焦健王義春

(1.中國(guó)科學(xué)院科技戰(zhàn)略咨詢(xún)研究院，北京 100190；2.山東濱州陽(yáng)信縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濱州 256600)

引言

近年來(lái)，隨著生命科學(xué)領(lǐng)域研究的日益深入，長(zhǎng)度約為20～30個(gè)核苷酸(20～30nucleotide [nt])的非編碼小RNA(small noncoding RNA sRNA)分子被科研工作者發(fā)現(xiàn)。通過(guò)對(duì)sRNA特征和功能的研究，發(fā)現(xiàn)這些sRNA參與了生物體基因和基因組各個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控過(guò)程，其重要性不言而喻。根據(jù)sRNAs的起源、結(jié)構(gòu)特征、相關(guān)的效應(yīng)蛋白和生物學(xué)功能，可將sRNAs分為2個(gè)主要的類(lèi)別，即siRNAs(short interfering RNAs)和miRNAs(microRNAs)。這2類(lèi)sRNAs的發(fā)現(xiàn)，向人們揭示出，動(dòng)植物的基因組非編碼區(qū)亦蘊(yùn)含著極其重要的作用和功能。siRNA和miRNA參與調(diào)控了動(dòng)植物的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化、染色體的遷移、轉(zhuǎn)錄重編程、蛋白質(zhì)的翻譯以及RNA加工和穩(wěn)定性保持等重要的生物學(xué)過(guò)程。

1 sRNA的起源和合成機(jī)制

1.1 siRNA和miRNA的起源

miRNA最早是由Ambros及其同事，于1993年在研究控制線蟲(chóng)幼蟲(chóng)時(shí)序性發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)被命名為一個(gè)內(nèi)源調(diào)控基因lin-4[1]。5a后，Mello和Conte報(bào)道了有關(guān)外源雙鏈RNA分子(double-stranded RNA，dsRNA)通過(guò)RNA干涉(RNA interference，RNAi)的機(jī)制，可以導(dǎo)致基因的特異沉默[2]。1999年，Tomariand和Zamore證明了植物中的基因沉默機(jī)制是通過(guò)長(zhǎng)度約為20～25nt的siRNAs與靶標(biāo)基因的堿基互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)的[3]。隨后不久，研究證明dsRNA分子可以直接轉(zhuǎn)換為長(zhǎng)度約21～23nt的siRNAs；在多種動(dòng)植物物種中，miRNA介導(dǎo)的生物學(xué)作用被廣泛報(bào)道。至此人們認(rèn)識(shí)到：miRNA作為內(nèi)源基因的調(diào)控子，而siRNA則通過(guò)阻止外源核苷酸的干擾(如病毒的感染、轉(zhuǎn)座子的活動(dòng)和轉(zhuǎn)基因的影響)來(lái)保護(hù)生物基因組的完整性。

1.2 siRNA和miRNA的合成機(jī)制

sRNA的生物合成是在多種基因元件的精細(xì)調(diào)控下完成的。通過(guò)對(duì)其生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)了參與其中的許多主要組分，如，RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ)、Dicer蛋白酶家族、依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)、Argonaute蛋白、HEN1以及HST蛋白[4]。

siRNA和miRNA在生物合成機(jī)制中，存在以下3個(gè)不同點(diǎn)。miRNA是來(lái)源于生物體本身內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄物，并且是受時(shí)空調(diào)節(jié)、有目的性表達(dá)的；siRNA主要來(lái)自生物體外部，如外源病毒基因組和外來(lái)轉(zhuǎn)基因，只有少部分來(lái)自于內(nèi)源的轉(zhuǎn)座子基因。miRNA是從不完全互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體切割產(chǎn)生；siRNA則來(lái)自較長(zhǎng)的完全互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈RNA(double-stranded RNAs，dsRNAs)分子。成熟的siRNA分子主要以雙鏈形式存在，并且以堿基完全互補(bǔ)配對(duì)的方式與其靶標(biāo)基因結(jié)合；成熟的miRNA分子均為單鏈，與靶標(biāo)基因的結(jié)合也并不是完全互補(bǔ)的，存在1～3個(gè)堿基的錯(cuò)配。

盡管存在上述差異，但siRNA和miRNA由于在產(chǎn)物大小方面和以序列特異的沉默方式方面極其相似，預(yù)示著兩者的生物合成和作用機(jī)制存在必然聯(lián)系。已有研究證明，siRNA和miRNA在生物合成過(guò)程和作用機(jī)制中，均依賴(lài)于兩類(lèi)蛋白家族成員——Dicer酶和Argonaute蛋白。其中，Dicer酶負(fù)責(zé)siRNA和miRNA前體的剪切，最終形成成熟的sRNA分子；AGO蛋白(Argonaute protein)在這兩類(lèi)小RNA的沉默發(fā)生機(jī)制中，與siRNA和miRNA形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，即siRNA-RISC和miRNA-RISC，并發(fā)揮核心作用。因此，Dicer酶、AGO蛋白與長(zhǎng)度約為20～23nt的雙鏈sRNAs形成了RNA干涉機(jī)制中的核心結(jié)構(gòu)特征(圖1)[5]。

