畢可海，張玉瑩，孫玉奉，張玉清，楊青，禹長海

1. 威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系（威海 264300）；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（泰安 271018）；3. 安丘市檢驗檢測中心（濰坊 262100）

油炸食品有著獨特的色香味，其中油炸肉制品由于其酥脆的口感而在食譜中占有重要地位[1-2]。油炸過程的高熱等條件可以殺滅食品中的細(xì)菌，延長保存期，給予食品特有的油香味和金黃色澤，使食材的營養(yǎng)成分能最大程度的保持在食品內(nèi)不流失，油炸食品受到人們喜愛[3]。然而近年來一些研究表明，油炸食品的安全性存在很大問題，肉類在油炸過程中產(chǎn)生的多環(huán)芳烴、雜環(huán)胺等強(qiáng)致癌物對人體健康存在極大危害[4]。苯并芘是多環(huán)芳烴、雜環(huán)胺等強(qiáng)致癌物的一種[5]。

苯并芘（B(a)P）是一種對健康有著巨大危害的物質(zhì)，它來源廣泛，汽車尾氣、工業(yè)廢氣、食物在熏制、烘烤和煎炸時均可產(chǎn)生，是多環(huán)芳香烴化合物中具有代表性、被國際公認(rèn)的強(qiáng)致癌物質(zhì)之一[6-7]。其主要是通過食物或飲水進(jìn)入機(jī)體，在腸道被吸收，入血后很快分布于全身。乳腺和脂肪組織可蓄積苯并芘。苯并芘對眼睛、皮膚有刺激作用，是致癌物和誘變劑，并且有胚胎毒性。動物試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口攝入苯并芘可通過胎盤進(jìn)入胎仔內(nèi)，引起毒性及致癌作用[8-11]。由于苯并芘在人體內(nèi)可以蓄積，長期食用含有苯并芘的食物，會嚴(yán)重影響健康。油炸食品在高溫加工中由于脂肪會發(fā)生裂解等過程會產(chǎn)生大量的苯并芘[12-14]。因此，試驗以油炸肉制品產(chǎn)生的苯并芘為研究對象，探討苯并芘的生成條件并尋找合適的抑制劑等，以期減少苯并芘對人體健康的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬肉、雞肉、牛肉、食用油（山東榮成市售）；苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；二甲基亞砜、正己烷、乙腈、甲醇（均為國產(chǎn)分析純）；乙腈（色譜純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗儀器

Reservoir Tray型高效液相色譜儀（配熒光檢測器，日本島津公司）；QCD3120型超聲儀（北京華盛譜信有限公司）；N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；TGL-12B超高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；C18固相萃取裝置（北京華盛譜信有限公司）；AKLH-VI-20超純水機(jī)（艾柯儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 提取

將豬肉切成2～3 mm肉片，取適量切片后生肉。使用電磁爐加熱，油炸。將油炸后的肉樣品，用研缽研磨至肉末狀。準(zhǔn)確稱取5 g樣品，加入20 mL甲醇，用玻璃棒攪拌浸提2 min，超聲30 min。將提取液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中。在肉渣中繼續(xù)加入20 mL正己烷，超聲30 min，提取液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中。重復(fù)提取1次，合并提取液，高速離心10 min。取上清液于100 mL圓底燒瓶中，在40 ℃下旋蒸至體積約5 mL。用20 mL二甲基亞砜萃取，將下層液體轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加入30 mL超純水?；旌暇鶆?，待用。

1.3.1.2 分離純化

活化：用5 mL甲醇活化C18固相萃取柱，調(diào)節(jié)真空度，使流速2～3滴/s，待柱內(nèi)溶液至近干，加入5 mL超純水。調(diào)節(jié)真空度，是流速2～3滴/s。上樣與洗雜：將前處理中制備好的二甲基亞砜洗脫液加入C18固相萃取柱，調(diào)節(jié)真空度，使流速1～2滴/s，用10 mL超純水洗雜。

