袁明

摘 ? ?要：為研究PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草修復(fù)砷污染土壤的作用，采用盆栽進(jìn)行試驗(yàn)，在砷濃度150 mg/kg的土壤中接種PGPR菌劑，再培養(yǎng)蜈蚣草。研究結(jié)果表明，接種PGPR菌劑后可以促進(jìn)蜈蚣草生長(zhǎng)，土壤中總砷含量減少，顯示PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草修復(fù)砷污染土壤具有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：蜈蚣草;PGPR菌劑;砷污染土壤;修復(fù)

文章編號(hào)：1005-2690（2021）23-0022-04 ? ? ? 中國(guó)圖書分類號(hào)：X53 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

PGPR是植物根際促生菌，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)及植物對(duì)礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，是能抑制有害微生物生長(zhǎng)的有益菌類。本研究采用蜈蚣草的盆栽試驗(yàn)，在蜈蚣草根際施用PGPR菌劑，探討各種PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草砷超富集能力的影響，得到蜈蚣草與PGPR菌劑共同作用下對(duì)砷污染土壤修復(fù)效率的理論依據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 盆栽試驗(yàn)

將長(zhǎng)勢(shì)相近的33株蜈蚣草種植于白色塑料花盆中，每個(gè)花盆中的土樣為2.2 kg，每日澆清水，前一個(gè)月每周澆灌一次植物營(yíng)養(yǎng)液，每盆20 mL。為保持溫度和濕度，在盆口包上一層保鮮膜。每個(gè)花盆中加入亞砷酸鈉，使土壤中砷含量為150 mg/kg。花盆編號(hào)1～11號(hào)，做3組平行試驗(yàn)。

1.2 ? 菌株接種

利用試驗(yàn)前期從蜈蚣草根部分離篩選獲得的具有抗病促生功能的耐砷內(nèi)生細(xì)菌作為PGPR菌劑[1]，包括芽孢桿菌、農(nóng)桿菌、假單胞菌3種類群共12株?；?2株菌株的抗病促生能力和拮抗特性進(jìn)行組合，形成PGPR菌劑（具體組合情況見表1），共10組，編號(hào)T1～T10。把菌株接種于無菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)72 h（活菌數(shù)≥1×108 cfu/mL）。采用澆灌的方式將T1～T10號(hào)PGPR菌劑接種于蜈蚣草根部。每一個(gè)月重復(fù)加一次菌懸液，總共澆灌4次。以不加菌劑為空白對(duì)照（CK）。

1.3 ? 植物收樣

蜈蚣草放入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)6個(gè)月后，將蜈蚣草從花盆中移出，沖洗干凈表面的土壤，移出時(shí)避免傷害根莖，然后分開保存根系和地上部[2]。

1.4 ? 植株生長(zhǎng)情況測(cè)定

①測(cè)定蜈蚣草株高：從露出土壤表面的地方測(cè)定每根莖的最高點(diǎn)。②測(cè)定蜈蚣草葉片總數(shù)。③測(cè)定莖粗。④測(cè)定鮮重、干重。測(cè)定完鮮重后將樣品在115 ℃殺菌0.5 h，然后75 ℃恒溫烘干后稱重。⑤將蜈蚣草地上部與根系分離，用LA-S植物圖像分析儀對(duì)根系進(jìn)行洗根分析，得到掃描分析后的根系數(shù)據(jù)與圖片。

1.5 ? 葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定

（1）酶液提取。稱取蜈蚣草葉片0.25 g放入研缽中，加入50 mmol/L、4 ℃、pH值8.2的磷酸緩沖溶液，在水浴鍋中研磨成漿，過濾后將濾液在4 000 r/min下離心20 min，取上清液為待測(cè)液。

（2）超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定方法。使用鄰苯三酚自氧化法。將50 mmol/L、pH值8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖溶液和50 mmol/L鄰苯三酚溶液放在恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)定25 ℃。待溫度保持穩(wěn)定后取3 mL Tris-HCl-EDTA緩沖溶液、5μL鄰苯三酚溶液加入試管中，搖勻后迅速放入比色皿中，在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定吸光度，波長(zhǎng)325 nm，每間隔30 s測(cè)定一次吸光度，記為A1，此為不加酶液的對(duì)照組。

重復(fù)上述操作，待Tris-HCl-EDTA緩沖溶液、鄰苯三酚溶液混勻后迅速加入5 μL待測(cè)液，同樣在波長(zhǎng)325 nm處每隔30 s測(cè)定一次吸光度，記為A2。

（3）計(jì)算抑制率S（%）和酶活力性U（U/g）。

式中：V為反應(yīng)液總體積（mL）;N為樣品稀釋倍數(shù)。

1.6 ? 葉片中過氧化物酶（POD）活性測(cè)定

（1）酶液提取。稱取0.2 g蜈蚣草葉片，然后加入20 mmol/L磷酸緩沖液5 mL，在研缽中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入試管中并以磷酸緩沖液定容到10 mL，以4 000 r/min離心10 min，取上清液為待測(cè)酶液。

