程維舜，羅茜，洪娟，王素萍，黃翔，杜雷，姜利，張利紅，陳鋼

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與安全研究所，湖北武漢 430074）

西瓜（Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai）是葫蘆科西瓜屬重要的經(jīng)濟作物，原產(chǎn)于非洲南部[1-2]，瓜瓤脆嫩，味甜多汁，營養(yǎng)價值高，富含多種礦物質(zhì)和維生素，在全球范圍內(nèi)被廣泛種植。目前，我國每年西瓜種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位，據(jù)FAO 數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2018 年我國西瓜栽培面積149.91 萬hm2，總產(chǎn)量6 153.69 萬t[3]。西瓜產(chǎn)業(yè)在調(diào)整農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)、保持生產(chǎn)平穩(wěn)發(fā)展和促進農(nóng)民增收中發(fā)揮著重要作用[4]。

目前，我國西瓜制種完全實現(xiàn)雜種化，種子質(zhì)量的核心指標(biāo)就是雜交種的純度，純度鑒定對于保障良種銷售收益和種植收益來說尤為重要。傳統(tǒng)的西瓜雜交種純度鑒定方法是將雜交種種植后，通過比較成株的形態(tài)學(xué)特征進行鑒定[5]，這種方法周期長、工作量大、難度大，且易受環(huán)境、季節(jié)因素影響導(dǎo)致結(jié)果準(zhǔn)確性差，鑒定效果不理想。因此育種的專業(yè)性要求越來越強，而目前的田間表型鑒定愈發(fā)不適應(yīng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展需要。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是分子標(biāo)記的快速發(fā)展，分子標(biāo)記的應(yīng)用將加速雜交種純度的鑒定過程，而且鑒定過程不受環(huán)境和人為因素影響，甚至不需要特定的育種工作者。該技術(shù)不分時間，作物生長時期，多態(tài)性強，能在短時間內(nèi)準(zhǔn)確地反映出種子的真實性[6-7]。因此在品種鑒定及種子檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

武農(nóng)8 號是由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所培育的適合湖北省春季西瓜產(chǎn)區(qū)設(shè)施和露地種植的綜合抗病性強、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)雜交西瓜新品種（品種登記號為GPD 西瓜（2017）420128）。隨著西瓜栽培面積的逐年擴大，為保證雜交種的質(zhì)量，亟需開展雜交種純度的快速鑒定試驗。本研究采用熒光標(biāo)記SSR 技術(shù)，利用基于西瓜全基因組序列開發(fā)出來的能夠最大限度代表西瓜遺傳多樣性的23 對核心SSR 引物[8-9]，對西瓜新品種武農(nóng)8 號的雜交種進行引物篩選和純度鑒定，以期建立快速、準(zhǔn)確的雜交種純度的室內(nèi)檢測技術(shù)，為西瓜新品種的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支撐和保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

武農(nóng)8 號（F1）及其父本（W07-5）、母本（W07-3）種子均由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。武農(nóng)8 號系武漢市農(nóng)科院作物所雜交選育成的優(yōu)質(zhì)、早熟、小果型西瓜新品種。植株長勢強健，易坐果，耐裂，果實膨大快，單果質(zhì)量1.43～2.06 kg。果實橢圓形，果皮綠色，覆墨綠色齒條，厚度0.54 cm，蠟粉輕；果肉紅色，中心糖含量12.5%，邊糖含量10%，肉質(zhì)松脆細(xì)嫩，品質(zhì)佳。生育期95 d，果實發(fā)育期27～31 d，適合各地春播大中棚早熟覆蓋栽培。產(chǎn)量2 513 kg/667 m2左右，商品率高。

