陳國權(quán)，吳征卓，姚碧瓊，施大軍，王 娜，張?zhí)焯?，閻朝華，周碧君,3*，王開功,3，程振濤,3，文 明,3*

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025；4.三穗縣鴨產(chǎn)業(yè)化建設管理辦公室，貴州 三穗 556500；5.貴州千里山生態(tài)食品股份有限公司，貴州 三穗 556500）

鴨疫里默氏桿菌（Riemrella anatipestifer，RA）屬于黃桿菌科里默氏菌屬，是一種有莢膜、無芽孢、無鞭毛的革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)菌，能感染鴨、鵝和火雞等多種禽類，引起以纖維素性心包炎、肝周炎和腦膜炎為主要病變的鴨疫里默氏桿菌病[1-2]。目前世界上報道過的RA 血清型至少有21 種，中國主要以血清1 型、2 型和10 型為主[3]。由于不同血清型之間缺乏交叉免疫保護，藥物治療在養(yǎng)鴨生產(chǎn)過程中仍是防治RA 感染的一種重要措施，但同時也致使RA 具有廣泛的耐藥性，RA 已成為影響全球養(yǎng)鴨業(yè)最主要的病原菌之一，并造成嚴重的經(jīng)濟損失[4-5]。

外膜蛋白A（Outer membrane protein A，OmpA）作為一種主要蛋白廣泛存在于革蘭氏陰性細菌中，維持細胞膜的完整性[6]。OmpA 是RA 一種主要的抗原決定簇，能誘導良好的保護性免疫，且具有高度保守性。OmpA 基因全長1 164 bp，共編碼387 個氨基酸，通過對該基因進行PCR 擴增及測序可對RA作出鑒定[7]。本研究通過對臨床疑似RA 感染的瀕死鴨心和肝組織進行細菌分離培養(yǎng)，通過生化試驗、OmpA 基因擴增和玻片凝集試驗對分離菌進行鑒定，本研究首次證實了血清11 型RA 在貴州省的存在，豐富了貴州省RA 的流行病學資料。本研究對RA 分離株進行致病性檢測和耐藥性分析，以期了解RA 的致病機制和耐藥機制，為更好地防控RA 和開展相關研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源及陽性菌株2019 年12 月，貴州省三穗縣2 個養(yǎng)鴨場（分別用A、B 代替）雛鴨出現(xiàn)爆發(fā)性死亡病例。A、B 養(yǎng)鴨場原存欄雛鴨分別為11 000 只和9 700 只，均從11 日齡出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，至調(diào)查日（A 場雛鴨16 日齡、B 場雛鴨14 日齡）已分別死亡8 000 余只和2 000 余只。2 個養(yǎng)鴨場發(fā)病雛鴨的臨床癥狀相似，以神經(jīng)癥狀和運動障礙為主。每個養(yǎng)鴨場分別采集處于瀕死期的5 只雛鴨的心、肝和脾組織用于病原分離。RA-SS1 陽性菌株由貴州大學動物疫病研究所鑒定并保存。

1.2 主要試劑及實驗動物細菌基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix 購自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ均 購 自TaKaRa 公司；Gel Extration Kit、Plasmid Mini Kit 購 自Omega 公司；革蘭氏染液購自北京索萊寶科技有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、微量生化鑒定管、藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；4%多聚甲醛購自BOSTER 公司。10 日齡健康雛鴨來源于貴州省三穗縣興綠洲農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 引物設計與合成參照雷云等[8]合成RA OmpA全基因引物；參照包細明等[9]和張亞楠等[10]合成RA常見的氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Ib、喹諾酮類耐藥基因oqxB、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermF、四環(huán)素類耐藥基因tet（X）、氯霉素類耐藥基因floR、整合子酶基因IntI1 的引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成（表1）。

1.4 細菌的分離培養(yǎng)無菌采集處于瀕死期雛鴨的心、肝和脾組織，劃線接種于巧克力培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2倒置培養(yǎng)，24 h 后觀察細菌生長情況，挑取形態(tài)特征一致的單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢觀察染色特性及形態(tài)。通過培養(yǎng)特性，菌落、菌體形態(tài)，染色特性進行初步判定，將特征型單個菌落接種于TSB（含5%新生牛血清）培養(yǎng)基中進行純化增殖培養(yǎng)備用。

