行云逸，黃惠華

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

水凝膠是一種由親水性化合物通過(guò)物理和/或化學(xué)交聯(lián)組成的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高分子材料，它能夠在有機(jī)或無(wú)機(jī)溶劑中吸水溶脹并保持原有的形狀和結(jié)構(gòu)，而不會(huì)溶解于其中[1-2]。水凝膠具有獨(dú)特的水親和性、可降解性、滲透性和高溶脹性，被廣泛應(yīng)用于水處理、食品、組織工程、藥物輸送系統(tǒng)等領(lǐng)域[3-4]。由于組成水凝膠的高分子對(duì)外界環(huán)境變化具有不同程度的響應(yīng)性，因此將水凝膠分為非敏感性水凝膠和智能水凝膠[5]。智能水凝膠較非敏感性水凝膠對(duì)外界刺激更為敏感，根據(jù)其對(duì)不同環(huán)境刺激響應(yīng)的特性，將其分為pH敏感性水凝膠、溫度敏感性水凝膠、磁場(chǎng)敏感性水凝膠、電場(chǎng)敏感性水凝膠等[6-8]。

pH敏感性水凝膠是一類(lèi)溶脹性隨外界環(huán)境pH值變化而變化的智能水凝膠。其三維網(wǎng)絡(luò)中通常含有可離子化的基團(tuán)，它們會(huì)根據(jù)pH值的變化而產(chǎn)生不同程度的離子化，導(dǎo)致水凝膠溶脹或收縮[9-11]。根據(jù)水凝膠中pH敏感性基團(tuán)的不同，將其分為陽(yáng)離子型、陰離子型和兩性型pH敏感性水凝膠[12]。丙烯酸（acrylic acid，AA）接枝的水凝膠屬于陰離子型水凝膠，由于大量—COOH基團(tuán)的存在，使得其在高pH值環(huán)境下的溶脹度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在低pH值環(huán)境下的溶脹度[13]。

智能水凝膠因其環(huán)境響應(yīng)特性在藥物輸送方面的應(yīng)用受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。Jeong等[14]以N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺作為交聯(lián)劑將丙烯酸-2-羥乙酯（2-hydroxyethyl acrylate，2-HEA）接枝到羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CmCHT）上制備CmCHT-g-pHEA水凝膠，在體外皮膚滲透實(shí)驗(yàn)中，該水凝膠改善了川陳皮素的透皮遞送作用，具有作為pH敏感的透皮藥物遞送系統(tǒng)的潛在應(yīng)用價(jià)值。Jayaramudu等[15]通過(guò)N-異丙基丙烯酰胺（N-isopropylacrylamide，NIPAM）與Pluronic F-127的自由基聚合，合成了一種新型溫度敏感性半互穿網(wǎng)絡(luò)銀復(fù)合水凝膠，該材料顯示出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性大腸桿菌的優(yōu)異抑制能力，抑制區(qū)直徑為1.78 cm，且具有比原始聚NIPAM高3 倍的溶脹率，可應(yīng)用于傷口敷料。Kondaveeti等[16]利用過(guò)原位磁性納米顆粒對(duì)由藻酸鹽和黃原膠組成的磁性響應(yīng)水凝膠進(jìn)行改性，改性后的水凝膠對(duì)抗帕金森藥物左旋多巴的負(fù)載效率高達(dá)64%，在靜態(tài)外部磁場(chǎng)的作用下，可以刺激左旋多巴的釋放，該研究為磁性水凝膠用于遞送藥物提供了合理的設(shè)計(jì)。

益生菌是指人體腸道內(nèi)對(duì)機(jī)體健康具有益處的活微生物[17-18]。益生菌對(duì)宿主健康具有多種功能，包括增強(qiáng)腸道免疫功能、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和維持腸道菌群平衡等[19-20]。理論上，攝入酸奶或活性乳酸菌飲料可以為機(jī)體提供益生菌，促進(jìn)腸道健康。然而，益生菌要同時(shí)保證以活的狀態(tài)和充足的數(shù)量定植在腸道中才能在人體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的益生作用[21]。目前市面上的益生菌產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、保存以及消化吸收等過(guò)程中，會(huì)因?yàn)椴焕h(huán)境的影響而使益生菌失活，最終以活的狀態(tài)定植在腸道內(nèi)的益生菌數(shù)量減少而導(dǎo)致其益生功能降低[22-24]。如何保證益生菌以較高的活性和足夠的數(shù)量定植在人體腸道內(nèi)，是近年來(lái)益生菌研究的熱點(diǎn)之一，也是本實(shí)驗(yàn)研究的主要內(nèi)容。