圖1 siRNA和miRNA相似的合成和干涉機(jī)制[5]

2 sRNA在作物中的生物學(xué)功能

2.1 siRNA在作物中的生物學(xué)功能研究簡(jiǎn)介

siRNA參與了農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫、非生物脅迫及代謝途徑等多種生物學(xué)過(guò)程，具有重要的生物學(xué)功能。在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)dsRNA以產(chǎn)生siRNA，可有效抑制PMMoV (Pepper mild mottle virus)的侵染，表明siRNA在提高植物抗病毒方面起重要作用[6]。siRNA還可以通過(guò)降解衛(wèi)星RNA(Satellite RNAs)或缺陷干涉RNA(Defective interfering RNAs)，顯著提高本生煙的抗性[7]。還有報(bào)道證實(shí)，煙草黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)可利用病毒衛(wèi)星RNA產(chǎn)生siRNA，能有效降解寄主煙草中與RNAi相關(guān)的基因元件，以防止被寄主RNAi機(jī)制干擾病毒自身的生長(zhǎng)發(fā)育[8]。此外，Wesley等利用RNAi載體轉(zhuǎn)化禾本科作物大麥，通過(guò)產(chǎn)生siRNA使新轉(zhuǎn)基因大麥品種對(duì)黃矮病毒產(chǎn)生持久抗性[9]。因此，通過(guò)siRNA介導(dǎo)的沉默技術(shù)結(jié)合其它育種技術(shù)，可為改良作物品種提供一種有效的技術(shù)方法。

2.2 miRNA在作物中的生物學(xué)功能研究簡(jiǎn)介

miRNA介導(dǎo)的基因沉默是農(nóng)作物體內(nèi)天然存在的一種防御體系，利用這一體系，可有效抵抗病毒、細(xì)菌或真菌病害的侵染。方榮祥研究報(bào)道，利用amiRNA靶向黃瓜花葉病毒(CMV)的沉默抑制因子2b，可以有效提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)CMV抗性[10]。另外，對(duì)大豆Glyma18g02680.1基因通過(guò)amiRNA沉默，導(dǎo)致了對(duì)大豆線蟲(chóng)病害抗性的明顯增強(qiáng)[11]。孫其信實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)普通小麥進(jìn)行白粉病接種處理或熱激處理，結(jié)合Solexa高通量測(cè)序，鑒定出了24個(gè)與小麥白粉病反應(yīng)相關(guān)及12個(gè)與熱激反應(yīng)相關(guān)的miRNA。而這些miRNA是否真正參與了小麥白粉病抗病過(guò)程及非生物熱激脅迫過(guò)程，仍需進(jìn)一步深入研究[12]。此外，通過(guò)利用高通量測(cè)序法，預(yù)測(cè)到了58個(gè)品質(zhì)較好的面包小麥miRNA和70個(gè)候選的普通小麥保守miRNA，其中23個(gè)通過(guò)比對(duì)得到互補(bǔ)配對(duì)的miRNA*序列，可以確定屬于小麥的天然miRNA。對(duì)于大麥miRNA的研究方法與小麥方面幾乎一樣，都是通過(guò)預(yù)測(cè)、高通量測(cè)序或深度測(cè)序再比對(duì)的方法，目前已經(jīng)得到175個(gè)大麥miRNA和234個(gè)小麥miRNA，有些是植物不同物種間相對(duì)保守的，而有些是麥類(lèi)作物或者單子葉植物特有的miRNA[13]。miRNA也同樣參與了農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)的過(guò)程。如，水稻中利用miRNA抑制不同基因的表達(dá)，如Phytoene desaturase(PDS Os03g08570)、Spotted leaf 11(Spl11 Os12g38210)和Elongated uppermost internode1/CYP714D (Eui1 Os05g40384)，導(dǎo)致了水稻葉片光漂白表型[14]。