1.5 分離菌的生化鑒定參考雷云[8]等和包細明[9]等選取用于鑒定RA 的微量生化鑒定管，無菌取分離菌純培養(yǎng)菌液接種于生化鑒定管，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.6 分離菌OmpA基因的PCR 鑒定及序列分析無菌吸取1.5 mL 菌液于離心管，利用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌總DNA。以分離菌基因組為模板，采用OmpA 基因引物進行PCR 擴增[8]。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用膠回收試劑盒回收純化目的基因。將目的基因連接至pMD19-T 載體，按分子克隆技術常規(guī)操作進行目的基因的克隆，挑取經(jīng)質(zhì)粒雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒由華大基因科技有限公司測序，測序結(jié)果與參考序列應用MegAlign 進行核苷酸同源性比對，采用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹及分析。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.7 分離菌的血清型鑒定將純化后的RA 送至四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院禽病防治研究中心，使用血清1 型～13 型、16 型RA 陽性血清對2 株RA 進行血清型鑒定。

1.8 分離菌感染雛鴨的回歸試驗挑選飼養(yǎng)至10 d的15 只健康雛鴨，隨機分為2 個實驗組和1 個對照組，每組各5 只。實驗組雛鴨分別腿部肌肉注射0.5 mL RA 不同分離株菌液（菌液濃度調(diào)制為3×108cfu/mL），對照組雛鴨腿部肌肉注射等量無菌TSB（含5%新生牛血清），每天按時觀察雛鴨臨床癥狀與死亡情況，直至攻毒后第7 d。取攻毒后瀕死雛鴨的心、肝、脾及腦組織用4%多聚甲醛固定，由武漢塞維爾生物科技有限公司制作病理切片，通過病理切片進行組織病理變化觀察。

1.9 分離菌的藥敏試驗根據(jù)抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準（CLSI）[11]的要求，采用紙片擴散法（K-B 法）對分離菌進行青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氯霉素類和磺胺類等8 類抗菌藥物敏感性試驗。

1.10 分離菌的耐藥基因檢測以分離菌DNA 為模板，采用aac（6'）-Ib（氨基糖苷類）、oqxB（喹諾酮類）、ermF（大環(huán)內(nèi)酯類）、tet（X）（四環(huán)素類）、floR（氯霉素類）和IntI1（整合子酶基因）等6 種耐藥基因引物（10 μmol/L）進行PCR 擴增[9-10]，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 細菌分離培養(yǎng)及菌體形態(tài)觀察結(jié)果無菌接種瀕死鴨心和肝組織于巧克力瓊脂培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)。結(jié)果顯示，從2 個養(yǎng)鴨場瀕死雛鴨肝組織內(nèi)各分離到1 株疑似菌株，該分離菌對營養(yǎng)要求較高，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基中均無菌落生長，在巧克力培養(yǎng)基可見表面光滑、邊緣整齊、半透明、中央微突起的露滴樣小菌落。2 株分離菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)均為革蘭陰性短小桿菌，多數(shù)呈單個狀態(tài)，少數(shù)成對或呈短鏈狀排列（圖1）。分離菌菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢形態(tài)與RA 相符，將2 株分離菌分別命名為GZ-SS01 和GZ-SS02。

圖1 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（×1 000）Fig. 1 Microscopic examination of the isolateds with Gram stain (×1 000)

2.2 分離菌生化鑒定結(jié)果無菌接種分離菌純培養(yǎng)物于微量生化管中進行生化特性觀察。結(jié)果顯示，2 株分離菌均能分解尿素；氧化酶、觸酶試驗均為陽性；不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖；不水解賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸；硝酸鹽還原、硫化氫、甘露醇、靛基質(zhì)和VP-MR 試驗均為陰性。分離菌生化特性與RA 相符，結(jié)合細菌培養(yǎng)特性、染色鏡檢結(jié)果及生化特性可初步判定2 株分離菌為RA。

2.3 分離菌OmpA基因的PCR 鑒定及序列分析結(jié)果以GZ-SS01 和GZ-SS02 分離菌的基因組為模板，采用OmpA 基因特異性引物進行PCR 擴增，結(jié)果均獲得約為1 200 bp 的目的條帶（圖2A）；使用BamHⅠ、Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒雙酶切，可見約為1 200 bp的基因條帶和約為2 700 bp 的載體條帶（圖2B）。將測序獲得的OmpA 基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中參考菌株OmpA基因序列進行分析，核苷酸同源性比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 株分離株與15 株RA 參考株的OmpA 基因序列的同源性高達93%～99.9%。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，2 株分離株與8 株RA 參考株的OmpA 基因序列聚為一簇，且置信度為100%；GZ-SS01 株與JL-RA1 株（HQ707077.1）和GZ-RA2 株（KY399233.1）親 緣 關系最近，GZ-SS02 株與GZ-RA3 株（KY399234.1）親緣關系最近（圖2B）。綜合分離菌的形態(tài)學特征、生化特性及OmpA 基因序列分析結(jié)果，判定這2 株分離菌均為RA。

