黨 喬，吳信豪，賈博巖，劉 磊，馬珺楊，劉樹(shù)明，孔令聰，3，馬紅霞，3

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118 ；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118 ;3. 動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118)

近年來(lái)，牛呼吸系統(tǒng)疾病(Bovine respiratory disease，BRD)已成為影響我國(guó)乃至世界養(yǎng)牛業(yè)的主要疾病之一，該病多發(fā)于經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)挠始茏优Ｖ校ǔ？蓪?dǎo)致65%～80%的發(fā)病率和45%～75%的死亡率[1-2]。引起B(yǎng)RD的主要病原菌為溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)、牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocidaof bovine capsular type A)和牛支原體(Mycoplasmabovis,M.bovis)等[3-6]。其中，牛支原體是引發(fā)牛群感染的主要病原菌，可引發(fā)牛肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎等多種疾病，并且還可通過(guò)引起免疫抑制進(jìn)一步造成牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌等病原的繼發(fā)性感染，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

目前，針對(duì)BRD主要采用抗生素治療，然而隨著抗生素壓力的持續(xù)存在，BRD主要病原已對(duì)獸醫(yī)臨床常用藥物產(chǎn)生了耐藥性，因BRD主要病原耐藥性產(chǎn)生而造成的抗感染失敗已屢見(jiàn)不鮮[8]。乳酸菌由于具有安全性高、抑菌譜廣、不易使致病菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，已作為生物保護(hù)劑被廣泛應(yīng)用。Santagati M等[9]已證明呼吸道可作為益生菌的潛在靶點(diǎn)，乳酸桿菌可抑制人和小鼠呼吸道中的細(xì)菌病原體[10]，并且可在鼻咽部定植。我們推測(cè)，采用對(duì)BRD主要病原具有拮抗作用的乳酸菌改善長(zhǎng)途運(yùn)輸肉牛的呼吸系統(tǒng)菌群結(jié)構(gòu)，很可能會(huì)極大降低該病的發(fā)病率。為此，本研究從發(fā)酵食品中篩選出對(duì)牛溶血性曼氏桿菌、牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌和牛支原體具有拮抗作用的乳酸菌，進(jìn)一步對(duì)乳酸菌的拮抗性能進(jìn)行分析，為防治BRD生物制劑的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 試驗(yàn)所用乳酸菌分離自酸奶、泡菜、益生菌制劑、青貯飼料等；牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌、牛溶血性曼氏桿菌、牛支原體均保存于吉林省新獸藥研發(fā)與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏庫(kù)。

1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 抗生素 氨芐西林、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素和四環(huán)素，均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢呋辛和克林霉素，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鏈霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星，均購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.4 酶制劑 胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和過(guò)氧化氫酶，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 乳酸菌發(fā)酵液的制備 將活化3代后的乳酸菌以2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后12 000 r/min離心10 min取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾得到無(wú)細(xì)胞上清液。

1.5.2 指示菌菌懸液的制備 牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌和牛溶血性曼氏桿菌，在BHI培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)至麥?zhǔn)媳葷岫?.5，使用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)其濃度為1×105CFU/mL。

牛支原體接種于PPLO培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)其菌液濃度，參考《支原體學(xué)》采用倍比稀釋法對(duì)牛支原體的顏色變化單位(Color change unit,CCU)進(jìn)行測(cè)定，《支原體學(xué)》推薦使用的牛支原體AST菌液最佳濃度為104CCU /0.2 mL[11]。

1.5.3 乳酸菌抑菌能力測(cè)試 采用牛津杯法測(cè)定乳酸菌對(duì)2株病原菌的抑菌能力。調(diào)整病原菌濃度為105CFU/mL，取100 μL均勻涂布于BHI固體培養(yǎng)基，每個(gè)牛津杯中加入200 μL 乳酸菌CFS，以加入pH 4.0 MRS液體培養(yǎng)基的牛津杯為空白對(duì)照。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，測(cè)定抑菌環(huán)直徑。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

調(diào)節(jié)牛支原體菌液濃度為104CCU/0.2 mL后加入10%的乳酸CFS，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)48 h后再進(jìn)行牛支原體顏色變化單位測(cè)定來(lái)觀(guān)察乳酸CFS對(duì)其抑菌活性。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.5.4 乳酸菌溶血活性測(cè)定 用無(wú)菌棉棒蘸取適量乳酸菌菌液，以“Z”字行涂布于含有5%(V/V)商業(yè)無(wú)菌羊血的瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h[12]。

1.5.5 乳酸菌抗生素敏感性檢測(cè) 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) 推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定乳酸菌對(duì)12種臨床常用抗生素的最低抑菌濃度(MIC)[13]。每批試驗(yàn)均使用大腸肝菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控株，要求質(zhì)控株的藥物敏感性在CLSI規(guī)定范圍內(nèi)。

1.5.6 酶對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響 將乳酸菌CFS調(diào)節(jié)至各酶最適pH后，分別加入胰蛋白酶(pH 7.5)、 胃蛋白酶(pH 2.0)、木瓜蛋白酶(pH 7.0)、蛋白酶K(pH 8.0)、H2O2酶，使其終濃度達(dá)到1.0 mg/mL，37 ℃水浴反應(yīng)2 h，調(diào)節(jié)pH為初始狀態(tài)，測(cè)定其抑菌活性。

1.5.7 pH對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響 使用1 mol/L HCl和1 mol/l NaOH調(diào)節(jié)乳酸菌CFS pH分別為2、3、4、5、6，使用相同pH的MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照，測(cè)定其抑菌活性。

1.5.8 溫度對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響 乳酸菌CFS分別在40、60、80、100 ℃和121 ℃下處理30 min， 測(cè)定其抑菌圈直徑。