1.2 試驗方法

1.2.1 西瓜種子全基因組DNA 提取

選擇籽粒飽滿的武農(nóng)8 號及其親本種子各100 粒，55 ℃溫水浸種6 h，置于恒溫種子催芽箱中28 ℃催芽，出芽后播種于營養(yǎng)缽中，待植株具2 片真葉時，用改良CTAB 法提取葉片中的DNA。將幼嫩真葉組織30～40 mg置于2.0 mL 預(yù)冷過的離心管中，迅速撒上約0.5 mg 的DIECA 晶體，加入液氮，用組織搗碎儀打碎樣品成粉末狀，加入700 μL、2%CTAB 預(yù)熱緩沖液及0.5 mg 的活性炭，65 ℃水浴1 h，加入700 μL 氯仿-異戊醇混合液（24:1），混勻，12 000 r/min 離心10 min；吸取上清液加入預(yù)先裝有700 μL 異丙醇的1.5 mL 離心管中，混勻后放入-20℃冰箱30 min，12 000 r/min 離心10 min；棄上清液，用70%乙醇溶液洗滌兩遍，自然條件下干燥后，加入100 μL ddH2O 溶解DNA，用微量分光光度計檢測DNA 質(zhì)量，-20 ℃保存留用。

1.2.2 SSR 分子標(biāo)記的PCR 擴增與電泳檢測

選擇基于西瓜全基因組序列開發(fā)出來的能夠最大限度代表西瓜遺傳多樣性的23 對核心SSR 引物進行引物篩選和多態(tài)性分析，23 對熒光引物由武漢擎科生物科技有限公司合成（表1），其他分子生物學(xué)相關(guān)試劑均購自TAKARA。

PCR 擴增反應(yīng)體系及程序：在PCR 管中加入dNTP 0.25 mmol/L，正、反向引物各0.2 μmol/L，TaqDNA 聚合酶1.0 U，10×PCR 緩沖液（含Mg2+），武農(nóng)8 號及其親本基因組DNA 60 ng、滅菌雙蒸水補充到15 μL，利用DNA 分析儀檢測時使用熒光標(biāo)記的引物；混勻后置于PCR 儀上進行擴增。PCR 反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共34 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存待用。

PCR 擴增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳熒光檢測分析：將待用的6-FAM 和HEX 熒光標(biāo)記的PCR 擴增產(chǎn)物用超純水稀釋30 倍，TAMRA 和ROX 熒光標(biāo)記的PCR 擴增產(chǎn)物稀釋10 倍。分別將等體積的上述4 種稀釋后的溶液混合，從混合液中吸取1 μL 加入DNA 分析儀專用深孔板中。板中各孔分別加入0.1μLLIZ500 分子量內(nèi)標(biāo)和8.9 μL去離子甲酰胺。將樣品在PCR 儀上95 ℃變性5 min，取出立即置于碎冰上，冷卻10 min 以上。瞬時離心10 s 后置于DNA 分析儀上。使用DNA 分析儀的片段分析軟件，讀出每個樣品的等位變異大小數(shù)據(jù)。

1.2.3 SSR 分子標(biāo)記的純度鑒定

以父母本樣品DNA 的特異峰作為對照，只有同時具有親本特異峰的單株才可確定為武農(nóng)8 號雜交種，否則為雜種；種子純度按公式（1）計算。

表1 西瓜23 對SSR 核心引物Table 1 23 pairs of core primers in watermelon

1.2.4 田間形態(tài)鑒定

將取材后的西瓜植株按照編號順序定植，參照小果型西瓜栽培技術(shù)進行管理，在坐果期和幼果期，根據(jù)果實的果型、皮色和條帶特征逐株進行純度鑒定，將標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進行比較分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 武農(nóng)8 號SSR 特異性引物的篩選

將23 對引物在武農(nóng)8 號及其父母兩個親本間進行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)“雙親互補型”共顯性條帶的引物僅有1 對（見上頁圖1），即BVWS01897。BVWS01897 在F1擴出的條帶一條來自父本211bp，是一條來自母本242bp，為典型的“雙親互補型”條帶，且條帶較為清晰、無雜帶，該引物可用于武農(nóng)8 號雜交種的純度鑒定。

2.2 武農(nóng)8 號的SSR 純度鑒定

利用篩選出來的SSR 引物BVWS01897 對100 株武農(nóng)8 號西瓜植株進行純度鑒定，SSR-PCR 擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，99 個單株既具有母本特異峰也具有父本特異峰，是真正的雜交種，10 號單株不具有父本特異峰，有且僅有母本擴增特異峰，說明10 號單株為母本自交株（見圖2），武農(nóng)8 號雜交種的純度為99%。

