呂洋 黃智 向雷 蔣天鵬 李興

(貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種致命的腦腫瘤，其中80%為高度惡性[1]，它會(huì)影響腦功能，甚至危及生命[2]。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子[3]，包括CCAT1、ZEB1-AS1、TUG1和UCA1[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA尿路上皮癌相關(guān)基因1(Long non-coding RNA urothelial carcinoma related gene 1，LncRNA UCA1)通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄，來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[7]。據(jù)報(bào)道，miRNA-206可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖[8]。然而，miR-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)作用尚不明確。核心生物CLOCk是生物鐘與人類健康之間的重要環(huán)節(jié)，CLOCk異二聚體激活許多生物鐘蛋白的轉(zhuǎn)錄，它存在于許多組織中，比如前列腺、卵巢、結(jié)腸和心臟[9]，并且在腦組織中也有表達(dá)[10]。

既往研究表明，作為miR-206的效應(yīng)因子，LncRNA UCA1可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[11]，然而其與miR-206及其他相關(guān)RNA(CLOCk)的表達(dá)及生物學(xué)活性，特別是與膠質(zhì)瘤功能的結(jié)合軸，尚未完全明確。本研究將探討LncRNA UCA1在miR-206和CLOCk上的表達(dá)及其對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的綜合影響，擬為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供一種新的策略。

1 材料與方法

1.1材料 U251、U87、SW1783、LN229神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(normal human astrocytes ,NHAs)均購(gòu)自上海組織銀行(上海，中國(guó))。所有細(xì)胞保存在37℃和5%CO2濃度環(huán)境的DMEM和10%FBS培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))中。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，從我院病理科采集60例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及周圍正常組織，所有患者在手術(shù)前未接受任何化療或放療，并對(duì)其組織出具書面知情同意書，組織均保存于液氮中。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增法(Real-time Quantitative PCR，qRT-PCR) 總RNA通過(guò)PrimeScript RT試劑(Takara，日本)反向轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Green Master Mix II(日本Takara，日本)在ABI7 300上進(jìn)行qRT-PCR。miRNA的表達(dá)以U6為參考進(jìn)行測(cè)定，并采用GAPDH進(jìn)行校準(zhǔn)。引物順序如下：LncRNA UCA1(正向5’-ACGCTAACTGGCACCTTGTT-3’和反向5’-TGGGGATTACTGGGGTAGGG-3’)、GAPDH(正向5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’和反向5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’)、miR-206(正向5’-CGGGCTTGTGGA ATGGTAAGC-3’和反向5’-GCTTCGGCAGCA CATATACTAAAAT-3’)、U6(正向5’-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3’和反向5’-ATGGAA CGCTTCACGA-3’)。

1.2.2轉(zhuǎn)移和侵襲實(shí)驗(yàn) 在無(wú)血清培養(yǎng)基中，將10 000個(gè)細(xì)胞加入上室進(jìn)行轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基置于下室。培養(yǎng)1 d后，使用0.1%結(jié)晶紫固定并染色?？梢苑治銮忠u能力。侵襲實(shí)驗(yàn)中，在添加物的上室預(yù)涂50 mg/L基質(zhì)凝膠。此外，所有其他步驟均相同。

1.2.3慢病毒載體轉(zhuǎn)染 將U251細(xì)胞和SW1783細(xì)胞共轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒，與LncRNA UCA1序列shRNA一同構(gòu)建。LV-con為對(duì)照組。將慢病毒載體加入LncRNA UCA1片段構(gòu)建LV-LncRNA UCA1。miR-206模擬或陰性對(duì)照(NC)通過(guò)Lipo- fectamine 2000(Invitrogen，美國(guó))進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法 通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉凝膠電泳提取蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(Millipore，美國(guó))。抗E-鈣粘蛋白抗體(1:500，ab40772，abcam)、N-鈣粘蛋白抗體(1:500，ab18203，abcam)、波形蛋白抗體(1:500，ab8978，abcam)、CLOCk抗體(1:500，ab201974，abcam)和GAPDH抗體(1:500，ab-8245，abcam)均購(gòu)自美國(guó)abcam。采用化學(xué)熒光法(細(xì)胞信號(hào)技術(shù))對(duì)反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5熒光素酶報(bào)告程序 將結(jié)合LncRNA UCA1-WT或LncRNA UCA1-MUT的miR-206亞克隆到pGL3堿性載體上。miR-206激動(dòng)劑與10μg pLUC-WT-LncRNA UCA1或pLUC- MUT-LncRNA UCA1共轉(zhuǎn)染。將結(jié)合CLOCk-WT或CLOCk-MUT的miR-206亞克隆到pGL3堿性載體上。miR-206激動(dòng)劑與pLUC-WT-CLOCk或pLUC-MUT-CLOCk共轉(zhuǎn)染。

