魯歡， 張禮財， 宋超， 肖珊珊， 湯水福， 陳剛毅， 吳興波， 羅月中

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）是一類自身免疫性疾病[1]，其中，原發(fā)性膜性腎病（primary membranous nephropathy，pMN）是成人腎病綜合征最常見的病理類型[2]。近10余年來，pMN的發(fā)病機制研究獲得重大突破，M 型磷脂酶A2 受體（M-type phospholipase A2 receptor，PLA2R）和Ⅰ型血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)域7A作為pMN的主要靶抗原，廣泛應(yīng)用于臨床，對應(yīng)的抗體檢測不僅有助于與繼發(fā)性MN相鑒別，還能預(yù)測疾病的發(fā)展趨勢和治療轉(zhuǎn)歸。然而，由于靶抗原的致病機制仍未完全闡明，治療方案較前并無明顯變化。近年來自全國范圍的MN 流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國MN 患病率呈明顯上升趨勢，且在我國北方和東北，MN的患病率在2014 年以后已經(jīng)超過了IgA 腎病，位居原發(fā)性腎小球病的首位[3-4]。因此，探索預(yù)防和治療MN的有效手段具有重要意義。本課題組前期研究結(jié)果提示MN與脾腎陽虛相關(guān)，臨床上使用溫陽利水方療效確切，離體實驗證實溫陽利水方水提物可改善脾腎陽虛特發(fā)性膜性腎?。↖MN）患者血清致小鼠足細(xì)胞骨架蛋白F-actin 重排，調(diào)節(jié)p53和Bcl-2的表達(dá)，緩解足細(xì)胞損傷[5-7]。

本研究擬構(gòu)建陽離子化牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA）MN大鼠模型，用溫陽利水方灌胃干預(yù)，進(jìn)一步驗證和探索溫陽利水方的在體療效和機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1. 1實驗動物雄性SD 大鼠（180 ± 20）g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[合格證號：SCXK（粵）2013-0034]。7 d 檢疫期后，轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)間，開始實驗。動物實驗方案已通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核（ZYYECK 【2018】047），并遵循《赫爾辛基宣言》。

1. 2實驗細(xì)胞MPC5 小鼠足細(xì)胞系，由美國Baylor醫(yī)學(xué)院Danesh教授惠贈，廣東省人民醫(yī)院史偉教授轉(zhuǎn)贈。

1.3藥物溫陽利水方組成：制附子15 g，黃芪30 g，白術(shù)45 g，白芍30 g，茯苓30 g，生姜15 g。貝那普利（諾華集團(tuán)，批號：X2606）。以上藥物均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.4試劑與儀器RPMI-1640 培養(yǎng)基、Ⅰ型鼠尾膠原（美國Corning 公司）；澳洲胎牛血清、0.5 g/L胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；重組小鼠干擾素γ（IFN-γ）（以色列ProSpec 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、青-鏈霉素溶液（美國Hyclone 公司）； 細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）（日本Dojindo 公司）；腎足蛋白（nephrin）檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）（武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，貨號：SEA937Ra）；PCR Forward Prime、PCR Reverse Prime（美國Invitrogen公司）；RNA Extraction Kit、Prime ScriptTMRT Master Mix、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa 公司）。CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab 公司）；高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；多功能酶標(biāo)儀、微量檢測板（美國Thermo Scientific 公司）；電子細(xì)胞計數(shù)儀、計數(shù)板、T-100 regular PCR儀、實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；自動生化分析儀（瑞典Roche 公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；JEM-1400 PLUS 電子透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)MPC5 小鼠足細(xì)胞復(fù)蘇后，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、33 ℃培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)增殖4～5 d。待細(xì)胞生長融合至80%～85%，使用0.5 g/L胰蛋白酶消化后，傳代至包被Ⅰ型鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，再轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，誘導(dǎo)分化8～14 d，分化成熟后可進(jìn)行后續(xù)實驗。具體步驟參見文獻(xiàn)[8]。

