陳 昕，韓玲玲，韋芊含，朱新宇，陳 新,3，張雨梅,3

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009 ； 2.無錫市晨芳生物科技有限公司，江蘇 無錫 214000；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

茶樹油(Tea tree oil,TTO)是從桃金娘科白千層葉中提取的無色至淡黃色油狀液體，具有怡人的芳香。茶樹油的成分有松油烯-4-醇、1,8-桉葉素、對傘花烴等，其中發(fā)揮抑菌作用的主要是松油烯-4-醇。研究報道，松油烯-4-醇具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、抗病毒的特點(diǎn)。其機(jī)制在于破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，改變細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)[1-3]，阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，正是松油烯-4-醇的抗炎活性在其治療口腔念株菌病中起關(guān)鍵作用[5]。

茶樹油在醫(yī)藥、動物生產(chǎn)、洗浴及化妝品等方面具有較多應(yīng)用。臨床中可應(yīng)用于局部治療侵襲性真菌感染[6]。飼糧中添加不同劑量的茶樹油對育肥豬的生長性能、器官指數(shù)和肉品質(zhì)有不同程度的影響，其中基礎(chǔ)飼糧中添加200 mg/(kg·bw)茶樹油對育肥豬生長性能和肉質(zhì)的改善效果較好[7]。王淑楠等[8]報道茶樹油可作為飼料添加劑促進(jìn)斷奶仔豬生長、降低腹瀉，促進(jìn)肝臟和胸腺的發(fā)育，在一定程度上可替代抗生素類飼料添加劑。但茶樹油促進(jìn)動物生長的機(jī)制目前尚不清楚。茶樹油提取物粉是從澳洲茶樹油原油中提取的新產(chǎn)品，擬作為飼料添加劑用于畜禽生產(chǎn)，本試驗(yàn)探討茶樹油提取物粉對大鼠的免疫作用影響，可增加對茶樹油提取物粉作用機(jī)制的了解，為該產(chǎn)品作為飼料添加劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar大鼠，體重180～200 g，雌、雄各半；豚鼠，體重250～300 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2017-0004，使用許可證號為SYXK(蘇)2017-0044。飼喂經(jīng)60Co照射飼料，環(huán)境溫度為(24±2)℃，濕度為(60±20)%，飲水為符合城市飲用水標(biāo)準(zhǔn)的自來水。試驗(yàn)開始前于試驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)3 d，灌胃前禁食12 h，自由飲水。

1.1.2 試驗(yàn)藥品 20%茶樹油提取物粉，批號20160922，由江蘇無錫晨芳生物技術(shù)公司提供。

1.1.3 主要試劑及配制 大鼠淋巴細(xì)胞分離液、MTT，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；用pH 7.2～7.4的PBS配成5 mg/mL的MTT溶液，微孔濾器過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清，均購自HyClone公司。100×青霉素鏈霉素溶液，購自碧云天生物技術(shù)有限公司。RPMI 1640完全培養(yǎng)液：于200 mL RPMI 1640培養(yǎng)基中加入100×青霉素鏈霉素溶液2 mL和胎牛血清20 mL。 刀豆蛋白A Ⅳ(ConA，Ⅳ)，購自Sigma公司；10 μg/mL ConA用RPMI 1640完全培養(yǎng)液配制，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀，美國Bio Tek公司；Leica倒置顯微鏡，德國Leica公司；可調(diào)微量移液器，日本Nichiryo公司；島津UV-2600型紫外-可見光分光光度計；CELL-DYN3700全自動血細(xì)胞分析儀，美國雅培公司；Unicel Dxc 800型全自動生化分析儀，美國Becokman公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠急性毒性試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，茶樹油提取物粉劑量達(dá)5 000 mg/(kg·bw)時，大鼠未出現(xiàn)死亡。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范，對茶樹油提取物粉進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。

大鼠10只，雌、雄各半，以0.8 mL/(100 g·bw)給藥容積灌胃，劑量為5 000 mg/(kg·bw)。連續(xù)觀察2周，并記錄動物中毒癥狀及死亡情況。

1.2.2 試驗(yàn)分組 Wistar大鼠，隨機(jī)分成4組，每組10只，雌、雄各半。試驗(yàn)組分組為茶樹油提取物粉高劑量875 mg/(kg·bw)、中劑量175 mg/(kg·bw)、低劑量組35 mg/(kg·bw)，1%羧甲基纖維素鈉為對照組。茶樹油提取物粉以1%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液，灌胃給予，連續(xù)10 d。

1.2.3 大鼠臟器指數(shù)測定 將大鼠處死，稱重，取出肝臟、脾臟和胸腺，分別稱重，計算肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/大鼠體重(g)×100%