菠蘿在加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄物，其中果肉渣占較大比重，如果直接丟棄，不僅會(huì)造成資源浪費(fèi)，而且會(huì)污染環(huán)境[25-26]。現(xiàn)階段關(guān)于菠蘿果肉的利用主要集中在菠蘿蛋白酶和能源生產(chǎn)基質(zhì)，對(duì)纖維素及其水凝膠利用方面的研究相對(duì)較少，對(duì)果蔬加工后廢棄物尤其是菠蘿果肉渣的利用缺乏更精細(xì)、更高值的途徑。本研究從菠蘿果肉渣中提取纖維素并制備成水凝膠，同時(shí)利用AA改性纖維素制備pH敏感性水凝膠，并包埋益生菌，以保護(hù)益生菌免受胃內(nèi)酸性環(huán)境的影響，使其在特定部位即腸道內(nèi)釋放，保證益生菌以較高的活性和足夠的數(shù)量定植在人體腸道內(nèi)，從而發(fā)揮其益生作用。

由于纖維素鏈中存在豐富的活潑羥基，使得其內(nèi)部形成大量的分子內(nèi)和分子間氫鍵，從而形成高度有序的結(jié)晶區(qū)[27-28]。這些高度結(jié)晶區(qū)使得纖維素對(duì)水的親和作用變小，因此纖維素很難溶于水和其他普通溶劑。本實(shí)驗(yàn)采用離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（1-butyl-3-methylimidazole chloride，BmimCl）作為溶劑制備水凝膠，在纖維素的溶解過(guò)程中，離子液體中的自由無(wú)機(jī)陰離子與纖維素羥基氫作用形成氫鍵，而陽(yáng)離子通過(guò)咪唑環(huán)上的活潑氫與纖維素羥基上的氧作用形成氫鍵，二者協(xié)同作用破壞了纖維素原有的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其在離子液體中的溶解和交聯(lián)，從而形成水凝膠。

本實(shí)驗(yàn)以菠蘿果肉纖維素（pineapple pulp cellulose，PPC）為原料，通過(guò)離子液體BmimCl制備水凝膠作為益生菌的遞送載體，以包埋益生菌增強(qiáng)其穩(wěn)定性，為菠蘿廢棄物的高值化利用和益生菌的遞送系統(tǒng)提供合理的途徑和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用新鮮菠蘿為市售。

離子液體BmimCl（分析純） 中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所；AA（分析純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；過(guò)硫酸銨（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞氯酸鈉（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氫氧化鈉（分析純） 天津福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)；無(wú)水乙醇（分析純） 南京化學(xué)試劑股份有限公司；益生菌 廣州怡能生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.02 mol/L、pH 7.2） 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)、溶菌酶 上海伯奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S-3700N鎢燈絲掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司；VERTEX-33傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）儀、D8 ADVANCE X射線(xiàn)多晶衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 德國(guó)Bruker公司；JW-3021HR高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司；UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī)北京松源華興科技發(fā)展有限公司；P H S-2 5 p H 計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；BSA12S-CW分析天平 德國(guó)賽多利斯儀器有限公司；FW-135中草藥高速粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 廣州星爍儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPC的提取

將菠蘿去皮切成小塊，水洗后在打漿機(jī)中進(jìn)行打漿，過(guò)濾后獲得果肉渣，用蒸餾水沖洗至濾水無(wú)色，置于50 ℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥24 h。將干燥的果肉渣用粉碎機(jī)粉碎，并經(jīng)過(guò)80 目篩網(wǎng)篩分得到菠蘿果肉渣干粉，用于纖維素的提取。