2.2溫陽利水方水提物的制備加6 倍量超純水分別浸泡制附子及其余藥物30 min，制附子先煎1 h，再加入其余藥物及浸泡液共煎，收集濾液。加4倍量超純水再次煎煮，收集濾液。合并2次濾液，反復(fù)過濾除渣，以8 000 r/min 離心5 min，過濾，以80 ℃減壓，濾液濃縮至浸膏，超純水定容至165 mL。過針頭濾器， 除顆粒雜質(zhì)、滅菌。于-20 ℃保存?zhèn)溆?。具體步驟參見文獻(xiàn)[6]。

2. 3溫陽利水方含藥血清的制備將SD 大鼠48 只隨機分為4 組，即對照組和溫陽利水方低、中、高濃度組。其中，每組大鼠再隨機分為3 組，分別命名為3 d、5 d和7 d組。根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”，以臨床劑量換算大鼠用藥劑量，折算系數(shù)為6.3，溫陽利水方低、中、高濃度組分別按劑量8.25、16.50、33.00 g·kg-1·d-1灌胃。對照組則給予等體積蒸餾水灌胃。各組將每日劑量等分，于9∶00和16∶00分別灌胃1次，按照時間組別依次連續(xù)灌胃3 d、5 d 和7 d。灌胃結(jié)束后，以100 g/L 水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血，以3 000 r/min，4 ℃離心15 min 分離血清，混合同組血清。以0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，56 ℃恒溫水浴滅活30 min，于-80 ℃冰箱存儲備用。

2. 4 CCK-8篩選溫陽利水方水提物灌胃濃度和時間取分化成熟的P22 足細(xì)胞，同步化24 h 后，以0.5 g/L胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，以8 000個細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，加含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基至100 μL。培養(yǎng)24 h后，換液。分別設(shè)對照組，溫陽利水方低、中、高濃度組，每組內(nèi)再設(shè)3 d、5 d 和7 d 組。按照分組，每孔加入提前配制的含體積分?jǐn)?shù)10%對照組大鼠血清或溫陽利水方含藥血清的培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)5 個復(fù)孔。培養(yǎng)20 h 后，每孔加CCK-8 10 μL，共孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度（OD）。將不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基空白孔調(diào)零。

2.5 MN大鼠模型構(gòu)建、分組和干預(yù)經(jīng)過檢疫期后，將大鼠置于代謝籠內(nèi)，留取尿液測定24 h尿蛋白定量（UTP），符合標(biāo)準(zhǔn)者，進(jìn)入正式實驗。實驗分為4組，分別為對照組、模型組、溫陽利水方組、貝那普利組，每組6只大鼠。模型組、溫陽利水方組、貝那普利組大鼠采用C-BSA 尾靜脈注射4 周構(gòu)建MN 模型[9]，同期，對照組大鼠給予等量生理鹽水尾靜脈注射。造模成功后，對照組和模型組：給予雙蒸水灌胃，2.5 mL/次，每日2次，連續(xù)4周；溫陽利水方組：根據(jù)CCK-8篩選結(jié)果，按照16.50 g·kg-1·d-1劑量灌胃，雙蒸水稀釋，2.5 mL/次，每日2 次，連續(xù)4 周；貝那普利組：按照10.00 mg·kg-1·d-1劑量灌胃，雙蒸水稀釋，2.5 mL/次，每日2次，連續(xù)4周。

2.6指標(biāo)檢測

2.6.1 一般情況觀察 在開始灌胃后，觀察大鼠進(jìn)食量、對灌胃的接納情況、毛發(fā)光澤度、小便量、大便質(zhì)地。

2.6.2 血生化指標(biāo)檢測 干預(yù)結(jié)束后，代謝籠收取24 h 尿液后，以100 g/L 水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血，分離血清。應(yīng)用Cobas6000自動生化分析儀檢測尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、總膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），采用溴甲酚綠法檢測血清白蛋白（ALB），采用計算法測定血清球蛋白（GLO）。

