程 曦，劉麗虹，劉進(jìn)峰，高亞琪

(1.河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司 河北省阿維菌素生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051530；2.石家莊市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，河北 石家莊 050000)

阿維菌素是阿維鏈霉菌在含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和微量元素的培養(yǎng)基中通氣攪拌、深層發(fā)酵產(chǎn)生的具有十六元大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的多組分生物殺蟲殺螨劑[1]。在其發(fā)酵液含有的 8 種組分中，B1a 組分的殺蟲效果最佳，是商品化阿維菌素的主要組分[2]。業(yè)內(nèi)將B1a含量作為衡量發(fā)酵效價高低的指標(biāo)。自阿維菌素被發(fā)現(xiàn)以來，通過菌種改良、配方及控制工藝的優(yōu)化，生產(chǎn)水平大幅提高，不過這些措施均以提高發(fā)酵效價為目標(biāo)，關(guān)于提高阿維菌素放罐體積的報道卻很少。阿維鏈霉菌作為一種絲狀菌，其發(fā)酵液總體表現(xiàn)為非牛頓流體性質(zhì)，并滿足剪切稀化特征[3]。在其發(fā)酵過程中常有大量泡沫產(chǎn)生，泡沫的存在影響了放罐體積的提高。統(tǒng)計顯示，阿維菌素發(fā)酵放罐體積約為發(fā)酵罐容積的70%，而同為絲狀菌的慶大霉素、恩拉霉素發(fā)酵放罐體積為發(fā)酵罐容積的75%～80%。若采用半連續(xù)發(fā)酵提高放罐體積，不失為另一種提高阿維菌素發(fā)酵產(chǎn)量的途徑。

半連續(xù)發(fā)酵，我國工業(yè)界通俗地稱其為發(fā)酵帶放工藝[4-5]，是指在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，放出部分含有目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵液，然后補(bǔ)入相同體積的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵的方法[6]。在青霉素、頭孢菌素工業(yè)生產(chǎn)中已成功應(yīng)用[7-8]；但在其它的以次級代謝產(chǎn)物為目標(biāo)的發(fā)酵帶放工藝中應(yīng)用較少。除了操作復(fù)雜、增加工作量及雜菌污染的機(jī)會外，更重要的原因是，補(bǔ)入新鮮培養(yǎng)基會稀釋生物量；而菌絲的生長有個過程，可能對生產(chǎn)效率有一定程度的影響。阿維鏈霉菌發(fā)酵過程中，液位隨培養(yǎng)時間延長逐漸上升，為防止“逃液”常需倒出部分發(fā)酵液至其它容器中繼續(xù)培養(yǎng)或隨其它發(fā)酵罐帶放[9]，在這一過程中,為提高設(shè)備利用效率，需將幾種不同時期的部分發(fā)酵液倒入一臺小型容器中混合培養(yǎng)。在對這一現(xiàn)象的長期觀察中，發(fā)現(xiàn)效價的增長并不因幾種不同時期、不同效價發(fā)酵液混合而受到影響。以此類推，如果發(fā)酵罐帶放后補(bǔ)入適當(dāng)時期發(fā)酵液替代傳統(tǒng)的新鮮培養(yǎng)基，既可避免生物量的波動，又有利于效價的持續(xù)增長。因此，有必要研究補(bǔ)入不同的基質(zhì)對發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

鑒于此,作者在100 L、50 L發(fā)酵罐中研究阿維鏈霉菌發(fā)酵過程中補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基和補(bǔ)入發(fā)酵液對發(fā)酵過程的影響，為阿維菌素工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)施半連續(xù)發(fā)酵工藝提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與設(shè)備

菌種，阿維鏈霉菌AVS-32，河北省阿維菌素生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

20 L種子罐、50 L發(fā)酵罐、100 L發(fā)酵罐，配備有補(bǔ)料、DO和pH值等自動控制系統(tǒng)和具有數(shù)據(jù)采集及分析功能的軟件系統(tǒng)，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.2.1 種子罐

培養(yǎng)基：淀粉20 g·L-1，黃豆餅粉5 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，花生粉5 g·L-1，氯化鈷10 mg·L-1；消后體積為13 L，pH值7.2～7.6。