2.3 田間形態(tài)觀察純度鑒定

坐果期、幼果期至果實成熟期田間調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母本W(wǎng)07-5 植株生長勢中等，早熟，極易坐果。全生育期87 d，果實發(fā)育期27 d，高圓形，果皮綠色覆窄齒條帶，果肉紅色，瓤質(zhì)細(xì)脆，纖維少，中心糖含量12%，果皮韌，皮厚0.5 cm 左右，單瓜質(zhì)量1.0～1.5 kg。父本W(wǎng)07-3 植株生長勢強，分枝力較強，早熟，易坐果，全生育期89 d，果實發(fā)育期28 d，長橢圓形，果皮綠色覆齒條，果肉淺紅色，瓤質(zhì)細(xì)脆，中心可溶性固形物13%，皮厚約0.4 cm，單果質(zhì)量1.5～2.0 kg。武農(nóng)8 號植株生長勢較強，主蔓長3.8 m，主莖粗0.4～0.5 cm。葉片羽裂狀，葉色綠。主蔓第一雌花著生節(jié)位第7～9 節(jié)，以后每隔4～6 節(jié)著生一朵雌花，花為雌雄同株異花。坐果能力強，果實發(fā)育天數(shù)27～31 d，果形指數(shù)1.29，果皮綠色覆齒條，外觀亮麗。皮厚0.54 cm，果皮硬度達(dá)47.10 kg/cm2，不易裂果，不易倒瓤。果肉紅色，肉質(zhì)細(xì)、脆多汁，口感極佳，中心含糖量約12.5%，邊糖含量約10%，單果質(zhì)量1.43～2.06 kg。10 號植株與果實植物學(xué)形態(tài)與母本性狀完全一致，其余植株果實與武農(nóng)8 號典型特征吻合，短橢圓形，淺綠果皮覆蓋深綠細(xì)齒條帶，條帶數(shù)11～14 之間。田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果高度一致。

3 討論

在西瓜雜交制種的過程中，母本和父本分別種植在不同區(qū)域，雌花開花前，母本需要人工去雄，開花期再授以父本花粉來完成雜交過程，從而產(chǎn)生雜交種。如果母本去雄不徹底或漏去雄，花粉就可能落到雌花柱頭上產(chǎn)生自交種，極大地影響制種純度。因此，西瓜雜交種必需進行種子純度鑒定。首先，傳統(tǒng)的大田形態(tài)學(xué)鑒定方法成本高、耗時久等諸多缺陷嚴(yán)重制約了西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展；其次，由于西瓜遺傳基礎(chǔ)較窄，蛋白質(zhì)種類和同工酶位點都有限，很難區(qū)分親緣關(guān)系很近的雜交種；第三，初代的RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)本身的重復(fù)性、穩(wěn)定性不高，引物的多態(tài)性較低。因此，傳統(tǒng)的大田形態(tài)學(xué)鑒定方法很難應(yīng)用到西瓜雜交種純度鑒定中[10]。基于PCR 技術(shù)的SSR 分子標(biāo)記是第二代分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、共顯性遺傳等特點，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物品種鑒定[11]。由于常規(guī)的SSR 標(biāo)記聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法需要在每塊膠上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)帶型對照[12]，才能確定待檢樣品在泳道上的位置，但當(dāng)待檢樣品在凝膠泳道上的位置與標(biāo)準(zhǔn)帶型對照較遠(yuǎn)，且標(biāo)準(zhǔn)帶型對照上相鄰等位基因片段差異較小時，待檢樣品的等位基因類型就難以確定，那么對檢測結(jié)果就有影響。而SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測方法，依據(jù)待檢樣品目標(biāo)峰的位置，與同一毛細(xì)管泳道的內(nèi)標(biāo)LIZ 比較，直接讀出目標(biāo)DNA 片段的準(zhǔn)確大小，無需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)帶型對照。顯然與常規(guī)的凝膠電泳檢測方法相比，熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。因此，筆者篩選的SSR 引物BVWS01897，能特異鑒定武農(nóng)8 號及其親本，本研究通過對23 對西瓜SSR 核心引物的篩選，發(fā)現(xiàn)1 對引物在武農(nóng)8 號及其親本間具有多態(tài)性，特異引物對武農(nóng)8 號進行純度鑒定的結(jié)果與大田鑒定結(jié)果高度一致，充分說明SSR 技術(shù)室內(nèi)快速鑒定西瓜品種純度是可行的。