（2）反應(yīng)混合液配制。取0.2 ?mol/L磷酸緩沖液（pH值6.0）200 mL加入0.076 mL愈創(chuàng)木酚攪拌溶解，冷卻后加入30%的H2O2 0.112 mL，混勻后保存于冰箱中備用。

（3）測(cè)定方法。取3 mL反應(yīng)混合液加入30 μL酶液，以0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH值6.0）為對(duì)照調(diào)零，而后測(cè)定OD470值（測(cè)定40 s），每30 s讀數(shù)一次。

（4）酶活性計(jì)算。以每分鐘OD值變化（升高）0.01為1個(gè)酶活性單位。計(jì)算酶活性U（U/g）。

式中：Vt為提取酶液總體積（mL）;Vs為測(cè)定時(shí)取用酶體積（mL）;W為樣品鮮重（g）;t為反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.7 ? 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)使用Excel 2010軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，利用SPSS 17.0計(jì)算Duncan單因素方差。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 蜈蚣草生物量參數(shù)

蜈蚣草生物量參數(shù)，株高、葉片數(shù)、莖粗、鮮重、干重見表2。

試驗(yàn)中，接種T1、T9、T10號(hào)組合PGPR菌劑的蜈蚣草與空白對(duì)照相比，蜈蚣草的植株高度、莖粗、干鮮重、葉片數(shù)都出現(xiàn)了一定程度的增加。接種T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號(hào)組合PGPR菌劑的蜈蚣草，上述生物量參數(shù)出現(xiàn)了一定程度的減少，蜈蚣草生長(zhǎng)受到了明顯抑制，株高、莖粗、鮮重、干重、葉片數(shù)都低于空白對(duì)照組。蜈蚣草接種不同PGPR菌劑的生長(zhǎng)情況見圖1。

2.2 ? 抗氧化酶系統(tǒng)

蜈蚣草超氧化物歧化酶與過氧化物酶的活性見表3。

2.3 ? 蜈蚣草洗根分析

蜈蚣草的洗根分析如圖2所示，分析數(shù)據(jù)如表4所示。對(duì)比空白對(duì)照組接種T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑的蜈蚣草根系的總根長(zhǎng)、根表面積、根平均直徑都有一定程度的增加，T1植株根系平均直徑增長(zhǎng)量最大。接種T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號(hào)組合PGPR菌劑的蜈蚣草根系總長(zhǎng)度、表面積、平均直徑都有一定程度的減少。

2.4 ? 土壤理化性質(zhì)分析

土壤理化性質(zhì)如表5所示。11組土壤都為酸性，對(duì)比空白對(duì)照組可知，施加PGPR菌劑會(huì)略微增加土壤的酸性。施加T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑還會(huì)增加土壤的有機(jī)質(zhì)、速效氮、有效磷、速效鉀含量。

由表5可知，土壤中的總砷含量有所降低，說明土壤中的砷部分轉(zhuǎn)移到蜈蚣草地上部。與空白對(duì)照組相比，添加T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑的土壤中砷含量更低，T1、T9、T10號(hào)蜈蚣草從土壤中吸收的砷更多，對(duì)土壤中砷的去除效率分別提高了36.36%、9.10%、18.18%。其中，T1號(hào)菌劑的效果最好，說明施加PGPR菌劑確實(shí)可以提高蜈蚣草對(duì)砷污染土壤的修復(fù)效果。

2.5 ? 土壤總砷含量與蜈蚣草各項(xiàng)生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

通過對(duì)土壤總砷含量和蜈蚣草各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，采用SPSS中的雙變量相關(guān)性分析方法，結(jié)果如表6所示。其中，蜈蚣草株高、葉片數(shù)、鮮重、干重、根平均直徑與土壤中總砷顯著負(fù)相關(guān)，即與蜈蚣草對(duì)砷的吸收量顯著正相關(guān)。

3 ? 討論

3.1 ? 接種不同PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草生長(zhǎng)情況的影響

對(duì)比不加菌劑的空白對(duì)照，添加T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑可以促進(jìn)蜈蚣草生長(zhǎng)，提高蜈蚣草的生物量，具體表現(xiàn)在蜈蚣草的株高、干鮮重、葉片數(shù)、莖粗都有明顯增加。這可能是因?yàn)樘砑覲GPR菌劑能夠緩解砷對(duì)蜈蚣草的毒性，使蜈蚣草在砷脅迫環(huán)境下也能正常生長(zhǎng)。添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號(hào)PGPR菌劑的蜈蚣草生長(zhǎng)受到抑制，上述各項(xiàng)生物量參數(shù)下降。

3.2 ? 接種不同PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草抗氧化酶活性的影響

添加T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑的蜈蚣草葉片的SOD、POD酶活性都比空白對(duì)照組高，添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號(hào)PGPR菌劑的蜈蚣草SOD酶和POD酶活性都比空白對(duì)照組低。SOD酶和POD酶是蜈蚣草體內(nèi)很重要的抗氧化酶。

