蘇山春，汪 明

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

氨肽酶是一類外切蛋白酶，廣泛參與調(diào)控生物體的多肽修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生理過程[1]。根據(jù)同源性和催化機(jī)制，氨肽酶可以分為12個家族。嘌呤霉素敏感氨肽酶1(Purinomycin-sensitive aminopeptidase 1，Pam-1)是M1氨肽酶家族的成員，Pam-1 突變破壞了減數(shù)分裂和有絲分裂染色體的有效分離以及胚胎早期極性決定因素的不對稱定位，最終阻礙胚胎活力和整體孵化率[2]。包括Pam-1在內(nèi)，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，C.elegans)中有17個基因編碼氨肽酶。RNA干擾敲低Y67D8C.9、T16G12.1和T12E12.6等氨肽酶基因的表達(dá)水平，導(dǎo)致C.elegans產(chǎn)卵總數(shù)降低，而抑制C42C1.11、R03G8.4、ZC416.6和ANP-1等氨肽酶的表達(dá)，C.elegans產(chǎn)卵總數(shù)無顯著降低[3]。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，ANP-1、C42C1.11、R03G8.4、ZC416.6與Y67D8C.9、T16G12.1和 T12E12.6位于不同的進(jìn)化分支，它們在C.elegans生長發(fā)育中可能發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。GFP報告基因結(jié)果表明，ANP-1在C.elegans腸道、咽部、尾部神經(jīng)元和其他分泌細(xì)胞均表達(dá)[4]，推測anp-1基因在C.elegans生長發(fā)育中具有其他生物學(xué)功能。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異基因沉默現(xiàn)象。C.elegans以細(xì)菌為食物，因此，在C.elegans基因功能研究中，通過飼喂表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌沉默特定基因是一種有效的策略[5-7]。本試驗通過構(gòu)建anp-1 RNAi菌株，飼喂C.elegans，觀察分析C.elegans表型變化，初步揭示氨肽酶基因anp-1在C.elegans生長發(fā)育中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑E.coliHT115(DE3)菌株和DH5α-L4440菌株由河北大學(xué)柳峰松教授饋贈，由本實驗室凍存。質(zhì)粒小量提取試劑盒(DP103，離心柱型)和PCR產(chǎn)物回收試劑盒(DP204)，均購自天根生化科技有限公司；TransScript II Green One-Step qRT-PCR Super Mix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen Biotech)；TRIzol，購自Life Technologies Corporation；TaqDNA Polymerase和T4 DNA Ligase，均購自大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司(TaKaRa)；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和Hind Ⅲ，購自NEB公司；DNA Marker和Gold View，均購自中科瑞泰生物科技有限公司；瓊脂粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)和氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)等試劑為進(jìn)口分裝產(chǎn)品；5-氟脫氧尿苷(5-fluorodeoxyuridine，5-FUDR)，購自SIGMA-ALDRICH公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2anp-1 RNAi載體構(gòu)建 根據(jù)anp-1(WBGene-00011587)全長序列設(shè)計特異性引物，序列如下：anp-F：5′-TGCTCTAGACACTTCGTACTGACATGTCGG-3′；anp-R：5′-CCCAAGCTTTCCATAGCACCAGCTGAGAA-G-3′，預(yù)測產(chǎn)物大小為499 bp。斜體為保護(hù)堿基，斜體下劃線為酶切位點：上游XbaⅠ；下游：Hind Ⅲ。按照 TRIzol 說明書提取混合生長期C.elegans總 RNA，反轉(zhuǎn)錄后收集 cDNA作為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 35 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，16 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用PCR產(chǎn)物回收試劑盒收集。上述回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，克隆到L4440質(zhì)粒。菌落PCR鑒定的HT115-L4440-anp-1陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序正確的單克隆-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3C.elegans食物準(zhǔn)備 從-80 ℃冰箱取出凍存的E.coliOP50、HT115-L4440(空載體)和HT115-L4440-RNAi菌株，快速解凍，分別取50 μL加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(有抗性的菌加入氨芐青霉素100 μg/mL)，做好標(biāo)記，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～16 h進(jìn)行活化。取活化好的細(xì)菌培養(yǎng)物3 mL， 滴加到線蟲生長基質(zhì)(Nematode growth media，NGM)培養(yǎng)基上(含或不含IPTG 和Amp)，用無菌L棒涂布，正置靜置至液體被完全吸收，做好標(biāo)記，倒置，37 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)12～16 h，菌苔即可作為食物用于飼喂C.elegans。

