鄭永勝，王麗媛，段麗麗，王暉，王穆穆，李華，王瑋，耿慧晶，張晗，李汝玉

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東濟(jì)南 250100）

小麥（Triticum aestivum L.）是一種適應(yīng)性強(qiáng)且分布廣泛的世界性重要糧食作物，在植物學(xué)分類上屬于禾本科（Poaceae）小麥族（Triticeae）小麥屬（Triticum）。小麥?zhǔn)俏覈蠹Z食作物之一，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，其產(chǎn)量水平對國家糧食生產(chǎn)至關(guān)重要。然而，由于育種過程中選用的親本來源較為單一，近年來小麥育成品種的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性均受到一定程度限制，種質(zhì)改良進(jìn)展緩慢［1，2］。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）是以1～6個核苷酸為重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列，是以PCR擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記。SSR標(biāo)記多數(shù)是共顯性標(biāo)記，符合孟德爾遺傳定律，可以有效地區(qū)分雜合或純合基因型，同時具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳多樣性檢測等方面廣泛應(yīng)用［3，4］。SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析，在水稻［5］、高粱［6］、甘薯［7］、大白菜［8］、菜豆［9］等作物中均有相關(guān)報道。小麥中，于明寨等［3］選用64對SSR引物對73個冬小麥親本材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明本地育成品種遺傳背景相似度較高；鄭軍等［10］通過SSR標(biāo)記對山西省162份小麥品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)2000—2005年審定品種的遺傳多樣性最高；張彥軍等［11］利用150個SSR引物分析43份不同來源的和尚頭小麥種質(zhì)材料，將其劃分為8個組群，認(rèn)為這些種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。本研究利用37對SSR引物對2012—2017年進(jìn)行新品種保護(hù)的350份小麥種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在從分子水平上為小麥品種選育、種質(zhì)創(chuàng)新和品種鑒定提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的350份小麥種質(zhì)材料為2012—2017年間進(jìn)行新品種保護(hù)的小麥品種，多來源于黃淮地區(qū)（表1）。

1.2 基因組DNA提取

取幼嫩葉片0.2 g，放入1.5 mL離心管中，在液氮中研碎。將DNA提取液預(yù)熱到65℃，向每管中加入400μL，混勻；將離心管置于65℃金屬浴或水浴鍋中保溫30 min后取出；向離心管中加入氯仿-異戊醇（體積比為24∶1）400μL，振蕩混勻，10 000×g離心10 min；將上清液200μL轉(zhuǎn)入另一只1.5 mL離心管，加入-20℃預(yù)冷無水乙醇400μL沉淀DNA，再10 000×g離心1 min，棄上清，加入乙醇-乙酸銨溶液500μL，6 000×g離心5 min收集沉淀。加入TE溶液（pH 8.0）100 μL溶解DNA，通過Nanodrop 2000分光光度計(jì)測定濃度與OD260／OD280值，檢測DNA純度；用1%瓊脂糖凝膠電泳評估DNA完整性，-20℃保存。

表1 供試的350份小麥種質(zhì)資源

表1 （續(xù)）

1.3 SSR引物合成與梯度PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)所使用的SSR引物根據(jù)課題組前期篩選結(jié)果［12］，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步篩選，并從中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、可重復(fù)、多態(tài)性好且均勻分布于小麥21對染色體上的37對引物用于本研究。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本研究所用PCR反應(yīng)體系及梯度PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序參考段麗麗等［8］的試驗(yàn)方法。

1.4 熒光毛細(xì)管電泳檢測

在37對引物的5′端加入6-FAM（藍(lán)色）、HEX（綠色）、TAMRA（黑色）和 ROX（紅色）中的一種熒光標(biāo)記，6-FAM和HEX熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分別稀釋30倍，TAMRA和ROX熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分別稀釋10倍，然后分別取等體積的上述4種稀釋液進(jìn)行混合，隨后使用ABI 3730 XL型DNA分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用 GeneMapper軟 件 （https：／／www.thermofisher.com／）對毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果進(jìn)行圖像分析和數(shù)據(jù)采集，無效等位變異記錄為0／0。利用PowerMarker V3.25［13］軟件分析每對引物擴(kuò)增條帶結(jié)果，計(jì)算每對引物的等位基因數(shù)（number of alleles，A）、主要等位基因頻率（major allele frquency，M）、基因多樣性指數(shù)（gene diversity index，GDI）和多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，PIC），計(jì)算 Nei氏遺傳距離；采用鄰近法（neighbor joining，NJ）進(jìn)行遺傳聚類分析，繪制聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析

利用37對SSR引物對350份小麥種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測到288個等位基因變異。由表2可以看出，每對SSR引物檢測的等位基因數(shù)差異較大，變異范圍為2～14個，平均每對引物檢測到7.784個等位基因，其中有10對引物擴(kuò)增出10個及以上的等位基因。37對引物的主要等位基因頻率相差較大，引物xgwm445的主要等位基因頻率最大，為0.849；引物barc4的主要等位基因頻率最小，為0.309；所有引物的主要等位基因頻率平均值為0.481。37對SSR引物的基因多樣性指數(shù)分布范圍為0.268～0.807，平均值為0.653，引物cfd76的最大，xgwm445的最小。多態(tài)性信息含量（PIC）是用來衡量遺傳標(biāo)記座位多態(tài)性信息量的指標(biāo)，37對 SSR位點(diǎn)的平均 PIC值為0.608，變幅為0.250～0.785，引物cfd76的最高，xgwm445的最低。綜上所述，供試350份小麥種質(zhì)材料的遺傳多樣性較高。