將菠蘿果肉渣干粉與蒸餾水按照質(zhì)量比1∶5混合，于80 ℃條件下水浴2 h并不停攪拌，以除去果肉渣中的水溶性成分，然后用濾布過(guò)濾并用蒸餾水沖洗至濾液無(wú)色。將濾渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的亞氯酸鈉溶液（用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.8～4.0）按照體積比約1∶5混合均勻，于75 ℃水浴鍋中漂白2 h，以除去木質(zhì)素，將濾渣過(guò)濾并用蒸餾水沖洗至中性。然后將濾渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaOH溶液按照體積比1∶2混合，在室溫下攪拌10 h，以除去半纖維素和其他雜質(zhì)，過(guò)濾并用蒸餾水洗滌濾渣至濾液呈中性，并用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液洗滌濾渣脫水，置于50 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量。用粉碎機(jī)將干燥后的濾渣粉碎，經(jīng)過(guò)100 目篩網(wǎng)篩分得到PPC。

1.3.2 菠蘿果肉纖維素水凝膠的制備

稱(chēng)取10 g離子液體BmimCl于試管中，待其在室溫下融解成透明液體后，稱(chēng)取0.2 g PPC加入到離子液體中并混合均勻，置于100 ℃油浴鍋中攪拌溶解3 h。將所得混合物溶液冷卻至室溫后，加入蒸餾水將反應(yīng)體系中的離子液體置換出來(lái)，多次用蒸餾水浸泡以除去未反應(yīng)的離子液體，即得到水凝膠。將水凝膠真空冷凍干燥36 h，得到凍干菠蘿果肉纖維素水凝膠（pineapple pulp cellulose hydrogel，PPCH），置于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 pH敏感性水凝膠的制備

稱(chēng)取1 0 g 離子液體B m i m C l 于試管中，待其在室溫下融解成透明液體后，稱(chēng)取0.2 g P P C 加入到離子液體中并混合均勻，置于100 ℃油浴鍋中，在N2氛圍下攪拌溶解3 h。當(dāng)混合物溶液冷卻至60 ℃后，加入25 mg引發(fā)劑過(guò)硫酸銨（預(yù)先用0.5 mL二甲基亞砜溶解），并攪拌20 min以促進(jìn)自由基的產(chǎn)生。然后將0.8 g的AA（預(yù)先在冰浴下質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% NaOH溶液調(diào)節(jié)中和度至85%）加入到上述混合物溶液中，在N2氛圍下70 ℃攪拌反應(yīng)3 h。將混合物溶液冷卻至室溫后，即形成凝膠，用蒸餾水浸泡并洗滌3 d，以除去未反應(yīng)的離子液體和雜質(zhì)。將水凝膠真空冷凍干燥36 h，得到凍干pH敏感性水凝膠（記作PPCH-AA），置于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 結(jié)構(gòu)表征

1.3.4.1 FTIR分析

稱(chēng)取2 mg干燥樣品，與100 mg KBr粉末均勻混合，壓片制樣，在FTIR儀上進(jìn)行分析測(cè)定。測(cè)試條件為：分辨率4 cm－1、掃描范圍4 000～500 cm－1。

1.3.4.2 XRD分析

將2 mg干燥樣品，置于XRD儀測(cè)試，測(cè)試條件為：Ni濾波、Cu靶、衍射角2θ＝4°～40°、掃描速率2（°）/min，測(cè)試管壓和管流分別為40 kV和40 mA。