1.4C.elegans同步 參考Yu等[8]報道的方法進(jìn)行C.elegans蟲卵同步化處理。將裂解蟲體得到的蟲卵用適量的M9 Buffer重懸，加入到50 mL三角瓶中，加入15 mL M9 Buffer，將三角瓶置于搖床，37 ℃ 200 r/min孵育16～20 h。吸取少量的溶液，顯微鏡下觀察孵育到L1期幼蟲的數(shù)量。將三角瓶取出，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，靜置，使L1期幼蟲沉降，盡量吸取上清并棄去，用適量的M9 Buffer重懸L1期幼蟲。根據(jù)飼喂菌株的不同將同步的L1期幼蟲分為4個試驗組，分別為E.coliOP50組、HT115-L4440(未經(jīng)IPTG誘導(dǎo))組、HT115-L4440(1 mmol/LIPTG 誘導(dǎo))組和HT115-L4440-anp-1組，在文中分別用OP50、IPTG 0 mmol/L、IPTG 1 mmol/L和RNAi表示。

1.5C.elegans總產(chǎn)卵數(shù)計數(shù)、體長和壽命分析 將同步的L1期幼蟲分別置于不同菌株的9 cm NGM培養(yǎng)基上(含或不含抗生素和IPTG)，做好標(biāo)記，20 ℃ 恒溫箱靜置培養(yǎng)48 h左右至L4期幼蟲。用酒精燈灼燒的挑蟲針調(diào)取1條L4期幼蟲轉(zhuǎn)移至新的3 cm NGM培養(yǎng)基上(含或不含IPTG和抗生素)，每8 小時轉(zhuǎn)移1次，轉(zhuǎn)移到新的3 cm NGM培養(yǎng)基上，直到不再產(chǎn)卵，統(tǒng)計每條C.elegans的總產(chǎn)卵數(shù)，分析結(jié)果。每組10條L4期幼蟲，試驗重復(fù)3次。用酒精燈灼燒的挑蟲針調(diào)取30條L4期幼蟲轉(zhuǎn)移至滴加有疊氮鈉(50 μL 20 mmol/L)的載玻片，室溫靜置，使C.elegans蟲體僵直，Ziss Discovery v12拍攝照片，用顯微鏡自帶軟件測量C.elegans蟲體長度，統(tǒng)計分析結(jié)果。試驗重復(fù)3次。用酒精燈灼燒的挑蟲針調(diào)取50條L4期幼蟲轉(zhuǎn)移至新的涂布不同菌株的9 cm NGM培養(yǎng)基上(含有5-氟脫氧尿苷，含或不含抗生素和IPTG)，每12 小時觀察1次，將死亡的C.elegan移除。每24 小時將活著的C.elegans轉(zhuǎn)移至新的NGM培養(yǎng)基上，直到C.elegans全部死亡。C.elegans死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：挑蟲針輕輕觸碰蟲體無反應(yīng)。試驗完成后統(tǒng)計并繪制死亡曲線。試驗重復(fù)3次。

1.6 熒光定量PCR 選取在C.elegans壽命調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的基因 (daf-2、age-1、daf-16、daf-28、glp-1、unc-62、ins-1和ins-7)，利用Primer Primer 5設(shè)計特異性引物。引物序列見表1。熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：50 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2—△△CT法計算不同基因在以不同細(xì)菌為食物的C.elegans中的相對表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析C.elegans體長、總產(chǎn)卵數(shù)和生存曲線數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。體長、總產(chǎn)卵數(shù)和不同飼喂組mRNA相對表達(dá)量采用單因素方差分析(One-way analysis of variance，ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。C.elegans生存曲線采用log-rank 法(Mantel-Cox)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 RNAi沉默anp-1基因效率驗證 菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，成功構(gòu)建HT115-L4440-anp-1 RNAi菌株(圖1A)。為了驗證anp-1沉默效率，提取以不同株細(xì)菌為食物的L4期C.elegans的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR試驗。結(jié)果顯示，RNAi 組anp-1基因mRNA相對表達(dá)量比OP50組減少了約85%，差異極顯著(P<0.001)(圖1B)，表明構(gòu)建的RNAi菌株可以用于后續(xù)的anp-1基因沉默試驗。

