不同的免疫通路和作用機(jī)制，值得筆者進(jìn)一步研究。