馬瑞 何鑫

(寧夏回族自治區(qū)森林病蟲防治檢疫總站，寧夏 銀川 750001)

引言

SAM在生物體內(nèi)是重要的中間代謝物質(zhì)，參與多種生化反應(yīng)，在臨床上應(yīng)用十分廣泛，在藥用方面有很大的應(yīng)用前景，受到越來越多的生命科學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域人士的關(guān)注。

GSH是細胞內(nèi)非蛋白巰基的主要組成部分，在生物體內(nèi)具有維持適宜氧化還原環(huán)境、作為抗氧化劑保護酶和蛋白的硫氫基、防止自由基的氧化損傷等重要功能，使其在臨床、食品、體育運動等多個領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[1]。目前生物合成法即酶法和微生物發(fā)酵法較受研究者關(guān)注，而微生物發(fā)酵法因其發(fā)酵微生物(細菌或酵母)培養(yǎng)簡單，生產(chǎn)工藝和方法不斷改善，成為了目前工業(yè)化生產(chǎn)SAM和GSH的普遍方法[2]。

SAM和GSH均是含硫化合物代謝網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點物質(zhì)，具有共同的代謝途徑[3]。因此研究不同可控條件下的SAM和GSH聯(lián)合高產(chǎn)，具有重要的理論和生產(chǎn)價值。ATP的存在為SAM和GSH合成提供了能量，而ATP主要是由細胞呼吸作用產(chǎn)生的。因此可以通過改變發(fā)酵條件影響細胞的呼吸，進而影響細胞的能量代謝途徑，最終實現(xiàn)GSH和SAM的聯(lián)合高產(chǎn)。本文通過設(shè)置不同溶氧控制條件(15%、30%、45%、60%以及對照組恒轉(zhuǎn)速)探究不同溶氧條件對發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量影響，對比得出最佳溶氧控制條件。

1 材料與方法

菌種為C.utilis CCTCC M 209298,由蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院微生物工程實驗室篩選并保存。

1.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉10，pH6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖35，NH4SO410，KH2PO412.3，MgSO40.05，CaCl20.05，L-Met 4.6。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 一級種子培養(yǎng)

-70℃冷凍保藏的種子活化后接入準備好的一級種子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速200r·min-1，恒溫30℃培養(yǎng)24h。

1.2.2 二級種子培養(yǎng)

以10%(v/v)接種量將新鮮種子液接種入二級種子培養(yǎng)基中，恒溫30℃，200r·min-1搖床培養(yǎng)20h。

1.2.3 分批發(fā)酵培養(yǎng)

將新鮮二級種子液按10%接種量接入裝液量為3L的5L在位發(fā)酵罐中，控制溫度30℃，初始通氣量1vvm，pH5.0(在pH電極的檢測下，通過2mol·L-1的H2SO4和2mol·L-1的NaOH自動流加控制)，初始攪拌轉(zhuǎn)速350r·min-1。發(fā)酵過程中，當溶氧降低到一定值后，通過手動調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量來控制恒定發(fā)酵溶氧水平，培養(yǎng)時間30h。

1.3 取樣方法

取樣自發(fā)酵起始0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、27h、30h從發(fā)酵罐中吸取發(fā)酵液50mL至量筒中，吹打混勻后分裝至離心管中，10mL 3管，5mL 4管。低速離心機3500rpm離心10min后，收集2mL上清進行發(fā)酵液殘?zhí)菧y定，酵母泥放入-70℃冰箱保存。

1.4 分析方法

1.4.1 細胞干重(DCW)[4]

取10mL發(fā)酵罐培養(yǎng)液，3500rmp離心10min，蒸餾水洗滌3次后進行離心，收集菌體沉淀，70℃烘干至恒重后稱量。

1.4.2 殘?zhí)菨舛葴y定[5]

取轉(zhuǎn)化后的菌液離心，取10mL上清液，適當稀釋后取2mL，加入1.5mL DNS，沸水浴5～7min，再冷水浴冷卻至室溫，定容至25mL，520nm處測OD值，通過標準曲線對比得出殘?zhí)菨舛取?/p>

1.4.3 GSH測定[6]

離心所得酵母泥在-70℃冷凍過夜后，第2天用40%酒精25mL搖床30℃振蕩萃取2h后，3500r·min-1離心10min，取上清進行胞內(nèi)GSH測定。獲得的樣品胞內(nèi)稀釋25倍后采用DTNB-谷胱甘肽還原酶循環(huán)法進行定量測定。