培養(yǎng)條件：溫度28～29 ℃，空氣流速1.0～1.2 L·L-1·min-1，攪拌轉(zhuǎn)速200～600 r·min-1，培養(yǎng)時間40～50 h。

1.2.2 發(fā)酵罐

培養(yǎng)基：淀粉170 g·L-1，黃豆餅粉27 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，輕質(zhì)碳酸鈣1.5 g·L-1，硫酸銨0.3 g·L-1，淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%。接種量8%～10%。

培養(yǎng)條件：溫度 27～28 ℃，空氣流速0.8～1.2 L·L-1·min-1，攪拌轉(zhuǎn)速400～600 r·min-1，發(fā)酵周期320～340 h 。

補(bǔ)料培養(yǎng)基同發(fā)酵罐培養(yǎng)基。

1.3 檢測方法

1.3.1 生物量測定

準(zhǔn)確量取50 mL發(fā)酵液置于250 mL三角瓶中，加入適量助濾劑，加熱至90～100 ℃， 抽濾，適量水洗，105 ℃下烘干2 h 至恒重(W2)，按式(1)計算生物量(g·L-1)：

生物量=(W2-W0-W1)×20

(1)

式中：W0為濾布質(zhì)量，g；W1為助濾劑質(zhì)量，g；20為換算系數(shù)。

1.3.2 B1a效價測定

準(zhǔn)確量取2 mL發(fā)酵液置于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲浸提15 min，定容，過濾，進(jìn)行HPLC分析。色譜柱C18(250 mm×4.6 mm)，流動相 CH3OH-H2O(90∶10，體積比)，流速 1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長246 nm，進(jìn)樣量20 μL。記錄峰面積，采用外標(biāo)法按式(2)計算B1a 效價(g·L-1):

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 B1a 效價和生物量隨培養(yǎng)時間的變化趨勢

了解阿維菌素發(fā)酵過程中效價和生物量的變化趨勢，有助于確定不同基質(zhì)補(bǔ)入工藝的優(yōu)劣。50 L 發(fā)酵罐 B1a 效價、生物量隨培養(yǎng)時間的變化趨勢見圖 1。

圖1 B1a效價和生物量隨培養(yǎng)時間的變化趨勢Fig.1 Change trend of B1a titer and biomass with culture time

由圖1可知，發(fā)酵前40 h為對數(shù)生長期，菌絲快速生長，36 h時生物量相對飽和，生物量達(dá)45.6 g·L-1；此后，由于料液的蒸發(fā)，發(fā)酵液體積減小，生物量仍有所增加，但增速放緩。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行約50 h時，開始阿維菌素的生物合成，合成速率逐漸加快，100 h后B1a效價呈線性增長。50 L規(guī)模發(fā)酵過程顯示，阿維菌素是阿維鏈霉菌在菌絲生長繁殖到一定階段后開始合成的，為典型的次級代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵過程為非生長偶聯(lián)型。

2.2 補(bǔ)入不同基質(zhì)對生物量和B1a效價的影響

補(bǔ)料一般是指發(fā)酵進(jìn)行到產(chǎn)物生成階段，因合成產(chǎn)物或維持細(xì)胞代謝活動的需要，選擇性地補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，使之向著產(chǎn)物積累的方向發(fā)展[10]。將100 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)至237 h的發(fā)酵液等分至2臺50 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，并分別補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)(V補(bǔ)/V混)為15%的補(bǔ)料培養(yǎng)基和培養(yǎng)67 h的發(fā)酵液，比較生物量和B1a效價的變化情況，結(jié)果見圖2。

由圖2a可知，補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基后由于料液的稀釋,生物量由50.8 g·L-1下降至46.7 g·L-1，此后較快增長；329 h時生物量達(dá)到52.7 g·L-1，與補(bǔ)入發(fā)酵液的生物量接近。這是由于，補(bǔ)料培養(yǎng)基為含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和微量元素的復(fù)合培養(yǎng)基，造成菌絲一定程度的二次生長繁殖；而補(bǔ)入發(fā)酵液后，生物量增加幅度相對較小。

圖2 補(bǔ)入不同基質(zhì)對生物量(a)和B1a效價(b)的影響Fig.2 Effects of adding different matrixes on biomass(a) and B1a titer(b)