1.2.6免疫熒光染色法及RNA免疫沉淀法(RNA immunoprecipitation protocol，RIP) 采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，采用0.2%Triton X-100進(jìn)行滲透和1.5%正常驢血清進(jìn)行阻隔。初級(jí)抗體結(jié)合1 h，隨后與Alexa Fluor488連結(jié)二級(jí)抗體再培育1 h。采用DAPI給細(xì)胞核染色，使用熒光顯微鏡測(cè)量熒光(Carl Zeiss，德國(guó))。RIP采用人類抗Ago2抗體、磁珠(Millipore，美國(guó))或?qū)φ湛贵w(Millipore，美國(guó))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了裂解和培育。

1.2.7體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn) 本研究經(jīng)我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，使用18只6周齡的雌性BALB/c裸鼠。在裸鼠前背部，6只注射U251細(xì)胞(5X106/每只)，6只注射感染LV-sh-LncRNA UCA1的U251細(xì)胞(5X106/每只)，6只注射感染LV-sh-con的U251細(xì)胞(5X106/每只)。每7 d記錄一次腫瘤大小，6周后對(duì)小鼠進(jìn)行頸椎脫位麻醉。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件和GraphPad Prism(美國(guó))，將中位值用作為區(qū)分表達(dá)水平高低的臨界值，數(shù)據(jù)為至少三組實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；采用F檢驗(yàn)，以測(cè)量分類變量之間的差異；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA UCA1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá) 通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中LncRNA UCA1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.001)；LncRNA UCA1在U251、U87、SW1783和LN229細(xì)胞株中的表達(dá)與NHA相比，LncRNA UCA1呈過(guò)度表達(dá)(P< 0.01)；從0至60個(gè)月的長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)，高LncRNA UCA1水平的患者的12個(gè)月生存率為86.96%，24個(gè)月生存率為60.87%，36個(gè)月生存率為56.52%，48個(gè)月生存率為47.83%，60個(gè)月生存率為30.43%，而低LncRNA UCA1水平的患者的生存率分別為100%，89.19%，83.78%，72.97%和59.46%，與低LncRNA UCA1水平的患者相比，高LncRNA UCA1水平的患者的生存率明顯降低。見(圖1a～圖1c)。

注：a：LncRNA UCA1在膠質(zhì)瘤組織(n=60)和正常組織(n=60)中的相對(duì)表達(dá)；b：神經(jīng)膠質(zhì)瘤及正常細(xì)胞中的LncRNA UCA1表達(dá)；c：LncRNA UCA1水平在Kaplan Meier 0～60個(gè)月總生存曲線。(**P<0.01， ***P<0.001)圖1 LncRNA UCA1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)上調(diào)

2.2沉默LncRNA UCA1后對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲的影響 在U251和SW1783中轉(zhuǎn)染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1基因后發(fā)現(xiàn)LncRNA UCA1下調(diào)抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，見(圖2a～圖2b)。蛋白質(zhì)免疫印跡法和免疫熒光法的結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除LncRNA UCA1能夠提高上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)，但降低了N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)，見(圖2c～圖2d)。

注：a-b：U251和SW1783中轉(zhuǎn)染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1的細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。c-d：U251和SW1783中轉(zhuǎn)染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1的上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和GAPDH的蛋白質(zhì)印記和免疫熒光檢測(cè)。(**P<0.01)圖2 沉默UAC1抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲

2.3miR-206是否為L(zhǎng)ncRNA UCA1的體外靶點(diǎn) 為了解miR-206和LncRNA UCA1之間的關(guān)系，我們對(duì)二者的共同序列進(jìn)行了線上搜索并進(jìn)行了熒光素酶分析，(圖3a)預(yù)測(cè)了LncRNA UCA1和miR-206的共同序列，并顯示了通過(guò)LncRNA UCA1-WT(野生型)或LncRNA UCA1-MUT(突變型)構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告劑。(圖3b)和(圖3c)分別顯示了LncRNA UCA1-WT&LncRNA UCA1-MUT和U251&SW1783中miR-206的熒光素酶活性，兩種細(xì)胞中LncRNA UCA1-WT中miR-206活動(dòng)均受到顯著抑制(P<0.01)。LncRNA UCA1&miR-206和U251&SW1783組合中，IgG和Ago2的相對(duì)表達(dá)分別如(圖3c)和(圖3e)所示；RIP分析表明，與對(duì)照IgG團(tuán)粒相比，Ago2團(tuán)粒中LncRNA UCA1和miR-206表達(dá)更高(P<0.01)，見(圖3d)。根據(jù)上述結(jié)果，LncRNA UCA1、miR-206和Ago2之間的關(guān)聯(lián)得以確定，證實(shí)miR-206是LncRNA UCA1的體外靶點(diǎn)。

注：a：LncRNA UCA1與miR-06的共同序列以及LncRNA UCA1-WT或LncRNA UCA1-MUT的序列；b：在LncRNA UCA1-WT中轉(zhuǎn)染miR-206的細(xì)胞熒光素酶活性，在U251中轉(zhuǎn)染LncRNA UCA1-MUT的細(xì)胞熒光素酶活性；c：miR-206共轉(zhuǎn)染LncRNA UCA1-WT或SW1783共轉(zhuǎn)染LncRNA UCA1-MUT的細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性；d ：LncRNA UCA1共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中IgG和Ago2的相對(duì)表達(dá)與U251中miR-206的相對(duì)表達(dá)；e：LncRNA UCA1和miR-206共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中IgG和Ago2的相對(duì)表達(dá)；(**P<0.01)。圖3 驗(yàn)證miR-206是LncRNA UCA1的靶點(diǎn)

2.4CLOCk是否為miR-206的直接靶點(diǎn) (圖4a)預(yù)測(cè)了CLOCk和miR-206之間的共同序列，并顯示了帶有CLOCk-WT(野生型)和CLOCk-MUT(突變型)的熒光素酶報(bào)告劑。(圖4b)和(圖4c)分別顯示了miR-206、miR-206和LV-LncRNA UCA1共轉(zhuǎn)染的CLOCk-WT和CLOCk-MUT在U251和SW1783細(xì)胞中的熒光素酶活性，與CLOCk-MUT相比，CLOCk-WT結(jié)合miR-206的熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)。然而，觀察miR-206+V-LncRNA UCA1結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA UCA1減弱了這種作用。在miR-206和LV-shLncRNA UCA1轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，CLOCk mRNA表達(dá)顯著降低，而在LV-LncRNA UCA1轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有所增加，見(圖4d)；與qRT-PCR結(jié)果一致，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明了同一趨勢(shì)，見(圖4e)。

a：CLOCk和miR-206的共同序列以及CLOCk-WT和CLOCk- MUT序列；b：miR-206激動(dòng)劑或miR-206激動(dòng)劑+ LV-LncRNA UCA1對(duì)U251的熒光素酶活性；c：與miR-206激動(dòng)劑或miR-206激動(dòng)劑+ LV-LncRNA UCA1共轉(zhuǎn)染SW1783細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性；d：miR-206、LV-LncRNA UCA1和LV-sh-LncRNA UCA1細(xì)胞中CLOCk的mRNA表達(dá)；e：蛋白質(zhì)印記檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CLOCk蛋白的表達(dá)；(**P <0.01)。圖4 CLOCk是miR-206直接靶點(diǎn)