表2 37對SSR引物的多態(tài)性信息

2.2 350份小麥種質(zhì)的遺傳距離分析

遺傳距離指不同的種群或種之間基因差異的程度，是用來衡量物種之間或同一物種不同群體之間遺傳分化的指標(biāo)。本研究中350份小麥種質(zhì)間的Nei氏遺傳距離在0～0.957之間，平均值為0.649，表明多數(shù)小麥種質(zhì)間遺傳差異較大，親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。在350份小麥種質(zhì)兩兩間遺傳距離比較中發(fā)現(xiàn)，‘輪選526’與‘鄭麥369’間遺傳距離最大（0.957），兩者間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；有6組品種間遺傳距離為0，遺傳相似度最高，這6組材料分別是‘百農(nóng)矮抗58’與‘冀麥38’、‘濟(jì)麥19’與‘中麥13’、‘九麥2號’與‘雙麥998’和‘周麥16’、‘輪選496’與‘輪選 987’和‘前 A182’、‘豫麥49’與‘豫麥49-198系’、‘鄭優(yōu)6號’與‘周麥22號’。查詢這些材料的遺傳來源發(fā)現(xiàn)多為共同親本或相近親本材料選育而來，目前所選的37對分子標(biāo)記不足以明顯區(qū)分開這些材料，需要繼續(xù)挖掘代表性標(biāo)記。

2.3 350份小麥品種的系統(tǒng)聚類分析

使用 PowerMarker V3.25軟件，根據(jù)37對SSR引物所檢測的288個等位變異位點(diǎn)數(shù)據(jù)計(jì)算得到Nei氏遺傳距離，采用NJ方法進(jìn)行聚類。參試的350份小麥種質(zhì)可分為4大類群，第Ⅰ類（紅色分支）包括33份種質(zhì)，第Ⅱ類（藍(lán)色）包括83份種質(zhì)，第Ⅲ類（綠色）包括76份種質(zhì)，第Ⅳ類（紫色）包括158份種質(zhì)（圖1）。

根據(jù)遺傳背景來看，親緣關(guān)系相同或相近的材料遺傳相似系數(shù)較高，在聚類圖中也明顯聚在一起。如第Ⅰ類群中，‘冀麥585’和‘冀麥518’最先聚在一起，它們均由太谷核不育群體選育而來；‘石新828’和‘石新633’聚在一起，它們均由‘石新733’與其他材料雜交選育而來。第Ⅱ類群的品種多以矮敗小麥輪選群體材料為親本進(jìn)行有性雜交選育而成，如共同親本‘輪選987’‘輪選496’‘輪選9873’等。第Ⅳ類群的品種多是由‘矮抗58’‘周麥16’等親本衍生而來，如‘鄭品麥8號’‘周麥32號’‘豐德存麥1號’‘冀麥38’‘錦繡21’‘洛麥28’‘棗鄉(xiāng)158’‘洛麥31’‘開麥22’‘周麥33號’等16個材料與‘矮抗58’聚為一支。

圖1 基于SSR標(biāo)記的350份小麥種質(zhì)材料聚類結(jié)果

3 討論與結(jié)論

種質(zhì)資源是育種工作的基礎(chǔ)，而遺傳多樣性又是種質(zhì)資源創(chuàng)新和改良的基礎(chǔ)，也是種質(zhì)資源研究的主流［14］。研究小麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可為小麥品種選育、種質(zhì)創(chuàng)新和品種鑒定提供理論依據(jù)，對于促進(jìn)小麥育種水平的提高具有重要意義［2］?；蚨鄻有灾笖?shù)和多態(tài)性信息含量是用來衡量種群遺傳多樣性的指標(biāo)，多態(tài)性信息含量（PIC）超過0.5時，遺傳位點(diǎn)多態(tài)性較高；低于0.25時，則遺傳位點(diǎn)多態(tài)性程度較低。本研究所有SSR位點(diǎn)的PIC平均值達(dá)0.608，其中有31對引物的PIC大于0.500，占所有引物的83.8%；同時本研究中34對（91.89%）引物的基因多樣性指數(shù)大于0.500。遺傳距離是另一個用來衡量物種或群體之間遺傳分化的指標(biāo)，本研究350份小麥種質(zhì)間的Nei氏遺傳距離平均值為0.649，這與侯丞志等［15］的研究結(jié)果相似，但與其他研究結(jié)果相比相對較高［3，16-20］。綜上所述，37對 SSR引物在350份小麥種質(zhì)中的多態(tài)性位點(diǎn)具有很大的變化幅度，且多態(tài)性較高的位點(diǎn)較多；350份試驗(yàn)材料的遺傳變異豐富，具有豐富的遺傳多樣性。

聚類分析是研究不同種質(zhì)資源間遺傳差異的重要方法，可以為雜交育種過程中的親本選配提供參考［21］。本研究中不同來源的350份小麥種質(zhì)聚為4大類，有共同親本或由同一育種單位育成的品種親緣關(guān)系較近，通常聚為一類；但也有一些具有相同的一個或多個親本材料的種質(zhì)材料分散在不同的類群，可能原因是雜交選育的子代品種僅繼承了單一親本的遺傳信息。綜合比較350份小麥種質(zhì)的系譜發(fā)現(xiàn)，這些材料的親本來源信息多集中于幾個骨干親本，如太谷核不育群體、‘輪選987’‘矮抗58’‘周麥16’等。在今后的小麥育種中，應(yīng)選用遺傳背景差異大、遺傳基礎(chǔ)寬的親本，有利于優(yōu)異性狀的聚合，促進(jìn)種質(zhì)創(chuàng)新，豐富小麥品種的遺傳多樣性［19，22］。