高倩文，王君娜，張宇名，尹燕博，徐守振

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

雞細(xì)小病毒(Chicken parvovirus，ChPV)是一種無囊膜的單鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)約為5 000 kb，包括3個(gè)開放閱讀框(ORF)。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)，ORF2編碼衣殼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)，而位于ORF1和ORF2之間的ORF3編碼假定蛋白(NP)，其功能目前尚不清楚[1]。ChPV是引起雞腸道疾病重要的病原體之一，能引起禽腸炎綜合征和發(fā)育障礙與矮小綜合征等疾病。臨床特征表現(xiàn)為腹瀉、精神沉郁、發(fā)育遲緩、體重增加減慢、上市時(shí)間增加 ； 更嚴(yán)重的能導(dǎo)致免疫功能障礙和死亡率增加[2-3]。已有研究表明,該病在雞群中普遍存在，主要侵害雛雞，以商品肉雞的感染率較高，種雞和蛋雞次之[4]。迄今為止，已有39株完整的ChPV基因組序列在GenBank中提交，1株來自匈牙利[5]，4株來自美國(guó)[6]，5株來自韓國(guó)[7]，29株來自中國(guó)廣州[8]。目前，雖然致病毒株仍未確定，但是ChPV在雞群中的流行率卻仍在增加。本研究將測(cè)序的2株ChPV完整的基因組編碼序列與來自不同地區(qū)參考株的基因組序列進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析，為ChPV基因組來源和遺傳進(jìn)化特征提供參考，有助于更好地防控ChPV引起的有關(guān)疾病。

1 材料與方法

1.1 病料 本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的ChPV陽(yáng)性病料分別來自山東濰坊和河南濮陽(yáng)某養(yǎng)雞場(chǎng)，病雞表現(xiàn)腹瀉、體重減輕、發(fā)育遲緩等臨床癥狀。

1.2 主要試劑和儀器PremixTaqTM、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、DL-2 000 DNA Marker,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,購(gòu)自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。高速離心機(jī)Pico17型,購(gòu)自ThermoFisher公司；LifeTouch基因擴(kuò)增儀TC-96/G/H(b)型，購(gòu)自杭州博日科技有限公司；電泳儀JY600E型、凝膠成像儀JY04S-3C型，均購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱XT5116-IN70型，購(gòu)自杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司。

1.3 引物 ChPV檢測(cè)引物[9]和基因組測(cè)序引物[7]，均由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 ChPV檢測(cè)引物和基因組測(cè)序引物Table 1 Detection primers and genome sequencing primers for ChPV

1.4 臨床病料檢測(cè) 根據(jù)TIANGEN病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，從山東濰坊和河南濮陽(yáng)某養(yǎng)雞場(chǎng)送檢的病料中提取病毒DNA，使用ChPV檢測(cè)引物PVF1和PVR1對(duì)ChPV非結(jié)構(gòu)基因(NS)保守區(qū)域的561 bp區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將電泳鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物送至睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 基因組提取 根據(jù)TIANGEN病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，從測(cè)序結(jié)果ChPV陽(yáng)性的病料中提取病毒的基因組，用40 μL RNase-Free H2O洗脫后測(cè)DNA的濃度，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 基因組分段PCR擴(kuò)增 以1.5步驟所得DNA為模板進(jìn)行ChPV基因組各片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：DNA 1 μg，PremixTaqTM25 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O補(bǔ)足50 μL。分別用引物ChPV-A1/A2和ChPV-B1/B2擴(kuò)增片段A和B，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。引物ChPV-C1/C2和ChPV-D1/D2擴(kuò)增片段C和D，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。引物ChPV-E1/E2、ChPV-F1/F2和ChPV-G1/G2擴(kuò)增片段E、F和G，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s， 72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.7 基因組各片段克隆 PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)各目的片段進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將PCR純化回收產(chǎn)物分別與pMDTM18-T Vector進(jìn)行16 ℃連接30 min。連接體系：PCR產(chǎn)物4 μL，pMDTM18-T Vector 1 μL，Solution Ⅰ5 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞中，挑單菌落搖菌，應(yīng)用步驟1.6中的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將電泳鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌液送至睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 基因組序列同源性及遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用DNAMAN軟件將測(cè)得的7段基因序列進(jìn)行拼接，組成完整的基因組序列。應(yīng)用DNASTAR軟件和MEGA軟件分別對(duì)ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的基因組、NS基因、VP基因的核苷酸序列及其氨基酸序列與GenBank登錄的具有代表性的39株ChPV參考株以及2株美國(guó)火雞細(xì)小病毒(TuPV)參考株基因組進(jìn)行基因特征和同源性分析。應(yīng)用MEGA 5.02軟件Neighbor-Joining方法將ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株與GenBank登錄的參考株構(gòu)建基因組的遺傳進(jìn)化樹，分析ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株基因組的遺傳進(jìn)化關(guān)系。應(yīng)用SimPlot 3.5.1(http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot)分析分離株的重組情況。