洗脫：用3 mL高效液相色譜專用的甲醇進(jìn)行淋洗固相萃取柱，用塑料小管承接洗脫液，調(diào)節(jié)真空度使流速大約1～2滴/s[15]。

樣品進(jìn)樣前處理將甲醇洗脫液混勻，盡量避免目標(biāo)物在處理過程中的損失。經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔過濾膜過濾于進(jìn)樣小瓶中。4 ℃下保存，準(zhǔn)備進(jìn)入HPLC色譜分析儀。

1.3.2 高效液相色譜檢測方法

液相色譜儀配熒光檢測器和Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（體積比88∶12），流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm。

1.3.3 苯并芘標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取1 mg（精確至0.01 mg）苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容，得到100 mg/L的苯并芘溶液，分別稀釋成0.01，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 mg/L的溶液。將所得溶液過0.22 μm有機(jī)濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中至于HPLC檢測分析，記錄峰面積。以苯并芘濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 苯并芘添加回收試驗

選用兔肉（未檢出苯并芘）作為添加回收試驗樣品，在進(jìn)行添加回收試驗之前用此方法對雞肉樣品中的苯并芘含量進(jìn)行檢測。分別取1 mL質(zhì)量濃度1.0，2.0和5.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加到5.0 g樣品中，室溫下孵育24 h，按1.3.1所述步驟進(jìn)行提取凈化，得到分析樣品。

1.3.5 油炸豬肉、雞肉和牛肉中苯并芘生成量的影響

分別取質(zhì)量相同、部位相近的豬五花肉、雞脯肉和牛胸肉按1.3.1進(jìn)行預(yù)處理，設(shè)定油炸溫度200 ℃，油炸時間8 min，然后將預(yù)處理好的樣品置于冰箱中4℃冷卻，經(jīng)HPLC檢測。記錄峰面積值，探討不同種類的肉制品對苯并芘生成量的影響。

1.3.6 油炸不同部位的豬肉對苯并芘生成量的影響

分別稱取豬肉中質(zhì)量相同的里脊肉、后腿肉、臀尖肉和五花肉，按1.3.1進(jìn)行預(yù)處理，設(shè)定油炸溫度200 ℃，油炸時間10 min，將預(yù)處理好的樣品置于冰箱中4 ℃冷卻，經(jīng)HPLC檢測。并測定油炸豬肉后的油中苯并芘生成量，探討豬肉中不同部位的肉制品對苯并芘生成量的影響。

1.3.7 油炸溫度和油炸時間對苯并芘生成量的影響

取質(zhì)量相同的豬五花肉分別在油炸溫度為160，180，200和220 ℃的條件下，分別油炸2 min，4，6，8，10和15 min，取出冷卻，經(jīng)HPLC檢測。探討不同油炸溫度和油炸時間對苯并芘生成量的影響。

1.3.8 抗氧化劑對豬肉中苯并芘生成量的影響

準(zhǔn)確稱取干茶葉15 g，充分研磨，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶20 g/mL，浸提溫度60，超聲波浸提1 h，過濾，定容至400 mL[16-18]。將豬肉浸泡在提取液中12 h，取出，并瀝干，按1.3.1進(jìn)行樣品前處理，在溫度為200 ℃時油炸10 min，置于液相色譜檢測，計算苯并芘生成量。探討茶葉提取物對豬肉中苯并芘生成量的影響。

準(zhǔn)確稱取15 g生大蒜，充分研磨，以料液比1∶4（g/mL），加入95%乙醇溶液，30 ℃水浴1.5 h，過濾，得到提取物，定容至400 mL[19]。將豬肉浸泡在提取液中12 h，取出、瀝干按1.3.1進(jìn)行樣品前處理，在溫度200 ℃時油炸10 min，置于液相色譜檢測，計算苯并芘生成量。探討茶葉提取物對豬肉中苯并芘生成量的影響。

準(zhǔn)確稱取15 g海帶干粉，以料液比1∶10（g/mL），加入50%乙醇溶液，經(jīng)超聲波破碎儀破碎15 min，40℃水浴3 h，過濾，得到提取物，定容至400 mL[20]。將豬肉浸泡在提取液中12 h，取出、瀝干按1.3.1進(jìn)行樣品前處理，在溫度200 ℃時油炸10 min，置于液相色譜檢測，計算苯并芘生成量。探討茶葉提取物對豬肉中苯并芘生成量的影響。