由圖2b可知，補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基和發(fā)酵液后由于稀釋作用，239 h之前B1a效價均大幅下降，此后B1a效價呈線性增長(圖3)，并且補(bǔ)入發(fā)酵液(斜率K=0.0375)比補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基(斜率K=0.0346)效價增長快。需要特別注意的是，阿維菌素發(fā)酵動力學(xué)研究表明，阿維菌素是阿維鏈霉菌生長繁殖到一定階段才開始合成的。補(bǔ)料后菌絲的二次生長繁殖并未造成效價增長停滯，而且多次試驗(yàn)均重復(fù)了這一現(xiàn)象?？赡芘c菌絲已經(jīng)具有了次級代謝能力有關(guān)；其次，補(bǔ)入的補(bǔ)料培養(yǎng)基對某些有害代謝產(chǎn)物的稀釋改善了合成環(huán)境，有助于加速阿維菌素的合成，表現(xiàn)出菌絲生長繁殖與產(chǎn)物合成同時進(jìn)行的混合型發(fā)酵特征。由此，可以根據(jù)設(shè)備配置及實(shí)際生產(chǎn)情況，在某些特定情況下的工業(yè)化生產(chǎn)，帶放后可適時選擇補(bǔ)入復(fù)合培養(yǎng)基，最大限度地提高生產(chǎn)效率。孫文敬等[6]也研究表明，補(bǔ)料及放料策略的優(yōu)化是提高產(chǎn)量的關(guān)鍵手段。

圖3 B1a效價對培養(yǎng)時間的回歸曲線Fig.3 Regression curves of B1a titer and culture time

2.3 補(bǔ)入不同數(shù)量的發(fā)酵液對B1a效價增長的影響

為了既利用菌絲的次級代謝能力，又能提高發(fā)酵液培養(yǎng)設(shè)備的利用效率，選擇補(bǔ)入培養(yǎng) 50 h 后的發(fā)酵液。將100 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)至240 h的發(fā)酵液等分至 A、B 2臺 50 L 發(fā)酵罐后，分別補(bǔ)入培養(yǎng)58 h發(fā)酵液 5 L(體積分?jǐn)?shù) 15%)和 2.5 L(體積分?jǐn)?shù) 8%)，繼續(xù)培養(yǎng)至336 h，觀察B1a效價變化情況，結(jié)果見表 1。

由表1可知，由于補(bǔ)入低含量發(fā)酵液的稀釋作用，242 h B1a效價較240 h均有所下降，而后又快速增長。補(bǔ)入發(fā)酵液前后，B1a效價隨培養(yǎng)時間變化的回歸曲線見圖 4。

表1 B1a效價隨培養(yǎng)時間的變化

圖4 補(bǔ)入發(fā)酵液前(a)、后(b)B1a效價對培養(yǎng)時間的回歸曲線Fig.4 Regression curves of B1a titer and culture time before(a) and after(b) adding fermentation broth

由圖4可知，補(bǔ)入發(fā)酵液后回歸方程的斜率(罐A0.036 4、罐B 0.029 8)大于補(bǔ)入發(fā)酵液前(0.026 6)，且補(bǔ)入發(fā)酵液多的A罐大于B罐；即補(bǔ)入發(fā)酵液后效價增速更快，且補(bǔ)入的發(fā)酵液越多，效價增長就越多，后續(xù)試驗(yàn)也重復(fù)了這一現(xiàn)象。這是由于補(bǔ)入發(fā)酵液，除了補(bǔ)充營養(yǎng)外，還減輕了代謝產(chǎn)物的抑制，保持了菌體活力的穩(wěn)定，有利于效價的持續(xù)快速增長。

由圖4b可知，補(bǔ)入低含量發(fā)酵液越多，效價增長就越多；但同時對補(bǔ)發(fā)酵液前效價的稀釋作用也越明顯。為準(zhǔn)確表達(dá)補(bǔ)入發(fā)酵液后效價的相對增長情況，為工業(yè)化生產(chǎn)確定放罐時間提供理論依據(jù)，將試驗(yàn)效價與回歸效價進(jìn)行對比，結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)效價與回歸效價對比