1.9 VP2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用Phyre 2(Protein Homology/AnalogyRecognition Engine2)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/)預(yù)測(cè)ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株VP2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，應(yīng)用PYMOL Viewer(http://www.pymol.org)分析預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 臨床病料的檢測(cè) 應(yīng)用PVF1和PVR1檢測(cè)引物分別從山東濰坊送檢的腸、法氏囊病料和河南濮陽(yáng)送檢的腺胃、肝、腸病料中PCR擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為561 bp的目的片段，如圖1和圖2所示。測(cè)序結(jié)果BLAST比對(duì)分析確定送檢的2份病料均為ChPV陽(yáng)性病料，分別將其命名為ChPV-SDWF和ChPV-HNPY。

圖1 山東濰坊臨床病料PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR test results of clinical material from Weifang districtM：DL-2 000 DNA marker； 1～8：心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、法氏囊； 9：陰性對(duì)照M:DL-2 000 DNA marker; 1～8:Heart, liver, spleen, lung, kidney,intestine, brain, bursa of fabricius; 9:Negative control

圖2 河南濮陽(yáng)臨床病料PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR test results of clinical material from Puyang districtM：DL-2 000 DNA marker； 1～3：腺胃、肝、腸； 4：陰性對(duì)照M:DL-2 000 DNA marker; 1～3:Glandular stomach,liver, intestine; 4:Negative control

2.2 基因組各片段的PCR擴(kuò)增 以ChPV陽(yáng)性病料提取的DNA為模板，分段擴(kuò)增出302 bp、1 559 bp、1 360 bp、 569 bp、895 bp、1 448 bp、333 bp的ChPV基因組片段，與預(yù)期片段大小一致，如圖3所示。

圖3 ChPV基因組各片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of each fragment of ChPV genomeM：DL-2 000 DNA marker； 1～7：片段A、片段B、片段C、片段D、片段E、片段F、片段G； 8：陰性對(duì)照M:DL-2 000 DNA marker; 1～7:Fragment A, fragment B,fragment C, fragment D, fragment E, fragment F,fragment G; 8:Negative control

2.3 基因組序列結(jié)構(gòu)分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株基因組全長(zhǎng)編碼核苷酸序列均為4 615 bp， 包含3個(gè)開放閱讀框。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，ORF2編碼次要和主要衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2，ORF3編碼假定蛋白NP1。NS1(1～2 085 nt)從ATG開始到TAG結(jié)束，共2 085 bp，編碼694 aa。

NP1(2 286～2 591 nt)長(zhǎng)為306 bp，編碼101aa；NS1和NP1之間存在201 nt非編碼區(qū)。VP1(2 588～4 615 nt) 從ATG到TAA共含有2 028 bp，編碼675 aa；VP2(3 005～4 615 nt)從VP1中間開始編碼，與VP1共用1個(gè)終止密碼子TAA，全長(zhǎng)1 611 bp，編碼536 aa；在3 197～3 199nt可能存在VP3的起始密碼子ATG。

2.4 基因組核苷酸序列同源性與遺傳進(jìn)化分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株2個(gè)分離株間核苷酸同源性為96.9%，ChPV-SDWF株和ChPV-SDWF株與美國(guó)TuPV參考株TuPV-260同源性分別為95.7%和95.4%，與匈牙利ChPV參考株ChPV-ABU-P1同源性分別為95.1%和94.9%，與4株美國(guó)ChPV參考株同源性分別為85.4%～93.0%、85.1%～93.6%，與5株韓國(guó)參考株同源性分別為88.3%～92.2%、87.6%～92.1%，與29株中國(guó)廣西參考株的同源性分別為81.6%～94.7%、81.5%～95.4%。基于核苷酸序列的基因組遺傳進(jìn)化分析表明，ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株位于同一個(gè)小的分支，與匈牙利ChPV參考株ChPV-ABU-P1和美國(guó)TuPV參考株TuPV-260位于同一個(gè)大的分支，ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株親緣關(guān)系最近，二者與TuPV-260株親緣關(guān)系較近，其次是ChPV-ABU-P1株(圖4)。用Z檢驗(yàn)進(jìn)行基因選擇分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)分離株的全基因組都進(jìn)行了純化選擇(負(fù)選擇)。SimPlot分析表明，ChPV-SDWF株(見封三彩版圖5A)和ChPV-HNPY株(見封三彩版圖5B)基因組核苷酸序列沒有出現(xiàn)重組信號(hào)，分離株與參考株間5′端NS1基因同源性高，3′端的VP1基因和VP2基因同源性低，VP2基因同源性最低。

圖4 基因組遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed on genomic sequences

圖5 分離株基因組序列Simplot分析結(jié)果Fig.5 Simplot analysis based on full-length nucleotide sequencesA:ChPV-SDWF株基因組； B:ChPV-HNPY株基因組A:Genome of ChPV-SDWF; B:Genome of ChPV-HNPY