圖2 基于OmpA 基因的PCR 擴增、酶切鑒定和系統(tǒng)進化樹分析Fig. 2 PCR amplification, enzyme digestion identification and phylogenetic tree analysis based on OmpA gene

2.4 分離菌血清型鑒定結(jié)果經(jīng)玻片凝集試驗對分離菌進行血清型鑒定，結(jié)果顯示，GZ-SS01 株和GZSS02株與血清11型陽性血清反應均能出現(xiàn)清晰的乳白色絮狀凝集塊，與血清1～10、12～13和16型陽性血清均無明顯變化，由此判定2株分離菌均為血清11型RA。

2.5 分離菌感染雛鴨的致病性試驗結(jié)果兩組實驗雛鴨經(jīng)腿部肌肉分別注射不同分離株菌液，連續(xù)觀察7 d。結(jié)果顯示，感染12 h 后，兩組實驗雛鴨均出現(xiàn)頭頸歪斜、站立不穩(wěn)等明顯臨床癥狀；24 h 后開始出現(xiàn)死亡，呈現(xiàn)角弓反張狀；48 h～60 h 達到死亡高峰期，其間死亡率達60%（6/10）；90 h 后兩組實驗雛鴨全部死亡。瀕死鴨心、肝和脾組織接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基均能分離得到與原分離菌形態(tài)一致的菌落。對照組雛鴨在觀察期均未出現(xiàn)感染癥狀或死亡。剖檢瀕死雛鴨，均能明顯觀察到心、肝及氣囊表面附有纖維素性滲出物。觀察人工感染90 h后瀕死鴨組織病理變化可見：心外膜增厚，表面附有大量粉紅色網(wǎng)狀纖維素滲出物，有大量單核細胞和異嗜性粒細胞彌漫性浸潤（圖3E）；肝被膜水腫增厚，表面有粉紅色網(wǎng)狀纖維滲出，混有大量淋巴細胞和異嗜性粒細胞（圖3F）；脾被膜水腫增厚，聚集有大量粉紅色纖維素滲出，異嗜性粒細胞浸潤，紅髓與白髓界限不清（圖3G）；腦膜充血、水腫增厚，有粉紅色網(wǎng)狀纖維滲出，其間可見淋巴細胞和異嗜性粒細胞彌散性浸潤（圖3H）。臨床癥狀及病理變化與發(fā)病鴨一致，表明兩株分離株為該疫情的病源菌，且對雛鴨均具有較強的致病性。

2.6 分離菌藥敏試驗結(jié)果采用紙片擴散法（K-B法）對分離菌進行藥敏試驗。結(jié)果顯示，2 株分離菌對哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢拉定、頭孢氨芐、氧氟沙星和米諾環(huán)素等7 種抗菌藥物敏感；對青霉素類（羧芐西林和氨芐西林）、氨基糖苷類（丁胺卡那、慶大霉素和新霉素）、大環(huán)內(nèi)脂類（阿奇霉素、紅霉素和麥迪霉素）、四環(huán)素類（四環(huán)素和多西環(huán)素）和氯霉素類（氟苯尼考）等5 類11 種抗菌藥物耐藥（表2），2株分離菌均屬于5重耐藥菌株。

圖3 RA 人工感染雛鴨90 h 后組織病理學觀察結(jié)果Fig. 3 Histopathological observation results after 90 hours of artificial infection of ducks with Riemerella anatipestifer

表2 鴨疫里默氏桿菌分離株的藥敏試驗結(jié)果Table 2 Results of drug sensitivity test of Riemerella anatipestifer isolates

2.7 分離菌耐藥基因檢測結(jié)果以合成的耐藥基因引物進行PCR 檢測，結(jié)果顯示，2 株分離菌均攜帶氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Ib（486 bp）、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermF（460 bp）、四環(huán)素類耐藥基因tet（X）（1 167 bp）、氯霉素類耐藥基因floR（673 bp）和整合子酶基因IntI1（280 bp）等5 種耐藥基因，均不攜帶喹諾酮類耐藥基因oqxB（755 bp）（圖4），耐藥基因檢測結(jié)果與耐藥表型結(jié)果除四環(huán)素類中米諾環(huán)素耐藥情況不一致外其余均一致。

圖4 分離菌耐藥基因檢測結(jié)果Fig. 4 PCR amplification results of drug resistance genes of the two isolates