研究表明，蜈蚣草在砷脅迫的環(huán)境下，會(huì)產(chǎn)生有毒害作用的自由基，而SOD酶可以清除有毒害的自由基，緩解砷對(duì)植物的毒害作用，POD酶能分解SOD酶作用產(chǎn)生的過氧化氫，消除過氧化氫對(duì)植物的氧化作用[3]。接種T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑能夠促進(jìn)蜈蚣草生長(zhǎng)，提高蜈蚣草生物量的原因可能是T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑提高了蜈蚣草的SOD、POD酶活性，緩解了砷脅迫環(huán)境對(duì)蜈蚣草的毒害作用，相反T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號(hào)蜈蚣草生長(zhǎng)受到抑制，可能是由于對(duì)應(yīng)的PGPR菌劑能會(huì)抑制SOD、POD酶活性。

3.3 ? 接種不同PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草根系形態(tài)的影響

對(duì)比空白對(duì)照組，添加T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑的蜈蚣草根系總根長(zhǎng)、根表面積、根平均直徑都有一定程度的增加，添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號(hào)PGPR菌劑的蜈蚣草根系總根長(zhǎng)、根表面積、根平均直徑都有所下降。本試驗(yàn)中添加的PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草根系的生長(zhǎng)特性有所改變，其中T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑提高了蜈蚣草根系長(zhǎng)度、表面積與直徑，增大了根系與土壤的接觸面積，有利于蜈蚣草從土壤中吸收砷。添加T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑能促進(jìn)蜈蚣草生長(zhǎng)、提高植株生物量，可能是因?yàn)镻GPR菌劑引起蜈蚣草根系形態(tài)改變，提高根系體積與活力，可以更好地吸收土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4]。

3.4 ? 蜈蚣草生長(zhǎng)情況與PGPR菌劑中的菌株組合方式的關(guān)系

添加T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑的蜈蚣草生長(zhǎng)情況優(yōu)于空白對(duì)照組，蜈蚣草的株高、干鮮重、葉片數(shù)、莖粗都有明顯增加，根系總根長(zhǎng)、根表面積、根平均直徑也有一定程度的增加。根據(jù)表1中菌株的組合方式發(fā)現(xiàn)，T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑中都有芽孢桿菌A，其余生長(zhǎng)受到抑制的蜈蚣草中都沒有接種含有芽孢桿菌A的PGPR菌劑。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌有抑制病原菌生長(zhǎng)、幫助植物提高免疫力、分泌植物激素的能力。因此，芽孢桿菌A對(duì)促進(jìn)蜈蚣草生長(zhǎng)、進(jìn)一步提高砷修復(fù)有潛在價(jià)值。

3.5 ? 接種不同PGPR菌劑對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

試驗(yàn)中11組土壤都呈酸性，添加PGPR菌劑會(huì)使土壤的pH值略微下降。研究表明，蜈蚣草對(duì)酸性環(huán)境有很高的耐受性，能夠在酸性很強(qiáng)的土壤中生長(zhǎng)，并且在酸性條件下對(duì)砷的吸收能力更強(qiáng)[5]。本試驗(yàn)中添加PGPR菌劑，對(duì)土壤pH值的改變不明顯，對(duì)蜈蚣草砷吸收能力沒有影響。

添加T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑會(huì)增加土壤中的有機(jī)質(zhì)、有效磷、速效氮、速效鉀含量。研究表明，微生物通過降解、合成等各種活動(dòng)可以提高土壤中的有機(jī)質(zhì)和各種營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)改變。

11組土壤中的砷濃度都有所降低，低于最初未種植蜈蚣草時(shí)的濃度（150 mg/kg）。添加T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑的土壤中砷濃度低于空白對(duì)照組，添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號(hào)PGPR菌劑的土壤中砷濃度高于空白對(duì)照組。這說明添加T1、T9、T10號(hào)菌劑的蜈蚣草砷吸收能力增強(qiáng)，對(duì)土壤砷修復(fù)效果增強(qiáng)，其中，T1號(hào)PGPR效果最好。這可能是因?yàn)樘砑覲GPR菌劑能夠促進(jìn)蜈蚣草生長(zhǎng)，提高了植株生物總量，而更大的生物量意味著相同環(huán)境能富集到更多的砷。T1、T9、T10號(hào)蜈蚣草根系總長(zhǎng)、根表面積、根平均直徑增加，能幫助蜈蚣草富集到更多砷。

4 ? 結(jié)論

通過試驗(yàn)可知，接種T1、T9、T10號(hào)PGPR菌劑對(duì)蜈蚣草地上部及根系的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，并能提高蜈蚣草修復(fù)土壤砷污染的效果，減少土壤中的總砷含量。本試驗(yàn)表明，PGPR菌劑在促進(jìn)蜈蚣草修復(fù)砷污染土壤方面具有潛在價(jià)值。

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