2.6.3 UTP 檢測 在造模結(jié)束、灌胃第2 周和灌胃第4周，均使用代謝籠收取大鼠24 h尿液，采用化學(xué)比濁法檢測UTP水平。

2.6.4 腎臟病理檢測 干預(yù)結(jié)束后，以100 g/L水合氯醛麻醉大鼠，剖腹取右側(cè)腎臟，剝離腎包膜和非腎組織，生理鹽水沖洗，切塊，分別保存于光鏡固定液、電鏡固定液。光鏡標(biāo)本：梯度脫水、浸蠟包埋，常規(guī)切片，分別行蘇木素-伊紅（HE）、馬松（Masson）、過碘酸六胺銀（PASM）染色后，在光鏡下觀察。電鏡標(biāo)本：清洗、1%鋨酸固定、清洗、梯度脫水、樹脂滲透包埋、固化、切片、鈾鉛雙染色，電鏡下觀察。

2.6.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測腎皮質(zhì)nephrin mRNA表達(dá) 干預(yù)結(jié)束后，以100 g/L水合氯醛麻醉大鼠，剖腹取右側(cè)腎臟，剝離腎包膜和非腎組織，生理鹽水沖洗，切塊，分離腎皮質(zhì)，保存于液氮罐中。按照試劑盒操作說明提取腎皮質(zhì)總RNA，測定其在230、260、280、320 nm處的OD 值，并計算濃度。取適量總RNA 行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測總RNA 的完整性。取符合條件的總RNA 溶液，按照操作說明，配制20 μL體系行逆轉(zhuǎn)錄，配制25 μL 體系行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 min、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 min，共進(jìn)行40個循環(huán)。內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為5’-CTCTACCCACGCCAAGTTCAA-3’，下游引物序列為5’-GGATGACCTTGCCCACAGC-3’；nephrin 上游引物序列為5’-CTGACTGGGCTG AAGCCTTCT-3’，下游引物序列為5’-AAGAGCA CAGGCAGCAGGGG-3’[10]。實驗重復(fù)3 次，每個樣本、每個基因均采用3個復(fù)孔，采用雙△Ct的方法計算目的基因表達(dá)量，結(jié)果以2-△△Ct表示。

2. 6. 6 酶聯(lián)免疫吸附法檢測尿液nephrin 蛋白含量 干預(yù)結(jié)束后，代謝籠收取大鼠24 h 尿液。以2 000×g離心15 min后收集上清液，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用nephrin檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）檢測大鼠尿液nephrin蛋白含量。按照試劑盒說明書，逐步操作。

2.7統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)表示，計數(shù)資料以相對數(shù)表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CCK-8法篩選溫陽利水方水提物灌胃濃度和時間的結(jié)果對照組與溫陽利水方低、中、高濃度組對應(yīng)時間組比較，3 d 組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），且對照組OD 值均較含藥血清組高，提示3 d含藥血清可能抑制足細(xì)胞增殖；5 d組中，中濃度組OD 值較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余2 組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示5 d中濃度組含藥血清可能促進(jìn)足細(xì)胞增殖；7 d 組中，對照組OD 值均較含藥血清組高，且低、高濃度組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），提示7 d 含藥血清可能抑制足細(xì)胞增殖。故選取中濃度作為灌胃濃度，5 d 作為灌胃時間，用于后續(xù)實驗。具體結(jié)果見表1。

表1 不同濃度溫陽利水方含藥血清處理不同時間對足細(xì)胞增殖的影響（CCK-8法）Table 1 Effects of different contents of serumcontaining YDR treatment for different times on proliferation of podocytes（by CCK-8） （±s）

表1 不同濃度溫陽利水方含藥血清處理不同時間對足細(xì)胞增殖的影響（CCK-8法）Table 1 Effects of different contents of serumcontaining YDR treatment for different times on proliferation of podocytes（by CCK-8） （±s）

①P<0.05，與對照組比較

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3.2 MN大鼠與對照組大鼠血生化指標(biāo)比較造模結(jié)束后，MN 大鼠血清SCr、GLO、CHOL、TG、LDL-C 水平均明顯升高，除TG 外，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；血清ALB 明顯下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。具體結(jié)果見表2。