2.5體內(nèi)去除LncRNA UCA1對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的影響 轉(zhuǎn)染LV-sh-LncRNA UCA1組較轉(zhuǎn)染LV-sh-con組的腫瘤提交明顯減小，見(圖5a)；第0至42天的腫瘤生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染LV-sh-LncRNA UCA1組較轉(zhuǎn)染LV-sh-con組的腫瘤生長(zhǎng)明顯變慢，見(圖5b)；第42天的腫瘤重量轉(zhuǎn)染LV-sh-LncRNA UCA1組較轉(zhuǎn)染LV-sh-con組明顯減少，見(圖5c)；腫瘤組織中LV-sh-LncRNA UCA1抑制了CLOCk的表達(dá)(P<0.01)，見(圖5d)；沉默LncRNA UCA1能顯著降低CLOCk蛋白的表達(dá)(P<0.01)，見(圖5e)。

注：a：體內(nèi)腫瘤共轉(zhuǎn)染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1的生長(zhǎng)結(jié)果；b：兩組腫瘤的生長(zhǎng)曲線；c：兩組腫瘤重量的比較；d-e：CLOCk在LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1中的表達(dá)；(**P<0.01)。圖5 體內(nèi)的沉默LncRNA UCA1對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抑制作用

3 討 論

先前的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA UCA1與神經(jīng)膠質(zhì)瘤密切相關(guān)，其在膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)高于正常腦樣本中的含量，并通過(guò)靶向miR-122增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[12]。本研究結(jié)果顯示，與正常組織相比，膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中的LncRNA UCA1表達(dá)顯著增高，高LncRNA UCA1水平患者的總生存率低于低LncRNA UCA1水平患者，這與既往發(fā)現(xiàn)一致。He等人[13]聲稱，去除LncRNA UCA1抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，我們的細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光分析均表明去除LncRNA UCA1能夠抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲。

本研究中，熒光素酶活性顯示，miR-206可作為L(zhǎng)ncRNA UCA1的體外靶點(diǎn)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，miR-206參與諸多細(xì)胞活動(dòng)，尤其是細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤發(fā)生[14]。Wang等人[15]報(bào)道，miR-206通過(guò)膠質(zhì)瘤中的Otx2調(diào)節(jié)了神經(jīng)細(xì)胞增殖及其凋亡；Hao等人[8]報(bào)道，miR-206通過(guò)BCL-2抑制了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展。而本研究發(fā)現(xiàn)miR-206的轉(zhuǎn)染降低了mRNA在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)，為其在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用提供了補(bǔ)充證據(jù)。

miR-206表達(dá)的失調(diào)可能導(dǎo)致晝夜節(jié)律和輸出的改變，其能夠介導(dǎo)哺乳動(dòng)物Clock的動(dòng)力學(xué)機(jī)制[16]。本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR-206的CLOCk-WT的熒光素酶活性表明了CLOCk是miR-206的靶點(diǎn)。此外據(jù)報(bào)道，生物鐘的失調(diào)在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，如人類癌癥[17]。本實(shí)驗(yàn)LV-sh-LncRNA UCA1的蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，腫瘤組織中的CLOCk表達(dá)受到抑制。說(shuō)明CLOCk的表達(dá)與miR- 206和LncRNA UCA1密切相關(guān)，而這二者可能對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生負(fù)面影響。

He等人[18]發(fā)現(xiàn)，LncRNA UCA1/miR-182/PFKFB2軸調(diào)節(jié)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤侵襲,這說(shuō)明多種遺傳標(biāo)記物在人類腫瘤的相互作用和組合功能中可能是一個(gè)整體。本研究發(fā)現(xiàn)CLOCk蛋白在miR-206和LV-sh-LncRNA UCA1中表達(dá)較少，但在LV-LncRNA UCA1中表達(dá)顯著增加；此外體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)表明，去除LncRNA UCA1抑制了體內(nèi)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，而腫瘤組織中的CLOCk表達(dá)受到抑制。體內(nèi)LncRNA UCA1的沉默抑制了膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，而去除LncRNA UCA1顯著降低了CLOCk蛋白表達(dá)。上述結(jié)果表明，LncRNA UCA1/miR-206/CLOCk軸可以作為一個(gè)整體來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

4 結(jié) 論

LncRNA UCA1通過(guò)膠質(zhì)瘤中miR-206/CLOCk軸增強(qiáng)了細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，LncRNA UCA1/miR- 206/CLOCk軸可能是將來(lái)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一個(gè)潛在的新靶點(diǎn)。

(本文圖1、圖2見封三)