1.3.4.3 微觀結(jié)構(gòu)觀察

取適量的干燥樣品，用導(dǎo)電膠固定在銅盤(pán)上，對(duì)其表面進(jìn)行噴金處理，用掃描電子顯微鏡在10 kV加速電壓下觀察樣品的表面形貌。

1.3.5 水凝膠的溶脹性能測(cè)定

分別稱(chēng)取25 mg凍干水凝膠置于燒杯中，分別加入適量蒸餾水、模擬胃pH值環(huán)境的溶液（simulated gastric fluid，SGF）（pH 1.2，通過(guò)將2 g NaCl和7 mL濃HCl溶于1 000 mL蒸餾水中制備）、模擬腸道pH環(huán)境的溶液（simulated intestinal fluid，SIF）（pH 6.8，通過(guò)將250 mL 0.1 mol/L KH2PO4和118 mL 0.2 mol/L NaOH混合制備），使水凝膠浸沒(méi)，每間隔一段時(shí)間取出水凝膠，用濾紙吸干表面水分后立即稱(chēng)質(zhì)量，在37 ℃下溶脹至其質(zhì)量不再增加即達(dá)到溶脹平衡。溶脹率按公式（1）計(jì)算。

式中：md是凍干水凝膠的初始質(zhì)量/g；mt是水凝膠中溶脹t時(shí)間后的質(zhì)量/g。

1.3.6 水凝膠的pH敏感性測(cè)定

稱(chēng)量2 5 m g 凍干水凝膠，放置在不同p H 值（pH 1.0～8.0）的溶液中，使其充分溶脹至平衡，采用1.3.5節(jié)的方法測(cè)定其溶脹率，以不同pH值溶液中的溶脹性表征水凝膠的pH敏感性。

1.3.7 水凝膠吸附益生菌及其在模擬胃腸道pH值環(huán)境下的緩釋性能比較

稱(chēng)取一定量的益生菌粉加入到0.02 mol/L pH 7.2的PBS中，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的菌懸液。稱(chēng)取300 mg凍干水凝膠浸沒(méi)于上述溶液中，在室溫下靜態(tài)吸附24 h，達(dá)到溶脹平衡（24 h）后將水凝膠取出，真空冷凍干燥36 h，得到凍干的載藥水凝膠，置于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

取1 5 0 m g 負(fù)載益生菌的凍干水凝膠分別置于20 mL SGF和SIF中，在37 ℃振蕩水浴鍋中緩釋7 h。每隔1 h收集3 mL釋放介質(zhì)，并用相同體積的溶液（SGF或SIF）補(bǔ)充。以水溶性蛋白質(zhì)量濃度變化作為指標(biāo)，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度來(lái)間接測(cè)定緩釋的益生菌的質(zhì)量。載藥水凝膠的益生菌累積釋放量和累積釋放率分別按公式（2）、（3）計(jì)算。

式中：mrt是載藥水凝膠緩釋t時(shí)刻累計(jì)釋放的益生菌所含蛋白質(zhì)量/mg；mh是用于緩釋的載藥水凝膠的質(zhì)量/g；m0是載藥水凝膠在緩釋7 h時(shí)累計(jì)釋放益生菌所含蛋白質(zhì)量/mg；m總是載藥水凝膠吸附益生菌所含蛋白總質(zhì)量/mg。

1.3.8 益生菌中蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

由于SGF的pH值較低，在益生菌緩釋過(guò)程中對(duì)益生菌的活性和結(jié)構(gòu)可能有一定的影響，因此無(wú)法用一般的細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定益生菌的含量，故采用溶菌酶溶解益生菌細(xì)胞壁，并配合超聲破碎細(xì)胞[29]，使蛋白質(zhì)溶出，從而通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度間接得到所緩釋益生菌的含量，具體方法如下。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：取13 支試管，1 支作為空白，其余試管分為兩組平行，空白組和實(shí)驗(yàn)組分別加入0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白）溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，并用蒸餾水補(bǔ)充到1 mL，在每個(gè)試管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合均勻，于2 min后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)（Y），蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X/（mg/mL）），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為Y＝38.681 85X－5.653 83×10－4，R2＝0.998 9。

將收集的緩釋介質(zhì)用高速離心機(jī)8 000 r/min離心20 min，倒去上清液，得到菌泥。再加入5 mL的蒸餾水洗滌菌泥，并重復(fù)上述操作得到洗滌后的菌泥，以除去殘留的緩沖液。準(zhǔn)確量取10 mL PBS（pH 7.2）于菌泥中，并加入50 mg溶菌酶，40 ℃酶解60 min，使益生菌細(xì)胞壁破碎，然后再經(jīng)過(guò)500 W冰浴超聲30 min，使蛋白質(zhì)溶出，得到酶解液。準(zhǔn)確量取酶解液1 mL于試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻后靜置2 min，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程計(jì)算得到所測(cè)定益生菌的蛋白質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