1.5.9 紫外照射對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響 將乳酸菌CFS置于紫外燈下連續(xù)照射8、16 h和24 h，測(cè)定其抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 具有拮抗作用乳酸菌的篩選 采用牛津杯法測(cè)定乳酸菌CFS對(duì)BRD主要病原菌的生長(zhǎng)抑制作用，從204株食源性乳酸菌中篩選出10株具有拮抗BRD主要病原菌功能的乳酸菌。菌株抑菌效果如表1所示。其中P5鼠李糖乳桿菌抑菌效果最好，為此選擇此株菌進(jìn)一步研究。如表2所示，添加5%乳酸菌CFS和添加10%乳酸菌CFS后，牛支原體由104CCU/0.2 mL降至103～101CCU/0.2 mL，添加20%乳酸菌CFS則完全殺滅牛支原體，因此，選擇乳酸菌CFS添加量10%進(jìn)行后續(xù)乳酸菌對(duì)牛支原體拮抗性能研究。

表1 乳酸菌對(duì)病原菌拮抗效果Table 1 Antagonistic effect of Lactobacillus against pathogen

表2 乳酸菌對(duì)牛支原體拮抗效果Table 2 Antagonistic effect of Lactobacillus on Mycoplasma bovis

2.2 乳酸菌溶血活性測(cè)定 血瓊脂平板上未出現(xiàn)溶血環(huán)，表明此菌株不具有溶血性。

2.3 乳酸菌抗生素敏感性檢測(cè) 表3藥物敏感性結(jié)果顯示，P5僅對(duì)卡那霉素和左氧氟沙星耐藥，且乳酸菌對(duì)這2種抗生素為固有耐藥，一般不會(huì)引起耐藥基因轉(zhuǎn)移的問(wèn)題，因此這株乳酸菌具有較高的安全性。

表3 乳酸菌最低抑菌濃度(MIC)及其耐藥譜Table 3 Minimum inhibitory concentration (MIC) and drug resistance spectrum of Lactobacillus

2.4 酶處理對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響 如圖1所示，乳酸菌CFS經(jīng)胃蛋白酶和蛋白酶K處理后，對(duì)牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌活性顯著降低，經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K處理后，對(duì)牛溶血性曼氏桿菌抑菌活性顯著下降，經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K處理后，對(duì)牛支原體抑菌活性顯著下降。結(jié)果表明，其抑菌成分有部分是蛋白類(lèi)物質(zhì)。使用終濃度為1 mg/mL的H2O2酶處理乳酸菌CFS，采用牛津杯法測(cè)定其抑菌圈。H2O2酶處理后，抑菌圈直徑無(wú)明顯變化，表明H2O2不是其抑菌成分中主要物質(zhì)。

圖1 蛋白酶處理對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響Fig.1 Effect of protease treatment on bacteriostatic activity of Lactobacillus

2.5 pH對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響 不同pH 條件下乳酸菌CFS對(duì)病原菌的抑菌性能如圖2所示。

圖2 pH對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH on bacteriostatic activity of Lactobacillus

隨著pH的升高，乳酸菌對(duì)病原菌的抑菌能力逐漸下降。在pH為2～4時(shí)，乳酸菌CFS對(duì)病原菌的抑菌能力與對(duì)照組相比增強(qiáng)或保持不變，pH為5～6 時(shí)，抑菌能力顯著減弱，對(duì)牛支原體的抑菌能力幾乎喪失。

2.6 溫度對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響 乳酸菌CFS經(jīng) 40、60、80、100 ℃和121 ℃處理30 min后，乳酸菌CFS抑菌能力與對(duì)照組相比無(wú)顯著差距，表明其代謝產(chǎn)物具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.7 紫外線(xiàn)照射對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響 乳酸菌 CFS經(jīng)紫外線(xiàn)照射8、16 h和24 h后抑菌能力與對(duì)照組相比無(wú)變化，表明其具有良好的抗紫外線(xiàn)穩(wěn)定性。

3 討論

本試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)抑菌產(chǎn)物性能進(jìn)行了分析，使用H2O2酶處理后，抑菌活性無(wú)變化，使用蛋白酶處理后，抑菌活性稍有下降，抑菌活性隨pH降低而增強(qiáng)，推測(cè)其抑菌物質(zhì)為蛋白和有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)，并且在酸性條件下活性較好。趙煜[19]篩選得到4株乳酸菌，與空腸彎曲桿菌共培養(yǎng)后均能抑制空腸彎曲桿菌的生長(zhǎng)。常林杰[20]利用掃描電鏡與透射電鏡對(duì)經(jīng)乳酸菌抑菌產(chǎn)物處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行觀(guān)察，推測(cè)乳酸菌抑菌產(chǎn)物抑菌機(jī)理為破壞細(xì)胞壁。但本試驗(yàn)篩選出的對(duì)BRD主要病原的抑菌機(jī)制還需要進(jìn)一步展開(kāi)研究。

本試驗(yàn)從發(fā)酵食品中篩選得到1株對(duì)牛溶血性曼氏桿菌、牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌和牛支原體具有良好抑菌性能的鼠李糖乳桿菌，其抑菌性能穩(wěn)定。經(jīng)初步分析，抑菌物質(zhì)為在酸性條件下活性較好的酸和蛋白類(lèi)物質(zhì)，為防治牛呼吸系統(tǒng)疾病益生制劑的研發(fā)及減少抗生素的使用提供了科學(xué)基礎(chǔ)。我們應(yīng)進(jìn)一步對(duì)該乳酸菌的抑菌機(jī)制開(kāi)展研究，為BRD的生物防治提供理論依據(jù)。