1.2.4 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的測定 大鼠灌胃10 d 后，于第11天，向大鼠腹腔內(nèi)注射RPMI 1640營養(yǎng)液5～8 mL，輕捏大鼠腹部，抽取部分腹腔洗液，1 000 r/min離心10 min，棄上清；沉淀用RPMI 1640營養(yǎng)液洗滌、懸浮，離心；將沉淀定容至1 mL，細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞濃度稀釋至2×106～ 5×106個/mL，100 μL/孔鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個樣本6個重復(fù)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h后加入MTT溶液10 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后加入10% SDS-0.04 mol/L HCl 液10 μL/孔，2 h后以雙蒸水調(diào)零，在酶聯(lián)檢測儀上讀取OD570 nm值。將試驗(yàn)組與對照組OD值比評價巨噬細(xì)胞吞噬活性。

1.2.5 血清溶血素含量測定 首先制備補(bǔ)體溶液和雞紅細(xì)胞懸液。取2只豚鼠血清混合，用生理鹽水稀釋10倍，即為10%的補(bǔ)體溶液。采取未免疫雞的翼下靜脈血，與等量抗凝劑混勻。離心后棄去上清，加PBS適量，洗滌離心3次(前2次1 500 r/min離心5 min、第3次2 000 r/min離心8 min)，所得的紅細(xì)胞用PBS稀釋20倍，即成5%的雞紅細(xì)胞懸液。

于灌胃第7 天，每只大鼠腹腔注射0.2 mL 的5%雞紅細(xì)胞進(jìn)行免疫，免疫后7 d，眼眶下靜脈采血、離心，取血清用生理鹽水稀釋100倍。取稀釋血清1 mL與5%雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL混合，在低溫下加10%補(bǔ)體0.5 mL，37 ℃恒溫水浴箱中保溫30 min 后，在0 ℃冰箱中止反應(yīng)，離心，取上清液于分光光度計上540 nm處測定吸光度(OD)值[9-10]。另設(shè)不加血清的空白對照，作為分光光度測定的調(diào)零。

1.2.6 脾淋巴細(xì)胞增殖的測定 各組5只大鼠進(jìn)行無菌取脾，將取下的脾剪成碎塊并研磨，過200目不銹鋼網(wǎng)，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。在10 mL離心管中加入3 mL大鼠淋巴細(xì)胞分離液，然后小心加入單細(xì)胞懸液，懸于大鼠淋巴細(xì)胞分離液上層，1 200 r/min 離心25 min后，收集中間云狀薄層即脾淋巴細(xì)胞。分離到的脾淋巴細(xì)胞再用RPMI 1640完全培養(yǎng)液洗滌離心(1 000 r/min 離心25 min)3次，用臺盼藍(lán)據(jù)染法檢測活性，活細(xì)胞率>95%時，方可用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

以RPMI 1640完全營養(yǎng)液將淋巴細(xì)胞濃度稀釋至2×106～5×106個/m L，轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL /孔，陰性對照孔加入RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μL；加入50 μL ConA液(相當(dāng)于5 μg/mL)。放入體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)至44 h時每孔加入5 mg /mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；3 000 r/min離心10 min，棄掉上清，每孔加入100 μL DMSO。在酶聯(lián)檢測儀上讀取OD570 nm值，按以下公式計算刺激指數(shù)SI。

刺激指數(shù)(SI)=試驗(yàn)孔OD值/陰性對照孔OD值

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性毒性試驗(yàn) 5 000 mg/(kg·bw)劑量的茶樹油提取物粉給予大鼠后，大鼠精神狀態(tài)均良好、毛色光潔、活動自如，呼吸、飲食欲、糞便正常，口鼻內(nèi)無異常分泌物，亦未發(fā)現(xiàn)與給藥相關(guān)的異常反應(yīng)，無動物死亡。第14天后，對所有動物進(jìn)行剖檢，未見明顯的眼觀異常。茶樹油提取物粉對大鼠經(jīng)口LD50>5 000 mg/(kg·bw)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)對化學(xué)物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，茶樹油提取物粉屬于實(shí)際無毒級別。

2.2 茶樹油提取物粉對大鼠免疫功能的影響

2.2.1 臟器指數(shù)比較 不同劑量茶樹油提取物粉對大鼠免疫器官指數(shù)的影響見表1。由表1可以看出，與對照組相比，茶樹油提取物粉3個劑量組的脾臟指數(shù)顯著升高，35 mg/(kg·bw)和175 mg/(kg·bw)劑量組對大鼠脾臟指數(shù)的影響極顯著(P<0.01)；875 mg/(kg·bw)劑量組對脾臟指數(shù)的影響顯著(P<0.05)。875 mg/(kg·bw)組大鼠的肝臟指數(shù)極顯著增加(P<0.01)，35 mg/(kg·bw)和175 mg/(kg·bw)劑量組差異不顯著(P>0.05)。茶樹油提取物粉3個劑量組胸腺指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。