實(shí)驗(yàn)中的定量分析進(jìn)行3 次重復(fù)，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，通過(guò)單因素方差分析中的最小顯著差異法進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水凝膠的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

2.1.1 FTIR分析結(jié)果

圖1 PPC、PPCH和PPCH-AA的FTIR圖Fig.1 Fourier transform infrared spectra of PPC, PPCH and PPCH-AA

從 圖1 可 以 看 出，P P C、P P C H 和P P C H-A A 在3 443 cm－1處均有較寬的吸收峰，這屬于纖維素鏈中O—H的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明—OH基團(tuán)、分子內(nèi)和分子間氫鍵是水凝膠的主要結(jié)合鍵；2 925 cm－1處的吸收峰歸因于纖維素的烷基和脂肪族烴中C—H的伸縮振動(dòng)；1 636 cm－1處的尖銳吸收峰主要與纖維素鏈葡萄糖共軛苯環(huán)上的C—O伸縮振動(dòng)有關(guān)；1 452 cm－1處為C—H的彎曲振動(dòng)吸收峰；1 028 cm－1處為C—O—C的不對(duì)稱(chēng)振動(dòng)吸收峰；891 cm－1處的吸收峰由纖維素鏈上的β-糖苷鍵引發(fā)[30-31]。

對(duì)比P P C 和水凝膠的F T I R 圖，發(fā)現(xiàn)水凝膠在1 572 cm－1處有一個(gè)弱吸收峰，這可能是水凝膠中殘留的少量離子液體造成的。與PPC和PPCH相比，水凝膠PPCH-AA在1 718 cm－1處出現(xiàn)新的吸收峰，這主要是歸因于羰基C＝O的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明AA已經(jīng)成功接枝到纖維素鏈上[32]。除此之外，PPC和PPCH、PPCH-AA的紅外吸收峰位置基本一致，表明在利用離子液體BmimCl制備纖維素水凝膠的過(guò)程中未產(chǎn)生新的官能團(tuán)。

2.1.2 XRD分析結(jié)果

圖2 PPC、PPCH和PPCH-AA的XRD圖Fig.2 X-ray diffraction patterns of PPC, PPCH and PPCH-AA

由圖2可知，PPC在2θ為21.7°處出現(xiàn)強(qiáng)衍射吸收峰，在2θ為15.4°和34.6°處出現(xiàn)兩個(gè)相對(duì)較弱的衍射峰，說(shuō)明P P C 在溶解前屬于典型的纖維素I 型晶體[33]。而PPC制備得到的水凝膠PPCH和PPCH-AA在2θ分別為15.4°和34.6°處的衍射峰消失，只在2θ為19°～21°處有一個(gè)強(qiáng)度減弱的寬衍射峰，符合纖維素II型的XRD特征衍射吸收峰[34]，說(shuō)明PPC在溶解的過(guò)程中發(fā)生了由纖維素I型晶體結(jié)構(gòu)向II型的轉(zhuǎn)變。此外，對(duì)比PPC，水凝膠的衍射吸收峰的強(qiáng)度均有所下降，說(shuō)明PPC在離子液體中溶解制備水凝膠的過(guò)程中，其晶體結(jié)構(gòu)遭到破壞，結(jié)晶度有所降低。

2.1.3 微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

圖3 PPC（a）、水凝膠PPCH（b）和PPCH-AA（c）的SEM圖Fig.3 Scanning electron microscope micrographs of PPC (a), PPCH (b)and PPCH-AA (c)

如圖3a所示，PPC呈現(xiàn)明顯的束狀結(jié)構(gòu)，且表面粗糙、布滿(mǎn)褶皺。圖3b、c顯示，水凝膠PPCH和PPCH-AA表面光滑，內(nèi)部呈現(xiàn)致密的多孔結(jié)構(gòu)，形貌結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，這可能是由于纖維素在制備水凝膠的過(guò)程中被溶解和改性，從而導(dǎo)致其晶體結(jié)構(gòu)被破壞，束狀結(jié)構(gòu)消失[35]。