表2 造模后膜性腎?。∕N）模型組與對照組大鼠血生化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of the biochemical indexes between MN model group and control group after modeling （±s）

表2 造模后膜性腎?。∕N）模型組與對照組大鼠血生化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of the biochemical indexes between MN model group and control group after modeling （±s）

①P<0.05，與對照組比較

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3.3溫陽利水方對MN大鼠一般情況的影響與模型組比較，在4周的灌胃過程中，溫陽利水方組大鼠食欲增加、不抗拒灌胃、毛發(fā)有光澤且脫毛減少、小便量多、大便成形、水腫減輕。

3.4溫陽利水方對MN大鼠UTP的影響在造模結(jié)束后、灌胃2周和灌胃4周，分別檢測各組大鼠UTP水平。結(jié)果顯示：灌胃2周，溫陽利水方組和貝那普利組大鼠UTP 均明顯下降，但組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；灌胃4 周，溫陽利水方組和貝那普利組大鼠UTP 繼續(xù)下降，組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

3.5溫陽利水方對MN大鼠腎組織病理的影響灌胃4周后，與模型組比較，溫陽利水方組和貝那普利組大鼠腎小球基底膜增厚減輕，嗜復(fù)紅蛋白沉積減少，足突變形和融合緩解，腎小管上皮細(xì)胞水腫改善，蛋白管型減少，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤減輕。見圖2和圖3。

3.6溫陽利水方對MN大鼠腎皮質(zhì)nephrin mRNA表達(dá)和尿液nephrin蛋白含量的影響灌胃4 周后，模型組大鼠腎皮質(zhì)nephrin mRNA 相對表達(dá)量較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；溫陽利水方組大鼠nephrin mRNA 相對表達(dá)量較模型組減少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；貝那普利組大鼠nephrin mRNA 相對表達(dá)量較模型組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。模型組大鼠尿液nephrin 蛋白含量較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；溫陽利水方組和貝那普利組大鼠尿液nephrin 蛋白含量均較模型組減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且2 個治療組比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。具體結(jié)果見表3。

圖1 溫陽利水方組和貝那普利組大鼠UTP變化折線圖Figure 1 The line chart for UTP in YDR group and benazepril group

圖2 灌胃4周后各組大鼠腎組織病理光鏡圖Figure 2 Comparison of the renal histopathological features under light microscope in various groups after 4 weeks of intragastric administration

表3 灌胃4周后各組大鼠腎皮質(zhì)nephrin mRNA和尿液nephrin蛋白檢測結(jié)果Table 3 Comparison of the expression levels of nephrin mRNA in renal cortex and nephrin protein in urine from rats in various groups after 4 weeks of intragastric administration （±s）

表3 灌胃4周后各組大鼠腎皮質(zhì)nephrin mRNA和尿液nephrin蛋白檢測結(jié)果Table 3 Comparison of the expression levels of nephrin mRNA in renal cortex and nephrin protein in urine from rats in various groups after 4 weeks of intragastric administration （±s）

①P < 0.05，與對照組比較；②P < 0.05，與模型組比較；③P<0.05，與貝那普利組比較

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4 討論

膜性腎?。∕N），常見的主要臨床表現(xiàn)是大量蛋白尿、全身重度水腫。部分患者在起病初期或疾病復(fù)發(fā)時伴有急性腎損傷，少尿，可加重全身水腫，尤其是胃腸道水腫，可導(dǎo)致患者納差、嘔吐，影響藥物吸收，推遲免疫抑制劑起效時間；藥物無法緩解的重度水腫，隨著患者SCr 逐步上升，或者出現(xiàn)心力衰竭的并發(fā)癥，需要行血液透析治療；MN患者的高凝狀態(tài)，使得臨時血液透析通路的建立，進(jìn)一步增加了深靜脈血栓的患病率，加重了治療難度和患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此，對于MN 初期或復(fù)發(fā)期，在現(xiàn)有治療手段的基礎(chǔ)上，探索更有效的干預(yù)措施，減少并發(fā)癥的發(fā)生，仍然具有重大的臨床意義。本課題組的羅月中教授在30 余年的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)IMN 初期或復(fù)發(fā)期中醫(yī)辨證以脾腎陽虛證為主[7]，與多數(shù)研究[11-13]結(jié)論一致，配合使用溫陽利水方，不僅可以改善患者納差易吐的癥狀、增加尿量，還能減少患者上呼吸道感染的機率，促進(jìn)患者平穩(wěn)進(jìn)入緩解期。在前期體外研究[6]基礎(chǔ)上，繼續(xù)探索溫陽利水方體內(nèi)療效和機制，具有一定的臨床意義。