1.3.9 茶葉提取液的浸泡時間對苯并芘生成量的影響

取質(zhì)量相同的豬五花肉，將其置于茶葉提取液中分別浸泡3，6，9，12和15 h，在溫度為取出后在200℃溫度下，油炸10 min，取出冷卻，經(jīng)HPLC檢測。探討五花肉在茶葉提取液中浸泡時間對苯并芘生成量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯并芘HPLC色譜圖

由圖1可得，在試驗液相色譜條件下，苯并芘溶液的色譜峰峰形較好，雜峰較少。苯并芘的出峰時間約19 min，時間合適，符合實際要求，因此選用此液相色譜條件。

圖1 苯并芘的HPLC色譜圖

2.2 苯并芘標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖2所示，苯并芘濃度在0.1～10 mg/kg的范圍內(nèi)，與峰面積有良好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為y=3×107x+2×106，y為峰面積，x為苯并芘濃度。相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。由此表明，苯并芘濃度與峰面積成正比例關(guān)系。因此，峰面積可表觀上反映苯并芘濃度。

圖2 苯并芘標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 苯并芘的回收率

為驗證液此方法的準(zhǔn)確性，因此選用兔肉樣品做添加回收試驗，分別取質(zhì)量濃度1.0，2.0和5.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到5.0 g雞肉中孵育24 h，每個濃度做3組平行試驗。按1.3.1步驟，經(jīng)前處理后，置于HPLC檢測，結(jié)果顯示，方法的回收率均在86.0%～96.0%之間，說明此方法具有較高的準(zhǔn)確性。

2.4 油炸豬肉、雞肉和牛肉對苯并芘生成量的影響

如圖3所示，不同種屬的肉品（豬肉、雞肉）經(jīng)油炸后苯并芘生成量不同，豬肉的苯并芘生成量可達(dá)136.76 μg/kg，牛肉的苯并芘生成量為41.94 μg/kg，而雞肉中的苯并芘生成量僅8.61 μg/kg，這說明肉的種類對苯并芘的生成量有很大影響。這可能是因為不同種屬的肉成分不同，在油炸時脂肪等會在高溫條件下發(fā)生熱裂解反應(yīng)，再經(jīng)過環(huán)化和聚合反應(yīng)就能夠形成包括苯并芘在內(nèi)的多環(huán)芳烴類物質(zhì)。豬肉中脂肪含量較高，使得油炸豬肉時生成苯并芘含量也較高。而雞肉中富含蛋白質(zhì)，而脂肪含量較低，因此油炸雞肉時苯并芘生成量較低。在相同條件下由于豬肉中苯并芘生成量最高，所以選擇豬肉進(jìn)行下一步研究。

表1 添加回收率試驗

圖3 不同肉種類對苯并芘生成量的影響

2.5 不同部位豬肉對苯并芘生成量的影響

因不同部位的豬肉肉質(zhì)不同、脂肪含量不同，將豬肉分為4級，按豬肉的等級分級，里脊肉、后腿肉、臀尖肉、五花肉分別經(jīng)200 ℃油炸10 min后，苯并芘含量可分別達(dá)174.43，122.49，96.30和75.77 μg/kg。如圖4所示，通過檢測油炸豬肉后的油中苯并芘生成量，發(fā)現(xiàn)油炸不同部位豬肉后油中的苯并芘生成量不同，其中以油炸過五花肉的油中苯并芘生成量最高，可達(dá)137.21 μg/kg，而油炸里脊肉后的油中苯并芘生成量最低。這可能是因為不同部位中豬肉的成分含量不同，如蛋白質(zhì)、脂肪等因素，五花肉中脂肪含量最高，蛋白質(zhì)含量最低，而里脊肉中脂肪含量最低，而蛋白質(zhì)含量最高，脂肪因高溫裂解，產(chǎn)生自由基，并相互結(jié)合生成苯并芘。因此可能會對苯并芘的生成產(chǎn)生影響。