2.2 RNAi 敲低anp-1基因?qū)е翪.elegansN2株總產(chǎn)卵數(shù)(Brood size)變化 為了觀察沉默anp-1基因?qū).elegans總產(chǎn)卵數(shù)的影響，分別以E.coliOP50、HT115-L4440(未經(jīng)IPTG誘導(dǎo))、HT115-L4440(1 mmol/L IPTG誘導(dǎo))和HT115-L4440-anp-1(1 mmol/L IPTG誘導(dǎo))菌株飼喂野生型C.elegans，每天將C.elegans轉(zhuǎn)移到新的NGM平板上，直到其不再產(chǎn)卵，記錄并統(tǒng)計總產(chǎn)卵數(shù)(n=10)：OP50組為203±30；IPTG 0 mmol/L組為213±33；IPTG 1 mmol/L組為210±26；RNAi組為169±32。圖2可見，抑制anp-1基因表達(dá)，C.elegans總產(chǎn)卵數(shù)減少，但與OP50組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers for real-time PCR

圖1 anp-1 RNAi陽性克隆鑒定及其干擾效率驗證Fig.1 Identification of anp-1 RNAi clone and RNAi efficiencyA：M：DL-2 000 DNA marker； 1～7：anp-1 RNAi 克隆鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果； B：qRT-PCR驗證anp-1基因沉默效率***：P<0.001； 下圖同A:M:DL-2 000 DNA marker; 1～7:Agarose gel electrophoresis analysis of anp-1 RNAi clone; B:Identification of RNAi efficiency using qRT-PCR***: P<0.001. The same as below

圖2 RNAi沉默anp-1導(dǎo)致C. elegans N2株產(chǎn)卵數(shù)變化Fig.2 Knocked down anp-1 gene using RNAi changed the brood size of C. elegans N2 strain

2.3 沉默anp-1基因?qū)е翪.elegansN2株體長(Body zise)變化 以不同細(xì)菌為食物飼喂同步的C.elegansL1期幼蟲，測定其生長至L4期(或青年成蟲期)的體長(n=50)，驗證沉默anp-1基因?qū).elegans生長發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：OP50 組體長為(627.2±44.5)μm；IPTG 0 mmol/L組、IPTG 1 mmol/L組和RNAi組體長分別為(653.2±46.8) μm、(667.8±31.6)μm 和(573.7±39.7)μm。ANOVA分析表明,OP50 組L4期幼蟲體長大于RNAi 組，差異極顯著(P<0.001)(圖3)。

圖3 RNAi沉默anp-1導(dǎo)致C. elegans N2株L4期幼蟲體長變化Fig.3 Knocked down anp-1 gene using RNAi changed the body size of C. elegans N2 strain (L4 larve)

2.4 RNAi沉默anp-1基因?qū)е翪.elegansN2株壽命(Lifespan)變化 挑取同步的L1期C.elegans幼蟲50條置于長有不同菌苔的NGM(3 cm，含或不含抗生素和IPTG)平皿上，每天觀察記錄并移走死亡的C.elegans，直到所有C.elegans死亡，統(tǒng)計死亡率并繪制生存曲線。各個組的死亡中位數(shù)(Median survival)分別為OP50 組18 d，IPTG 0 mmol/L組20 d，IPTG 1 mmol/L組18 d，RNAi 組 16 d。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與OP50 組相比，RNAi組的死亡中位數(shù)時間減少了11%，差異極顯著(P<0.001)(圖4)。

圖4 RNAi沉默anp-1導(dǎo)致C. elegans N2株壽命變化Fig.4 Knocked down anp-1 gene using RNAi changed the lifespan of C. elegans N2 strain