本研究采用C-BSA尾靜脈注射法構(gòu)建MN大鼠模型，結(jié)果顯示，造模結(jié)束后，MN 大鼠的SCr、GLO、CHOL、TG、LDL-C、UTP 水平均明顯升高，ALB 水平明顯下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（TG 除外），又見電鏡下基底膜增厚、足突融合[5]，提示造模成功。既往對IMN患者的臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)，脾腎陽虛組患者血清GLO 和抗PLA2R 水平均較高，且二者呈正相關(guān)，提示脾腎陽虛組患者免疫活動和炎癥狀態(tài)明顯[14-16]。本研究結(jié)果顯示：造模后MN大鼠GLO較對照組亦顯著升高。使用溫陽利水方干預(yù)后，與模型組比較，溫陽利水方組大鼠食欲增加、不抗拒灌胃、脫毛減少、小便量多、大便成形、完全存活，灌胃2周末和4 周末UTP 均呈下降趨勢（且與貝那普利組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義），腎組織病理學(xué)結(jié)果可見腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤亦明顯減輕，提示溫陽利水方可調(diào)節(jié)MN的免疫活動和炎癥狀態(tài)。

足細(xì)胞損傷、腎小球濾過屏障受損，出現(xiàn)蛋白尿，是MN典型的病理改變。溫陽利水方是否可調(diào)節(jié)足細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)？Park等[17]對小鼠腎臟細(xì)胞分類后，行單細(xì)胞測序分析，證實與人類蛋白尿單基因遺傳病相關(guān)的基因，尤其是nephrin 和podocin，僅在足細(xì)胞表達(dá)。nephrin 是足細(xì)胞裂孔隔膜（SD）蛋白復(fù)合物的主要分子，通過CD2 相關(guān)蛋白（CD2AP）、podocin 與細(xì)胞骨架蛋白actin 連接。因此，檢測nephrin 可較直觀地反映藥物對足細(xì)胞的影響。本研究中，模型組大鼠腎組織nephrin mRNA 表達(dá)水平增加，腎組織病理損傷明顯，使用溫陽利水方和貝那普利干預(yù)后，腎組織nephrin mRNA 表達(dá)水平均下降，腎組織病理損傷減輕、尿蛋白減少。結(jié)合前期體外研究[6]，溫陽利水方水提物可改善脾腎陽虛IMN 患者血清致小鼠足細(xì)胞骨架蛋白F-actin 重排，提示增多的nephrin 可能擾亂了actin 正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致足突功能失常，出現(xiàn)蛋白尿等病理改變。既往已有研究[18-20]發(fā)現(xiàn)，損傷因素作用下，nephrin 在足細(xì)胞分布改變，但增加的nephrin 并不能發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞的作用。

綜上所述，溫陽利水方可改善MN模型大鼠水腫，減少尿蛋白，抑制腎小球免疫復(fù)合物的沉積和基底膜的增厚，減輕腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤。溫陽利水方可能是通過降低nephrin mRNA 的異常表達(dá)從而維持足突生理功能、減少尿nephrin 的排泄發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用，從而有效治療MN。

（致謝：感謝中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科董愉教授！感謝廣東省人民醫(yī)院史偉教授、章斌教授和張麗主治醫(yī)師?。?/p>