在2mL體積的比色皿中按順序依次加入100μL DTNB，700μL NADPH和經(jīng)適當稀釋的樣品200μL(胞內(nèi)稀釋25倍，胞外稀釋100倍)。室溫下加入10μL谷胱甘肽還原酶啟動反應(yīng)，在412nm處測定反應(yīng)體系的初始OD值和反應(yīng)3min后的OD值。

1.4.4 SAM的提取和測定

10mL發(fā)酵液離心取細胞沉淀，向沉淀中加10mL 0.35M稀硫酸，4℃靜置萃取2h，3500r·min-1離心10min，上清液經(jīng)0.22μm膜過濾即得樣品(約需1mL)。得到的樣品采用HPLC法進行分析。色譜柱為反相SunFireC18柱(4.6nm×250nm)，流動相為0.5mol·L-1的甲酸銨(化學(xué)純，用甲酸溶液調(diào)pH至4.0)溶液，流速0.8mL·min-1，檢測波長254nm，柱溫25℃，檢測池溫度30℃，進樣量20μL[7]。

1.4.5 輔因子定量分析

離心得到的酵母泥，液氮處理1min后放入-70℃超低溫冰箱中保存。將濕細胞重新懸浮在5mL 0.2mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.0)中，超聲波破碎10min(功率22%，破碎10s，間隔10s)，離心后得到的上清液作為待測樣品，采用HPLC法檢測輔因子含量[8]。

1.5 酶活測定

1.5.1 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)酶活測定

微量定磷法，使用南京建成γ-GCS檢測試劑盒(A091-2)測定。

1.5.2 SAM合成酶酶活測定

發(fā)酵過程中SAM合成酶的酶活水平是通過測定體外酶促反應(yīng)液的SAM含量來監(jiān)控[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶氧控制條件對細胞生長和SAM、GSH產(chǎn)量影響

對于發(fā)酵，溶解氧既屬于營養(yǎng)因素，又屬于環(huán)境因素，特別是對于本次實驗SAM和GSH的生產(chǎn)代謝過程中，DO的改變會影響產(chǎn)朊假絲酵母呼吸鏈中的氧化還原，同時也會對酵母細胞的生長和SAM、GSH形成產(chǎn)生影響。由于在發(fā)酵的不同階段，細胞對溶氧的需求水平并不相同，恒定轉(zhuǎn)速的發(fā)酵很容易造成發(fā)酵過程中溶氧的不足或過剩，使得菌體發(fā)生厭氧代謝或氧中毒，對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響[10]。為此本實驗將設(shè)定恒定溶氧，研究恒溶氧對發(fā)酵過程的影響，探究菌體生長的最佳溶氧水平。

為了探究不同溶氧條件下對SAM和GSH產(chǎn)量代謝影響，本實驗將溶氧條件分別設(shè)定為15%恒溶氧、30%恒溶氧、45%恒溶氧、60%恒溶氧以及對照組恒轉(zhuǎn)速(不控溶氧)5個批次來分別對比細胞生長情況(見圖1)。由圖1可見，各溶氧控制條件細胞量均在15h達到最大值，此時葡萄糖基本耗盡；各溶氧條件下，細胞量水平相似，在發(fā)酵前15h內(nèi)，30%恒溶氧發(fā)酵的細胞量水平較高；此時細胞合成已經(jīng)停止，但因為一些中間代謝物質(zhì)的存在，目標產(chǎn)物SAM和GSH仍在繼續(xù)合成[2]。由圖2可見，對GSH和SAM合成有利的溶氧控制條件分別為30%恒溶氧和60%恒溶氧；在30%恒溶氧的控制條件下，GSH的積累量在18h達到了最大值376.6mg·L-1，與實驗對照組恒轉(zhuǎn)速相比提高了46%；在60%恒溶氧的控制條件下，SAM的積累量在30h時達到最大值243.8mg·L-1，與實驗對照組恒轉(zhuǎn)速條件相比提高了26%。

圖1 不同溶氧下細胞量和殘?zhí)橇?/p>

圖2 不同溶氧下SAM、GSH以及兩者聯(lián)合產(chǎn)量

進一步將SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)積累量作圖分析可以看出，綜合2種目標產(chǎn)物的聯(lián)產(chǎn)量，在30%恒溶氧控制的條件下產(chǎn)量最高，在27h達到最大值594mg·L-1，與實驗對照恒轉(zhuǎn)速組相比提高了38%。為了更加直觀地關(guān)注GSH、SAM發(fā)酵過程中的生產(chǎn)效率，本實驗將發(fā)酵過程中的各指標參數(shù)列于表1。從表中各指標參數(shù)綜合對比來看，30%恒溶氧的參數(shù)與各實驗組參數(shù)指標相對比，其各項發(fā)酵指標均較為理想。對于此實驗結(jié)果，以下將從GSH、SAM的發(fā)酵過程中的酶活角度來闡述和分析。