2.6 油炸溫度和油炸時間對苯并芘生成量的影響

由圖5可知，溫度和時間對苯并芘的生成都具有顯著影響。油炸溫度相同時，苯并芘生成量隨油炸時間的增長而增大。0～4 min內(nèi)，苯并芘生成量沒有明顯增加，低于國家標(biāo)準(zhǔn)（4 min是苯并芘生成量為4.864 μg/kg）。在油炸5 min后，苯并芘生成量開始顯著產(chǎn)生，200 ℃油炸10 min時，苯并芘生成量為174.35 μg/kg。油炸15 min時生成量為178.24 μg/kg，相較于油炸10 min未有明顯增長，生成速率變小，苯并芘繼續(xù)生成的趨勢不明顯。而在相同的時間內(nèi)，苯并芘的生成量隨著溫度升高而增大，在200和220 ℃溫度下會產(chǎn)生更多的苯并芘。油炸溫度越高，時間越長，產(chǎn)生的苯并芘生成量越大，這與吳丹的結(jié)果相似[21]。綜合考慮苯并芘生成量、生成速率、生活實際及口感等因素，將后續(xù)試驗，探討抗氧化劑對油炸豬肉的苯并芘生成量的影響，油炸條件確定為200 ℃，油炸10 min。

圖4 油炸不同部位的豬肉中苯并芘

圖5 油炸溫度和油炸時間對苯并芘生成的影響

2.7 幾種天然食品提取物對油炸豬肉中苯并芘的抑制作用

由表2可得，浸泡不同抑制劑的3組試驗組均有不同程度的抑制效果。與對照組相比較，海帶提取物的抑制效果最小為11.35%，添加茶葉提取物的抑制效果可達(dá)51.19%。這可能與茶葉、大蒜、海帶提取物的抗氧化性有關(guān)，茶葉中富含茶多酚，大蒜中還有大蒜素[22]，海帶中含有海帶多酚[23]，在抗氧化能力上，茶多酚因其結(jié)構(gòu)上可以提供多個羥基而使自由基滅活，因此具有很強(qiáng)的抗氧化能力和清除自由基能力[24-25]，可以清除在油炸豬肉脂肪時因高溫裂解產(chǎn)生的自由基，因此會對苯并芘的生成產(chǎn)生較好的抑制效果。

2.8 茶葉提取物浸泡時間對苯并芘生成量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，茶葉提取物對苯并芘的生成具有抑制效果，因此更進(jìn)一步的探討豬五花肉在茶葉提取物溶液里的浸泡時間對苯并芘的生成量的影響。由圖6可知，浸泡時間對苯并芘的生成量具有顯著影響。浸泡時間3 h時，油炸豬肉中苯并芘生成量為153.46 μg/kg，開始產(chǎn)生抑制效果，并且肉色與未浸泡的接近，表面變?yōu)榈t色。隨著浸泡時間增長，苯并芘生成量迅速下降。浸泡9 h時，油炸肉中苯并芘生成量為89.84 μg/kg。浸泡15 h時，油炸肉中苯并芘生成量為74.37 μg/kg。

綜合考慮油炸豬肉中苯并芘生成量等方面，試驗結(jié)果顯示，將豬肉浸泡在茶葉提取物中浸泡9 h，具有較好地抑制效果，并且肉的組織狀態(tài)較好。

表2 幾種提取物對油炸豬肉中苯并芘的抑制效果

圖6 茶葉提取物浸泡時間對苯并芘生成量的影響

3 結(jié)論

試驗研究不同油炸條件對苯并芘生成的影響，通過試驗依次討論不同種屬的肉制品、不同部位的豬肉、油炸時間、油炸溫度和抗氧化劑對苯并芘生成的影響。通過試驗發(fā)現(xiàn)，對于不同種屬的肉制品及不同部位的豬肉，油炸時生成的苯并芘與其脂肪含量密切相關(guān)，脂肪含量多的肉制品產(chǎn)生的苯并芘的量也較多，因此，豬五花肉產(chǎn)生的苯并芘的量較大，200 ℃油炸10 min時，苯并芘生成量可達(dá)174.35 μg/kg，而通過添加抗氧化劑，可以明顯降低苯并芘生成，抑制率最高可達(dá)51.19%。試驗為進(jìn)一步研究油炸過程中苯并芘的調(diào)控提供依據(jù)。