林 霄，孫國平，章 菊,2，劉加濤

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，晚期肝癌病死率位列第三，5年生存率僅為14%[1]。內(nèi)科治療是肝癌患者的主要選擇，但治療效果并不理想。近年來中藥天然產(chǎn)物因其溫和的副作用和優(yōu)良的治療效果受到許多關(guān)注[2]，研究[3-4]表明槐耳清膏在乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中均能起到有效的抗腫瘤作用。此外，無論是單獨使用還是聯(lián)合用藥，槐耳清膏都表現(xiàn)出較低的細胞毒性[5]。許多藥物在治療腫瘤的同時能夠引發(fā)腫瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，而ERS是導致惡性腫瘤耐藥的主要原因[6]，但槐耳清膏能否誘導肝癌細胞產(chǎn)生ERS尚不明確。該文首先探討槐耳清膏在治療肝癌的同時能否引發(fā)肝癌細胞ERS，再與ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)聯(lián)合使用，探究抑制ERS能否增強槐耳清膏的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源肝癌細胞株Hep3B和HepG2購自中國科學院細胞庫。細胞系經(jīng)STR鑒定，用qPCR分析細胞內(nèi)無支原體。以高糖DMEM(美國Hyclone公司)加入10%胎牛血清(澳大利亞Clark公司)和青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 mg/ml)配置成細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2加濕的培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑槐耳清膏(啟東蓋天利醫(yī)藥有限公司)用DMEM充分溶解，稀釋成10 mg/ml，用0.22 μm濾膜過濾2次，保存在-80 ℃冰箱中。MTT檢測試劑盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物科技公司)，4-PBA(P21005，美國Sigma公司)，PMSF蛋白酶抑制劑、RIPA細胞裂解緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)公司)，Bax(ab32503)、CHOP(ab11119)和GRP78(ab21685)一抗(英國Abcam公司)，PERK(BS2156)和Bcl-2(BS3171)一抗(美國Bioworld Technology Inc公司)，IRE1(#3294)一抗(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.3 MTT法測定細胞活力肝癌細胞(5 000個/孔)接種在96孔板中培養(yǎng)過夜，與不同濃度(0、2、4、6、8 mg/ml)的槐耳清膏共同孵育。培養(yǎng)24 h后，每孔中加入20 μl MTT，孵育4 h，然后加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解甲醛晶體，水平搖床低速震蕩10 min。用酶標儀在490 nm處測定吸光度(optical density,OD)值。根據(jù)公式計算細胞生長抑制率：抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%，槐耳清膏濃度為橫坐標，肝癌細胞活性為縱坐標，繪制抑制曲線圖，并計算槐耳清膏對2種肝癌細胞的IC50值。

1.4 Western blot將一組細胞單獨使用槐耳清膏進行處理，另一組使用槐耳清膏與4-PBA聯(lián)合用藥，2組均處理24 h后消化收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，再用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖液在冰上裂解細胞30 min。將裂解液離心，收集上清液。加4×loading buffer，沸水煮10 min。用SDS-PAGE凝膠提取蛋白，轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。再用5%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)在室溫封閉1 h，4 ℃水平搖床與特異性一抗(1 ∶1 000)孵育過夜。隔日在室溫下用二抗(1 ∶4 000)孵育1 h，用Image QuantTmlAS-4000Mini Imager檢測實驗結(jié)果，并用Scion圖像軟件(4.0.3.2版)進行量化。

1.5 流式細胞術(shù)分析將一組細胞單獨使用槐耳清膏進行處理，另一組使用槐耳清膏與4-PBA聯(lián)合用藥。處理24 h后用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)對細胞進行消化。用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒按照說明檢測細胞凋亡情況。用400 μl的Annexin V binding buffer重懸細胞，每管加入5 μl Annexin-V-FITC染色15 min，然后加入10 μl PI孵育5 min，上機檢測。所有過程均避光操作。

2 結(jié)果

2.1 槐耳清膏濃度與肝癌細胞活力的關(guān)系為測定槐耳清膏對肝癌細胞活力的影響，采用不同劑量的槐耳清膏(0、2、4、6、8 mg/ml)與肝癌細胞株Hep3B和HepG2共培養(yǎng)24 h，采用MTT法檢測細胞活力變化。與對照組相比，槐耳清膏能夠抑制肝癌細胞活力(P<0.05)，Hep3B和HepG2細胞活力與槐耳清膏濃度呈劑量依賴性下降(圖1)。

圖1 MTT法測定肝癌細胞活力

2.2 槐耳清膏介導肝癌細胞凋亡的能力為了探討槐耳清膏對肝癌細胞凋亡的影響，用AnnexinV-FITC/PI試劑盒進行了流式分析。結(jié)果顯示槐耳清膏濃度為0、4、8 mg/ml時Hep3B細胞及HepG2細胞凋亡率明顯升高，表明肝癌細胞凋亡率與槐耳清膏濃度呈正相關(guān)(圖2A、B、C)。為了探究槐耳清膏誘導肝癌細胞凋亡的機制，使用Western blot檢測細胞中Bax和Bcl-2的表達變化。如圖2D、E、F所示，槐耳清膏可以下調(diào)肝癌細胞中Bcl-2的表達而上調(diào)Bax的表達，與對照組相比，Bcl-2/Bax下降(P<0.05)，促進肝癌細胞凋亡。

2.3 槐耳清膏誘導肝癌細胞發(fā)生ERS的能力槐耳清膏處理后的肝癌細胞內(nèi)ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK和IRE1的表達與對照組相比明顯上調(diào)(P<0.05)(圖3)。結(jié)果表明槐耳清膏可以誘導肝癌細胞株Hep3B和HepG2產(chǎn)生ERS。