2.5NS1基因序列 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的NS1基因具有高度同源性，其核苷酸和氨基酸同源性分別為98.0%和99.0%。ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株與國(guó)內(nèi)外ChPV參考株NS1基因核苷酸分別為88.6%～97.2%、88.4%～97.5%，氨基酸同源性分別為92.5%～99.1%、92.4%～99.1%；與TuPV參考株NS1基因核苷酸同源性分別為88.5%～97.7%、88.3%～97.1%，氨基酸同源性分別為89.8%～98.9%、90.1%～98.1%。ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的NS1基因的392～399 aa位和436～437 aa位都存在保守的P-loop基序(GPANTGKT)和NTP結(jié)合基序(EE)。

2.6VP1基因序列分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株之間的VP1核苷酸和氨基酸同源性分別為95.2%和98.4%。2個(gè)分離株與ChPV參考株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分別為73.4%～95.7%、79.6%～99.0%；與TuPV參考株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分別為73.9%～94.8%、79.5%～99.0%。在ChPV-SDWF株VP1基因的164～170 aa位和ChPV-HNPY株VP1基因的163～170 aa位存在富含甘氨酸(G)基序，但ChPV-SDWF株比ChPV-HNPY株少1個(gè)G。

2.7VP2基因序列分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的VP2核苷酸和氨基酸同源性分別為94.4%和98.7%。2個(gè)分離株與ChPV參考株VP2基因核苷酸和氨基酸同源性分別為71.7%～95.0%和78.8%～99.4%；與TuPV參考株VP2基因核苷酸和氨基酸同源性分別為72.8%～94.1%和79.3%～99.4%。ChPV-SDWF株VP2基因的134～151 aa位存在五重圓筒基序(LQVIQKTVTDSGTQYSND)，在152 aa位存在1個(gè)亮氨酸(L)。

2.8 VP2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 從預(yù)測(cè)得到的ChPV-SDWF株(見封三彩版圖6A)和ChPV-HNPY株(見封三彩版圖6B)VP2蛋白3D結(jié)構(gòu)模型可以看出，VP2含有由8條反向平行的β折疊圍成的桶，表面存在4個(gè)Loop，其中Loop3和Loop4變異最大。

圖6 VP2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Fig.6 Tertiary structure model of VP2 proteinA:ChPV-SDWF株VP2蛋白； B:ChPV-HNPY株VP2蛋白A:VP2 protein of ChPV-SDWF; B:VP2 protein of ChPV-HNPY

3 討論

ChPV是引起雞腸道疾病的重要病原體之一，能導(dǎo)致家禽出現(xiàn)腹瀉、體重減輕等癥狀。本研究從山東濰坊送檢病死雞的法氏囊和河南濮陽(yáng)送檢病死雞的腺胃、腸道中成功檢測(cè)出ChPV，通過PCR擴(kuò)增出2株完整的基因組序列，在ChPV基因組各片段的PCR擴(kuò)增過程中，通過對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定片段1、2的最佳退火溫度為55 ℃，片段3、4的最佳退火溫度為60 ℃，片段5、6、7的最佳退火溫度為58 ℃。

對(duì)來自不同地域的毒株進(jìn)行基因組序列同源性和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ChPV-SDWF株與ChPV-HNPY株核苷酸同源性最高，親緣關(guān)系最近，其次與美國(guó)TuPV參考株TuPV-260和匈牙利ChPV參考株ChPV-ABU-P1核苷酸同源性較高，親緣關(guān)系較近。通過對(duì)分離株與參考株的NS1基因、VP1基因和VP2基因核苷酸和氨基酸的同源性分析發(fā)現(xiàn)，NS1基因較VP1基因和VP2基因具有較高的保守性，其次是VP1和VP2基因。ChPV-SDWF株與ChPV-HNPY株與美國(guó)TuPV參考株TuPV-260具有較高的同源性和較近的親緣關(guān)系，說明它們?cè)谀硞€(gè)時(shí)間從一個(gè)共同的祖先分化開來[5]，也說明了不同毒株同源性的高低以及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與不同毒株所處的地域沒有直接的關(guān)聯(lián)。基于ChPVVP1基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹同基于全基因組構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹的相似性好于基于NS1和VP2構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(數(shù)據(jù)未提供)，據(jù)此可推測(cè)可用VP1基因來代替全基因組構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。VP2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)表明在蛋白外表面有4個(gè)Loop，內(nèi)部有1個(gè)由8條反向平行的β折疊形成的桶，與ChPV ABU-P1基因組具有類似的結(jié)構(gòu)[12]。

本研究提供了2株ChPV完整的基因組序列，并對(duì)來自不同地域的毒株進(jìn)行基因組序列同源性和遺傳進(jìn)化分析。鑒于雞群感染ChPV造成的經(jīng)濟(jì)損失，有必要對(duì)我國(guó)雞群中ChPV的地理分布進(jìn)行廣泛的流行病學(xué)研究。本研究可為ChPV診斷和流行病學(xué)研究提供參考。