2.2 水凝膠的溶脹性能

圖4a、b、c分別是37 ℃下水凝膠PPCH和PPCH-AA在蒸餾水、SGF、SIF中的溶脹動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。在溶脹初期，水凝膠迅速吸水膨脹，溶脹率增長(zhǎng)速率較快?？偟内厔?shì)是水凝膠在最初的30 min內(nèi)溶脹率增長(zhǎng)速率最快，之后逐漸減緩，約在60 min處溶脹率達(dá)到最高并處于溶脹平衡。PPCH在蒸餾水、SGF、SIF中的平衡溶脹率分別是3 580%、2 180%和2 604%，即吸水能力分別為35.80、21.80、26.04 g/g；PPCH-AA在蒸餾水、SGF、SIF中的平衡溶脹率稍有下降，分別是3 150%、1 664%和2 656%，即吸水能力分別為31.50、16.64 g/g和26.56 g/g。這可能是由于AA的接枝作用強(qiáng)化了水凝膠的交聯(lián)，形成的水凝膠物理剛性提高，使得其對(duì)水的吸附能力有所下降。PPCH和PPCH-AA在SIF中的平衡溶脹率基本相同，而在SGF中，PPCH-AA平衡溶脹率明顯低于PPCH，且明顯低于在SIF中的平衡溶脹率，這是因?yàn)锳A成功接枝到水凝膠中賦予了纖維素鏈大量的—COOH，—COOH在中性或堿性條件下會(huì)電離成—COO—，不影響水凝膠親水基團(tuán)的吸水膨脹；但在酸性條件下，—COOH基團(tuán)不易解離，而是趨向于和纖維素鏈上的羥基形成氫鍵，從而阻止水分子進(jìn)入凝膠網(wǎng)絡(luò)，使得水凝膠的平衡溶脹率大大下降。

圖4 PPCH和PPCH-AA在蒸餾水（a）、SGF（b）、SIF（c）中的溶脹動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.4 Swelling kinetic curves of PPCH and PPCH-AA in distilled water (a), simulated gastric fluid (b), and simulated intestinal fluid (c)

2.3 水凝膠的pH敏感性

圖5 水凝膠PPCH和PPCH-AA的pH敏感性Fig.5 pH sensitivity of PPCH and PPCH-AA

由圖5可知，在同一溫度（37 ℃）下，兩種水凝膠的平衡溶脹率都隨著溶液pH值增大而增加，兩種水凝膠的溶脹率差異主要表現(xiàn)在酸性環(huán)境中。在低pH值溶液中，PPCH-AA的平衡溶脹率較低。其中PPCH-AA具有更明顯的pH敏感性，平衡溶脹率由pH 1.0的1 500%提高到pH 7.0的2 700%；而在同一pH值變化范圍內(nèi)，PPCH的平衡溶脹率變化范圍是2 200%～2 550%。這是由于在酸性條件下，PPCH-AA的—COOH基團(tuán)不易解離成—COO—基團(tuán)與H+，增加了—COOH基團(tuán)之間的氫鍵作用，交聯(lián)作用得到強(qiáng)化，水親和性減弱，從而限制了水分子進(jìn)入水凝膠內(nèi)部，導(dǎo)致其在較低pH值時(shí)溶脹率低的現(xiàn)象。隨著介質(zhì)pH值的增加，溶液中的H+濃度降低，—COOH解離成—COO—，增加了水凝膠的親水性，從而使水凝膠的溶脹率增加。

2.4 水凝膠的緩釋性能

圖6 負(fù)載益生菌的水凝膠PPCH（a）和PPCH-AA（b）在SGF和SIF中的緩釋Fig.6 Sustained release of probiotics-loaded PPCH (a) and PPCH-AA (b) in SGF and SIF