2.5C.elegans壽命調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)量變化 沉默anp-1基因?qū)е翪.elegans壽命顯著縮短，為探究anp-1基因與壽命調(diào)控相關(guān)基因之間的調(diào)控關(guān)系，選取在C.elegans壽命調(diào)控中發(fā)揮重要作用的相關(guān)基因，例如daf-16、daf-2、daf-28、age-1等進(jìn)行熒光定量PCR試驗。如圖5所示，沉默anp-1基因，daf-2和daf-28基因的相對表達(dá)量在RNA干擾組和OP50組無顯著差異(P>0.05)；RNAi組age-1基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；RNAi組daf-16基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。

此外，還選取腸道調(diào)控基因以及其他信號通路中可能受到腸道基因調(diào)控的基因，驗證沉默anp-1基因后其表達(dá)量變化。熒光定量PCR結(jié)果表明(見圖5)，沉默anp-1基因，ins-1和glp-1基因的相對表達(dá)量在RNAi組和OP50組無顯著差異(P>0.05)；ins-7基因在RNAi組相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)；unc-62基因在RNAi組相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖5 RNAi 沉默anp-1介導(dǎo)的壽命調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)量變化Fig.5 Knocked down anp-1 gene using RNAi changed relative expression of genes regulating longevity*：P<0.05

3 討論

氨肽酶在C.elegans等生物體生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[9]。Joshua G W等和 Malagon D等分別報道了氨肽酶在C.elegans和其他線蟲中的生長、食物消化、蛻皮等生理過程中的功能[9-12]。先前的研究多聚焦于C.elegans氨肽酶家族在生殖中的作用。本試驗中，沉默anp-1基因后，C.elegans總產(chǎn)卵數(shù)無顯著降低，說明anp-1基因可能不參與C.elegans生殖過程調(diào)節(jié)，這與前人報道的結(jié)果一致[3]。

本試驗體長分析結(jié)果表明，沉默anp-1基因?qū)е翪.elegansL4期幼蟲體長顯著變短。ANP-1是PAM-1的同源蛋白，PAM-1參與C.elegans腸道細(xì)胞對多肽的攝取，有研究表明氨肽酶P(Aminopeptidase P，APP)和 亮氨酸氨肽酶(Leucine aminopeptidase，LAP)也可能與PAM-1有同樣的功能[9,13-15]。因此，推測沉默anp-1基因?qū)е翪.elegans消化和吸收障礙，從而造成C.elegans發(fā)育緩慢。

C.elegans胰島素/胰島素樣生長因子(Insulin/IGF-1 signaling，IIS)信號通路跟代謝、生長發(fā)育、長壽、“dauer”期形成、天然免疫和行為密切相關(guān)[16]。IIS信號通路相關(guān)基因突變會介導(dǎo)C.elegans壽命變化。age-1是第1個被鑒定出來的IIS信號通路成員，其突變會延長C.elegans壽命[17]。沉默anp-1基因時，age-1基因 mRNA相對表達(dá)量明顯上調(diào)，表明沉默anp-1基因?qū)е翪.elegans壽命縮短有可能是通過激活和上調(diào)age-1的表達(dá)有關(guān)，沉默anp-1基因?qū)е翪.elegans壽命縮短的機(jī)制需要更深入的研究。

此外，沉默anp-1基因?qū)е翪.elegans壽命縮短有可能是通過調(diào)控胰島素樣多肽(Insulin-like peptides，ILPs)的表達(dá)。ILPs調(diào)控C.elegans“dauer”期形成、長壽以及發(fā)育。對daf-28、ins-1和ins-7等ILPs的研究已經(jīng)深入到一定程度，但是其在C.elegans生長發(fā)育中的功能仍不明了[16]。unc-62是ILPs其中一員，其主要在C.elegans腸道發(fā)揮功能并調(diào)節(jié)C.elegans壽命，RNAi沉默unc-62導(dǎo)致大量C.elegans腸道基因上調(diào)并縮短C.elegans壽命[18]。本試驗中，沉默anp-1基因?qū)е聈nc-62基因上調(diào)，表明anp-1基因有可能受到UNC-62轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。但目前未見關(guān)于氨肽酶與ILPs調(diào)控的相關(guān)報道，因此，深入研究anp-1與ILPs的相互關(guān)系，有助于進(jìn)一步闡明ILPs參與調(diào)節(jié)C.elegans壽命的機(jī)制，并為揭示氨肽酶基因anp-1在C.elegans生長發(fā)育中的生物學(xué)功能提供參考。