3 討 論

RA 對1～8 周齡的雛鴨具有很強的致病性，RA血清型眾多且各型之間缺乏交叉免疫保護，掌握各個地區(qū)RA 的優(yōu)勢血清型對于該地RA 疫苗株的選擇具有重要意義[12]。目前對RA 進行血清型鑒定主要為玻片凝集試驗和試管凝集試驗等血清學分型法，但該法需依賴陽性血清才能進行血清型分型[13]。本研究發(fā)現(xiàn)2 株血清11 型RA 分離株與其他血清型RA參考株仍處于同一基因群，進一步證實基于OmpA基因分型與血清型分型無直接關聯(lián)。OmpA 是RA 引起細胞粘附、侵襲和血清抗性的主要毒力因子，存在于所有RA 血清型中，且遺傳異質(zhì)性較小[14]。謝永平等針對OmpA 基因保守區(qū)序列設計引物和探針建立了快速、精準檢測RA 的qPCR 方法[6]；包細明等選用OmpA 基因序列建立了快速診斷RA 的多重PCR 方法，可見能選用該段基因?qū)A 作出鑒定[15]，但無法判斷RA 血清型。

不同血清型RA 感染鴨引起的臨床癥狀和病理變化基本相似，多伴有神經(jīng)癥狀的纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。袁小遠等研究指出血清1 型RA 感染癥狀主要表現(xiàn)為縮頸、運動困難等癥狀；以心、肝和氣囊等漿膜表面出現(xiàn)明顯的纖維素性滲出為主要病變[16]。雷云等用分離到的血清2 型RA 進行動物回歸試驗顯示，攻毒后的實驗鴨表現(xiàn)明顯的歪頭縮頸的神經(jīng)癥狀；剖檢見心、肝組織表面均有纖維素性滲出物，脾臟充血腫大等病理變化[17]。楊曉輝等用分離到的血清11 型RA 進行動物回歸試驗顯示，攻毒后的實驗鴨表現(xiàn)出頭頸震顫癥狀，剖檢可見纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎[18]。本研究用分離到的2 株血清11 型RA 進行動物回歸試驗顯示，實驗鴨主要以運動障礙和神經(jīng)癥狀為主；病變主要以纖維素性心包炎、肝周炎和腦膜炎為主，部分還表現(xiàn)有脾被膜水腫增厚等病理變化。關于血清11 型RA 感染鴨的組織病理變化的研究報道相對較少，本研究通過對該型RA 感染鴨進行組織病理學分析，豐富了該型RA 的病理資料，為該型RA 的致病機理研究提供參考。血清11 型RA與1、2 型RA 感染引起的癥狀與病變基本一致，且對雛鴨都具有很強的致病性，因此很難通過觀察癥狀和病變對RA 血清型進行區(qū)分。本研究首次證實了血清型11 型RA 在貴州的存在，為該地區(qū)科學全面地防控RA 指明了新的方向。

抗菌藥物的廣泛使用使RA 對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，并出現(xiàn)了多重耐藥菌株。研究表明RA對多種抗菌藥物具有天然抗性，RA 臨床分離株對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、氯霉素類和四環(huán)素類抗菌藥物具有不同程度的耐藥性[4,19]。朱元軍等對我國南方部分地區(qū)120 株RA 進行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)對部分氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類和四環(huán)素類抗菌藥物產(chǎn)生了嚴重的耐藥性，且氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Ib 的檢出率高達74.1%（89/120）[20]。任曉梅等對46 株RA 進行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)對氨芐西林、新霉素和紅霉素等抗菌藥物高度耐藥[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 株RA 對所檢測氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和氯霉素類抗菌藥物耐藥，與以上研究結(jié)果基本一致；2 株RA 對喹諾酮類藥物較敏感，與朱德康等[4]和任曉梅等[21]研究結(jié)果不一致。耐藥基因 檢 測 結(jié) 果 顯 示，2 株RA 都 攜 帶aac（6'）-Ib、ermF、tet（X）、floR 和IntI1 等5 種耐藥基因，除四環(huán)素類中米諾環(huán)素耐藥表型與基因型不一致外，其余耐藥表型與基因型基本相符。通過對RA 的耐藥表型和基因型進行比較分析可以確定RA 對某種抗菌藥物的耐藥程度，為指導臨床合理用藥提供科學依據(jù)[22]。

本研究從貴州省三穗縣2 個養(yǎng)鴨場疑似RA 感染的瀕死鴨肝組織中分離到2 株血清11 型RA，首次證實了血清11 型RA 在貴州省的存在，且均能復制出RA 感染引起的典型臨床癥狀與病理變化，均具有較強的致病性。2 株RA 對頭孢類和喹諾酮類抗菌藥物較為敏感，對部分青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氯霉素類等5 類抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，且耐藥表型與基因型基本一致。