表1 茶樹油提取物粉對大鼠免疫器官指數(shù)的影響Table 1 Effect of tea tree oil extract powder on immune organ index of rats (%)

2.2.2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性比較 不同劑量茶樹油提取物粉對大鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響結(jié)果見表2。由表2可以看出，與對照組相比，茶樹油提取物粉3個劑量組巨噬細(xì)胞的吞噬活性顯著提高，35 mg/(kg·bw)劑量組差異顯著(P<0.05)；175 mg/(kg·bw)和875 mg/(kg·bw)劑量組差異極顯著(P<0.01)。茶樹油提取物粉3個劑量組巨噬細(xì)胞的吞噬活性分別是對照組的1.4、1.6倍和1.8倍。

表2 茶樹油提取物粉對大鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性、血清溶血素和淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effects of tea tree oil extract powder on macrophage phagocytosis,serum hemolysin and proliferation of spleen lymphocytes on rat

2.2.3 血清溶血素含量比較 血清溶血素能反應(yīng)機(jī)體的體液免疫。不同劑量組茶樹油提取物粉對大鼠血清溶血素的影響結(jié)果見表2。可知茶樹油提取物粉3個劑量組血清溶血素均增加，175 mg/(kg·bw)和875 mg/(kg·bw)劑量組極明顯增加(P<0.01)，但35 mg/(kg·bw)劑量組與對照組相比無明顯差異(P>0.05)。

2.2.4 脾淋巴細(xì)胞增殖比較 脾淋巴細(xì)胞增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答的一個重要階段。不同劑量組茶樹油提取物粉對大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可以看出，與對照組相比，茶樹油提取物粉3個劑量組對大鼠脾淋巴細(xì)胞SI顯著增加，35 mg/(kg·bw)和175 mg/(kg·bw)劑量組差異極顯著(P<0.01)，且35 mg/(kg·bw)和175 mg/(kg·bw)劑量組的大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖是對照組的約1.4倍；而875 mg/(kg·bw)劑量組差異顯著是對照組的約1.3倍(P<0.05)。

3 討論

茶樹油提取物粉經(jīng)口LD50>5 000 mg/(kg·bw)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)對化學(xué)物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，茶樹油提取物粉屬于實(shí)際無毒級別。

茶樹油提取物粉可顯著增加脾臟指數(shù)、增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性和脾淋巴細(xì)胞增殖、增加血清溶血素水平，表明茶樹油提取物粉對大鼠免疫功能具有明顯的增強(qiáng)作用,可為茶樹油作為飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中的使用提供依據(jù)。但茶樹油提取物增強(qiáng)免疫的機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

機(jī)體免疫系統(tǒng)主要由免疫器官、免疫組織、免疫細(xì)胞及免疫分子等組成，可分為特異性免疫和非特異性免疫兩大類。而特異性免疫又分為細(xì)胞免疫和體液免疫。如糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性肝病等都與機(jī)體免疫系統(tǒng)有很大的關(guān)聯(lián)。

臟器指數(shù)可在一定程度上反應(yīng)臟器功能的強(qiáng)弱[11]。茶樹油作用于多種免疫活性細(xì)胞，可引起免疫球蛋白和細(xì)胞因子譜的改變，未影響肝、腎功能[12]。本試驗(yàn)中，與對照組相比，茶樹油處理組的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯提高，表明茶樹油可在一定程度對機(jī)體肝臟和脾臟的生長有促進(jìn)作用?？赡芘c茶樹油富含萜烯類等多種活性成分有關(guān)，這些成分具有促進(jìn)細(xì)胞代謝和免疫作用。

巨噬細(xì)胞在固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中具有重要作用，是主要的炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞，在炎性反應(yīng)過程中分泌細(xì)胞因子、趨化因子等，參與各種炎癥性疾病過程[13]。大鼠的巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)表明，茶樹油提取物粉處理組巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，并促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，提高分泌細(xì)胞因子，最終增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[14]。

血清溶血素是B淋巴細(xì)胞受到外來抗原(雞紅細(xì)胞)刺激后，產(chǎn)生的一種抗體[15]，能間接反應(yīng)體液免疫的功能狀態(tài)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶樹油提取物粉的中、高劑量組對大鼠的血清溶血素有著極顯著提高作用，茶樹油提取物粉對大鼠的體液免疫有著促進(jìn)作用。

脾臟是成熟淋巴細(xì)胞定居場所，與細(xì)胞免疫和體液免疫都密切相關(guān)。而脾免疫活性細(xì)胞的增殖，尤其是淋巴細(xì)胞的增殖是其免疫功能增強(qiáng)的重要基礎(chǔ)。本體外試驗(yàn)結(jié)果表明，茶樹油提取物粉具有明顯誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用。