2.4 4-PBA抑制槐耳清膏誘導的肝癌細胞ERS用4-PBA(500 μmol/L)處理細胞12 h，將細胞與槐耳清膏(8 mg/ml)共培養(yǎng)24 h，通過Western blot檢測細胞內(nèi)ERS相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果表明槐耳清膏聯(lián)合4-PBA與單獨使用槐耳清膏相比，肝癌細胞中IRE1和PERK的表達減少(P<0.05)(圖4)，4-PBA可抑制槐耳清膏誘導的肝癌細胞ERS。

2.5 抑制肝癌細胞ERS對槐耳清膏的抗腫瘤作用的影響為了驗證槐耳清膏誘導的肝癌細胞ERS是否會影響肝癌細胞凋亡，用4-PBA(500 μmol/L)處理肝癌細胞12 h，再將細胞與槐耳清膏(8 mg/ml)共培養(yǎng)24 h，用AnnexinV-FITC/PI試劑盒和Western blot進行檢測。4-PBA聯(lián)合槐耳清膏組與單獨使用槐耳清膏相比肝癌細胞凋亡率明顯上升(P<0.05)(圖5A、B、C)。再用MTT法檢測肝癌細胞活力，結(jié)果為4-PBA聯(lián)合槐耳清膏與單獨使用槐耳清膏相比肝癌細胞的活力明顯下降(P<0.05)(圖5D)。說明槐耳清膏誘導的肝癌細胞ERS能夠抑制細胞凋亡，而聯(lián)合4-PBA能抑制細胞ERS的發(fā)生，使肝癌細胞活力下降、凋亡率上升。

用Western blot檢測了肝癌細胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白的表達情況。結(jié)果表明，與單獨使用槐耳清膏相比，4-PBA聯(lián)合槐耳清膏能更有效地降低肝癌細胞中Bcl-2蛋白水平而上調(diào)Bax蛋白的表達，使Bcl-2/Bax下降(P<0.05)(圖5E、F、G)，促進肝癌細胞凋亡。

3 討論

低氧、營養(yǎng)缺乏、氧化應激和許多其他刺激都能導致錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)中聚集，從而誘發(fā)細胞產(chǎn)生ERS。為了提高蛋白質(zhì)的折疊能力，ER將啟動一系列的適應過程，此過程被稱為未折疊的蛋白質(zhì)反應(unfolded protein response，UPR)[7]。許多研究[8]表明ERS不僅能夠促進腫瘤轉(zhuǎn)移，還與癌癥的其他進程密切相關(guān)[8]。本研究中，產(chǎn)生ERS的肝癌細胞與ERS被抑制的肝癌細胞相比，細胞活力更強，細胞凋亡減少。

越來越多的研究表明，抗癌藥物在殺傷腫瘤的同時可誘導腫瘤細胞發(fā)生ERS。如紫杉醇、阿霉素和西妥昔單抗[9]均能有效地誘導ERS的發(fā)生，激活UPR。持續(xù)的UPR信號能夠促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和對化療耐藥[4]。然而在一些腫瘤中，持續(xù)和嚴重的ERS可以導致細胞發(fā)生免疫原性死亡[10]，例如硼替佐米能夠誘導慢性ERS并使塞來昔布殺死致敏的膠質(zhì)母細胞瘤細胞[11]。但關(guān)于槐耳清膏能否誘導肝癌細胞ERS的研究很少。本研究顯示經(jīng)槐耳清膏處理后的肝癌細胞中ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK和IRE1的表達增加，說明槐耳清膏可以誘發(fā)肝癌細胞ERS。

圖2 槐耳清膏誘導肝癌細胞凋亡

圖3 槐耳清膏誘導肝癌細胞發(fā)生ERS

圖4 4-PBA抑制槐耳清膏誘導的肝癌細胞ERS

圖5 抑制肝癌細胞ERS可增強槐耳清膏的抗腫瘤能力

A、B：Hep3B、HepG2細胞凋亡情況；C：Hep3B、HepG2細胞凋亡差異；D：Hep3B、HepG2細胞活力的差異；E、F：Western blot法檢測Hep3B、HepG2B細胞Bcl-2與Bax的表達；G：Hep3B和HepG2細胞Bcl-2/Bax的差異；1：對照組；2：4-PBA組；3：槐耳清膏組；4：槐耳清膏+4-PBA組；與對照組比較：*P<0.05；與槐耳清膏組比較：#P<0.05

4-PBA已被用于臨床中尿素循環(huán)障礙的治療且無明顯毒副作用[11]，且4-PBA能夠抑制細胞ERS的發(fā)生。本研究表明槐耳清膏與4-PBA聯(lián)合使用能夠抑制槐耳清膏誘導的肝癌細胞ERS，減輕ERS對腫瘤治療的不利影響。

本研究在驗證槐耳清膏具有抗腫瘤作用的同時也提示槐耳清膏可誘導肝癌細胞發(fā)生ERS，導致槐耳清膏的作用下降。4-PBA能夠有效抑制ERS的發(fā)生，與槐耳清膏聯(lián)合使用降低了肝癌細胞內(nèi)ERS水平，上調(diào)細胞內(nèi)Bax蛋白的表達，抑制Bcl-2蛋白的表達，降低細胞內(nèi)Bcl-2/Bax的比值，使槐耳清膏抑制肝癌細胞活力、誘導肝癌細胞凋亡的作用增強。4-PBA聯(lián)合槐耳清膏與單獨使用槐耳清膏相比具有更明顯地抗腫瘤作用，可能為肝癌的治療提供新的思路。