3 VIGS技術(shù)及其在作物功能基因組學(xué)中的應(yīng)用

3.1 VIGS技術(shù)簡(jiǎn)介

由于農(nóng)作物突變體的收集獲得較難，基因沉默已經(jīng)成為一種有效的研究功能基因組學(xué)的反向遺傳學(xué)工具。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)作為一種PTGS現(xiàn)象，是作物基因組功能分析的重要技術(shù)手段。即在已改造、優(yōu)化的病毒載體中，插入適當(dāng)大小的目的基因cDNA片段，隨著病毒侵染寄主并在作物組織中大量繁殖后，病毒載體中的目的cDNA片段在作物體內(nèi)利用siRNA的生物合成途徑產(chǎn)生針對(duì)靶標(biāo)基因的多種siRNA，繼而通過(guò)siRNA干涉機(jī)制，降解靶標(biāo)基因的mRNA，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因轉(zhuǎn)錄水平的沉默或翻譯水平的抑制[15]。如圖2所示[16]，VIGS的基本過(guò)程包含病毒載體的構(gòu)建、寄主作物的病毒侵染、產(chǎn)生sRNA并啟動(dòng)對(duì)目標(biāo)基因的干涉機(jī)制。

圖2 VIGS的流程示意圖[16]

3.2 VIGS病毒載體在作物中的應(yīng)用

瞬時(shí)VIGS在實(shí)際應(yīng)用時(shí)需要高侵染效率、高表達(dá)、易操作且穩(wěn)定的病毒載體。經(jīng)過(guò)近年來(lái)相關(guān)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，研究者成功開(kāi)發(fā)出了多種病毒載體并相繼對(duì)其進(jìn)行了合理改造和優(yōu)化，形成了一系列可分別在單、雙子葉作物中應(yīng)用的VIGS病毒載體。如，大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)可在單子葉植物中有效實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因的沉默[14,15]。對(duì)于單子葉作物而言，基因功能抑制的研究手段不多且較困難，VIGS作為一種反向遺傳學(xué)的手段極大地促進(jìn)了單子葉作物功能基因組的研究，為麥類(lèi)、水稻和玉米等重要經(jīng)濟(jì)作物基因功能分析提供了有效的方法。再如，煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)、甘藍(lán)葉卷曲病毒(Cabbage leaf curl virus，CaLCuV)、馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)和衛(wèi)星病毒誘導(dǎo)的沉默系統(tǒng)(Satellite virus-induced silencing system，SVISS)等可在雙子葉植物(煙草、擬南芥和馬鈴薯等)中對(duì)目的基因?qū)崿F(xiàn)有效的抑制[17]。

因此，VIGS實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇操作簡(jiǎn)單、侵染性好、寄主發(fā)病癥狀輕以及病毒癥狀能在植株系統(tǒng)和各個(gè)組織中傳播的病毒載體。清華大學(xué)劉玉樂(lè)教授實(shí)驗(yàn)室于2010年，報(bào)道了一種改造后的甘藍(lán)葉卷曲病毒(CaLCuV)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式可以有效侵染本生煙植株。該CaLCuV載體不但可以攜帶目的基因的cDNA片段以引發(fā)siRNA介導(dǎo)的基因沉默，而且還可以通過(guò)擬南芥AtmiR319前體作為骨架，攜帶人工微小RNA(artificial microRNAs amiRNA)以引發(fā)miRNA介導(dǎo)的基因沉默。并且該系統(tǒng)還可以高表達(dá)內(nèi)源miRNA，內(nèi)源AtmiRNA156和AtmiRNA165高表達(dá)后，其相應(yīng)的靶標(biāo)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量明顯下調(diào)。該載體攜帶的amiRNA是由WMD3平臺(tái)設(shè)計(jì)并選擇的，以AtmiR319前體作為骨架，采用Overlap PCR的方法，用適當(dāng)?shù)腶miRNA∶amiRNA*替換內(nèi)源的miRNA∶miRNA*，并保持原有前體的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)本生煙八氫番茄紅素脫氫酶PDS基因的沉默，研究了siRNA和amiRNA所介導(dǎo)VIGS的異同及優(yōu)缺點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)amiRNA所介導(dǎo)VIGS沉默效果相當(dāng)于傳統(tǒng)的插入cDNA片段大于300bp所介導(dǎo)沉默的效果，證明CaLCuV∶amiRNA介導(dǎo)的基因沉默更加有效[17]?？梢?jiàn)，不論是傳統(tǒng)的表達(dá)cDNA片段的沉默方法，還是表達(dá)sRNA起到沉默效果，最終都在農(nóng)作物體內(nèi)表達(dá)出小分子RNA以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的沉默。

4 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前，農(nóng)作物改良和育種進(jìn)入后基因組時(shí)代，解讀、編輯與改造農(nóng)作物基因組顯得尤為重要。小分子RNA介導(dǎo)的干涉技術(shù)作為一種傳統(tǒng)的反向遺傳學(xué)技術(shù)，是農(nóng)作物基因組改造與基因功能研究必不可少的手段之一，并且相信可以與基因編輯技術(shù)、分子設(shè)計(jì)育種等新興技術(shù)一起，為改良農(nóng)作物品種、保持作物穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、保障糧食安全等諸多涉及國(guó)家戰(zhàn)略性的基礎(chǔ)領(lǐng)域和產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域，提供有力科技支撐。