2.2 不同溶氧控制條件下GSH和SAM發(fā)酵過程分析

在上一節(jié)中，通過圖表直觀地了解到30%恒溶氧發(fā)酵條件下GSH和SAM的聯(lián)產(chǎn)量達到最高，與對照組相比提高了38%。在發(fā)酵過程中，與GSH、SAM合成緊密聯(lián)系的是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和SAM合成酶，其酶活程度直接決定了GSH和SAM的產(chǎn)量高低。從圖2可見18h后GSH幾乎不再合成，GSH胞內(nèi)含量逐漸下降，分析原因有2點：GSH合成速度逐漸慢于GSH降解速度，使得GSH胞內(nèi)含量逐漸趨于平緩甚至下降；培養(yǎng)基內(nèi)谷氨酸供給缺乏，谷氨酸是GSH合成必須的前體物質(zhì)。在對不同溶氧條件下γ-GCS酶活數(shù)據(jù)分析(圖3)，在15h時酶活達到最高。此時細胞的葡萄糖基本耗盡，酶活逐漸降低，GSH的積累量逐漸持平甚至降低。從圖3中可以看出，30%的恒溶氧條件下，γ-GCS的酶活明顯高于其它實驗組，由此可以得出30%恒溶氧條件的GSH產(chǎn)量高是由于γ-GCS的酶活最高。

表1 不同溶氧條件下GSH和SAM聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過程參數(shù)

與SAM合成密切相關(guān)的是SAM合成酶，在整個發(fā)酵過程當中60%恒溶氧發(fā)酵的胞內(nèi)含量高于其它溶氧控制條件的實驗組，與起始胞內(nèi)含量相比，SAM的胞內(nèi)提高了104%。綜合其它組的SAM合成規(guī)律發(fā)現(xiàn)細胞在15～18h之后合成速度明顯加快，SAM胞內(nèi)含量急速上升，這與SAM合成酶的聯(lián)系十分緊密。從圖3中可知15h后SAM合成酶的酶活由之前的下降趨勢逐漸開始上升，隨著其上升的趨勢，SAM在胞含量逐漸提高。這是由于15h之后，GSH基本不再合成，而SAM是GSH合成中的前體物質(zhì)，GSH不再合成，SAM的消耗量降低，由此得到了一定量的積累。在30%恒溶氧的發(fā)酵過程當中，γ-GCS酶活始終保持著明顯高于其它組的活性，其GSH合成十分旺盛，使得其相應(yīng)的SAM消耗也高于其它實驗組，因此在SAM合成產(chǎn)量方面并沒有優(yōu)于其它組。從圖3可見，30%恒溶氧18h后SAM合成十分旺盛，與起始SAM胞內(nèi)含量相比提高了300%。

圖3 不同溶氧條件下的γ-GCS、SAM合成酶活性

從γ-GCS和SAM合成酶角度可分析得出30%恒溶氧發(fā)酵的SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)量之所以高于其它實驗組，是由于其γ-GCS酶活明顯高于其它組別，并且SAM胞內(nèi)含量處于上升階段時SAM合成酶亦處于活躍階段，酶活程度的高低直接影響到目標產(chǎn)物產(chǎn)量高低。

3 結(jié)論

本實驗過程中，通過對實驗數(shù)據(jù)的分析得出由于15h葡萄糖基本耗盡，細胞在這時停止合成，最高生物量達到13.75g·L-1。

不同溶氧條件下，SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)量不同，30%恒溶氧最利于GSH合成，較對照組提高了46%，在18h達到376.4mg·L-1；60%恒溶氧最利于SAM合成，較對照組提高了26%，在30h達到243.8mg·L-1。綜合2者合成量進行對比，30%恒溶氧最利于SAM、GSH發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)，較對照組產(chǎn)量提高了38%，在27h達到594mg·L-1。

SAM、GSH合成關(guān)鍵酶酶活直接影響SAM、GSH產(chǎn)量，酶活高有利于SAM和GSH合成。對γ-GCS酶活數(shù)據(jù)分析，在15h時酶活達到最高，30%恒溶氧的γ-GCS酶活明顯高于其它實驗組，使得其GSH含量最高。SAM合成隨SAM合成酶的酶活升高而加速，并且由于18h后GSH合成逐漸減慢，SAM消耗減少，因此積累量增多。