水凝膠的緩釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，其中負(fù)載益生菌的PPCH和PPCH-AA在SGF中420 min內(nèi)的累計(jì)釋放量分別為44.11 mg/g和16.7 mg/g，釋放率分別為66.17%和25.05%；在SIF中420 min內(nèi)的累計(jì)釋放量分別為59.25 mg/g和58.01 mg/g，釋放率分別為88.87%和87.02%。由此可知，兩種水凝膠在SIF的累積緩釋量均大于其在SGF中的累積緩釋量，其中，PPCH-AA在兩種緩沖溶液中的緩釋差異更為明顯。負(fù)載益生菌的PPCH在SGF和SIF中的累積釋放在240 min內(nèi)基本達(dá)到平衡，釋放過(guò)程相似。但是在同一時(shí)間段內(nèi)，PPCH-AA在SGF和SIF的累積釋放表現(xiàn)出較大差異。在SGF中，PPCH-AA的累積釋放在60 min即達(dá)到平衡，而在SIF中，PPCH-AA的累積釋放在120 min后仍具有增加的趨勢(shì)。這是因?yàn)镻PCH-AA具有pH敏感性，當(dāng)它處于SGF中時(shí)，由于pH值較低，水凝膠的水親和性降低，溶脹度低，結(jié)構(gòu)緊密，網(wǎng)絡(luò)孔徑較小，水分子進(jìn)出水凝膠難度加大，不利于益生菌的釋放；當(dāng)水凝膠在SIF中緩釋時(shí)，水凝膠的溶脹率大大增加，吸水膨脹，使三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的孔徑增大，水分子進(jìn)出水凝膠的難度降低，在滲透壓的作用下，促進(jìn)了益生菌的釋放，累積釋放量大大增加。

3 討 論

以PPC為原料，利用離子液體BmimCl制備PPCH和接枝AA的pH敏感性水凝膠PPCH-AA。FTIR分析結(jié)果表明水凝膠PPCH-AA出現(xiàn)了屬于羰基的特征吸收峰，說(shuō)明PPC在離子液體中與AA接枝成功；XRD分析結(jié)果表明纖維素在制備水凝膠的過(guò)程中，由纖維素I型晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)镮I型，結(jié)晶度有所降低；SEM圖顯示纖維素制備成水凝膠后，原來(lái)的束狀結(jié)構(gòu)消失，表面光滑平整，內(nèi)部呈現(xiàn)致密的多孔結(jié)構(gòu)。

水凝膠溶脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PPCH相比，PPCH-AA在SIF中的溶脹率遠(yuǎn)高于其在SGF中的溶脹率，表現(xiàn)出明顯的pH敏感性，可以用于益生菌的控釋。水凝膠的緩釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與負(fù)載益生菌的PPCH相比，負(fù)載益生菌的PPCH-AA在SIF中420 min的累計(jì)釋放量遠(yuǎn)高于其在SGF的累計(jì)釋放量，累計(jì)釋放量為58.01 mg/g，釋放率可達(dá)87.02%，表明PPCH-AA可以作為益生菌的運(yùn)送載體，減少其在胃內(nèi)的釋放，增加其在腸道內(nèi)的定植數(shù)量。

為了保護(hù)益生菌的活性，國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于其運(yùn)送載體的研究。de Silva等[36]通過(guò)復(fù)合凝聚和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行封裝，暴露于模擬胃腸道時(shí)，可存活細(xì)胞數(shù)高達(dá)9.07（lg（CFU/g）），葡萄糖轉(zhuǎn)氨酶的加入增加了微膠囊的熱、貯藏穩(wěn)定性，能夠更好地保護(hù)益生菌。該實(shí)驗(yàn)與本研究的目的相同，說(shuō)明包埋可以有效保護(hù)益生菌，但是該研究制備的微膠囊不具有環(huán)境響應(yīng)性，在胃和腸道內(nèi)的釋放無(wú)差異性，而本研究所采用的包埋材料具有pH敏感性，可以減少其在胃內(nèi)的釋放，從而降低胃酸對(duì)益生菌的影響。但本實(shí)驗(yàn)缺少對(duì)益生菌活性的研究，之后可以進(jìn)一步研究水凝膠制備方法對(duì)益生菌在腸道內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)量的影響。