由表2可知，盡管補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)15%的發(fā)酵液(A罐)，效價增速更快，但由于稀釋作用更明顯，288 h之前試驗(yàn)效價均低于回歸效價，即在此之前不宜放罐；當(dāng)培養(yǎng)至312 h時試驗(yàn)效價較回歸效價高0.018 g·L-1，即宜選擇在此之后(補(bǔ)入發(fā)酵液72 h后)放罐；補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)8%的發(fā)酵液(B罐)，效價增速相對較慢，但由于稀釋作用相對不明顯，288 h時試驗(yàn)效價較回歸效價高0.197 g·L-1，即宜選擇在此之后(補(bǔ)入發(fā)酵液48 h后)放罐。

2.4 工業(yè)化應(yīng)用探討

工業(yè)化生產(chǎn)以最大限度的提高產(chǎn)能、降低成本為終極目標(biāo)。如何更高效地使用有限的設(shè)備是不容忽視的問題。通常的發(fā)酵設(shè)備配置，除了大容積發(fā)酵罐，還有對應(yīng)的種子罐及其它小容積發(fā)酵罐。三級發(fā)酵工藝可以縮短發(fā)酵周期增加放罐批次，進(jìn)而提高大容積發(fā)酵罐使用效率；提高小容積發(fā)酵罐的使用效率也是提高發(fā)酵產(chǎn)能的途徑之一。帶放工藝由來已久，但用于次級代謝發(fā)酵工藝較少，其中，困擾生產(chǎn)人員的主要問題是，帶放盡管增加了當(dāng)時的放罐體積，但隨之而來的是帶放罐批體積減小的部分怎么補(bǔ)充。首先是補(bǔ)水，在慶大霉素的產(chǎn)物合成與菌體生長同時進(jìn)行的混合型高密度發(fā)酵中有所應(yīng)用；但阿維菌素發(fā)酵液總體表現(xiàn)為非牛頓流體性質(zhì)，其表觀黏度隨培養(yǎng)時間的延長而降低，屬于擬塑性流體[11]，后期補(bǔ)水顯然不利于效價的增長。其次是補(bǔ)料，單純的補(bǔ)淀粉，意味著碳氮比失衡及總生物量減少，產(chǎn)品得率不高；作者就此研究了在發(fā)酵中后期補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基并與補(bǔ)入發(fā)酵液對比，結(jié)果顯示補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基劣于補(bǔ)入發(fā)酵液。再次是補(bǔ)入發(fā)酵液，補(bǔ)入中后期發(fā)酵液意味著補(bǔ)入了一定數(shù)量的阿維菌素，對效價的稀釋作用小但也失去了帶放的意義；補(bǔ)入的發(fā)酵液培養(yǎng)時間越短，意味著小型發(fā)酵設(shè)備的利用效率越高，但還應(yīng)考慮利用菌體的次級代謝能力，所以最優(yōu)的選擇是補(bǔ)入培養(yǎng)50 h后的發(fā)酵液。就此研究結(jié)果，嘗試在單罐容積120 m3發(fā)酵罐上應(yīng)用；將30 m3或12 m3容器作為發(fā)酵液培養(yǎng)罐，采用半連續(xù)發(fā)酵工藝后發(fā)酵單罐產(chǎn)量又上新臺階。

3 結(jié)論

通過在100 L、50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行平行試驗(yàn)，在發(fā)酵中后期補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)15%的培養(yǎng)50 h后的發(fā)酵液優(yōu)于補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基，即發(fā)酵罐帶放后可選擇補(bǔ)入培養(yǎng)50 h后的發(fā)酵液替代其它基質(zhì)。補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)15%的發(fā)酵液較補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)8%的發(fā)酵液效價增長得更快，但稀釋作用也更明顯。本研究為阿維菌素工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)施半連續(xù)發(fā)酵，高效利用小容積發(fā)酵罐提供了新思路、新方法。其本質(zhì)等效于將小容積發(fā)酵罐的發(fā)酵周期由330 h縮短至50～100 h,即大幅度縮短了發(fā)酵周期。半連續(xù)發(fā)酵是一種重要的生化培養(yǎng)方式，該研究對其它以次級代謝產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物的半連續(xù)發(fā)酵的實(shí)施具有一定的借鑒價值。