曲星霖，肖 丹，吳 健，馬曉媛，白 翠，王 妍*，王 楠*

（1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133000；2.吉林省農業(yè)科學院，吉林 長春 130033；3.吉林省動物疫病預防控制中心，吉林 長春 130062）

乳腺致病性大腸桿菌（Mammary pathogenic E.coli，MPEC）是奶牛乳房內感染（Intramammary infection，IMI）的主要病原體，因存在fec 基因座可使細菌從檸檬酸鹽中捕獲鐵而具有在牛乳腺中定植的能力[1]，其導致的急性乳腺炎不僅影響奶牛產奶量，同時也影響牛奶品質，增加了治療費用，給奶牛業(yè)造成了嚴重的經濟損失[2]。為了治療由MPEC 引起的乳腺炎，抗菌藥物被大量使用，導致MPEC 耐藥性不斷增強，出現(xiàn)多重耐藥（Multidrug-resistant organism，MDRO）現(xiàn)象，給公共衛(wèi)生安全造成嚴重威脅。由于MDRO 產生機制十分復雜，涉及到細菌的質粒、染色體、轉座子、整合子等單個或多個耐藥基因的積聚[3]，藥敏試驗、PCR、基因芯片、微流體芯片等研究方法已難以滿足細菌耐藥性研究的要求。基因測序技術的發(fā)展為細菌耐藥性研究提供了便捷的工具，已成為發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入、缺失、倒置和復雜重組等各種基因變異的終極工具[4]，如鄧雯文等應用PacBio平臺在1 株大熊貓源致病E. coli 中發(fā)現(xiàn)了包含耐藥和毒力基因的基因島[5]；陳定強等應用Illumina 平臺在1 株多重耐藥E. coli 的contigs 中發(fā)現(xiàn)了blaCMY-42 基因與ISEcp1 插入序 列、blc 和sug E 等基因相關聯(lián)[6]。這些研究顯示高通量測序技術在細菌耐藥性研究方面具有廣闊的應用前景。

2015 年～2019 年 本 實 驗 室 從 吉 林 省15 個 奶 牛場采集的300 份乳樣中分離到60 株E. coli[7]，其中JL05 株的耐藥性最強。為研究JL05 的進化分群情況、致病力、耐藥表型和耐藥基因之間的相關性，本實驗采用PCR 法、微量肉湯稀釋法和高通量測序法對其進化分群、16 種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）、fec 基因座、毒力基因、耐藥基因進行檢測和分析，為進一步研究E. coli JL05 的基因組特征、致病力及耐藥傳播機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌 株E. coli JL05 分離自吉林省白城市某奶牛場患乳房炎奶牛的乳樣，經OptiRead 微生物生化分析儀鑒定，并在乳內感染小鼠模型上進行了鑒定。質控E. coli 菌株為ATCC25922，由吉林省疾病預防控制中心提供。

1.2 主要試劑AMPure XP 核酸純化試劑盒購自Beckman Coulter 公司；血瓊脂板、CAMHBT 肉湯、CMV3AGNF 革蘭氏陰性藥敏板、GeneJET DNA 提取試劑盒、dsDNA 定量試劑盒、Nuclease-Free Water、SuperFi II Green PCR Master Mix、Ion Xpress Plus 文庫構建試劑盒、Ion Xpress Barcode 文庫標記試劑盒、Ion Library TaqMan 文庫定量試劑盒、530 OT2 試劑盒及測序芯片，均購自Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 細菌基因組提取及定量利用DNA 提取試劑盒提取E. coli JL05 基因組，采用熒光計測定提取的DNA 濃度，根據測定結果用Nuclease-Free Water 調整DNA 濃度至100 ng/μL。

1.4 進化分群鑒定根據Clermont 等方法對E. coli JL05進行四重PCR檢測[8]，擴增arpA、chuA、TspE4.C2和YjaA 基因，引物序列見表1。PCR 反應體系：2×SuperFi II Green PCR Master Mix 25 μL，0.5 μmol/L 的上下游引物各0.5 μL，DNA 模板2 μL，加Nuclease-Free Water 至50 μL。PCR 反 應 條 件：98 ℃30 s；98 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃5 min。擴增后在Experion 自動電泳系上電泳，判定分群結果。

1.5 MIC 及耐藥性檢測根據美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法的操作方法和標準，對8 類16 種常用抗菌藥物MIC 值的結果進行判定[9]。將E. coli JL05 接種于血瓊脂板培養(yǎng)基中，36 ℃孵育24 h 后從血瓊脂板中挑取3～5 個菌落，在CAMHBT 肉湯中乳化并比濁調整至0.5 McFarland 標準管，隨后接種于CMV3AGNF 革蘭氏陰性藥敏板，36 ℃孵育24 h 后在OptiRead 微生物生化分析儀上讀取MIC 值。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 基因文庫構建利用文庫構建試劑盒將E. coli JL05 基因組DNA 酶切為200 bp～300 bp 的片段，末端修復及標記后純化，根據測定的片段長度及濃度，采用2%的分離膠回收目的片段?；厥盏哪康钠卧跓晒舛縋CR 儀上定量，根據定量值調整輸入濃度至25 ng/μL。利用530 OT2 試劑盒進行油包水乳化PCR 反應，經富集后的模板裝載至530 芯片。

1.7 全基因測序及數(shù)據處理在Ion Torrent S5 測序儀上完成測序。測序后提取有效Reads 后運行Ge?neious Prime 2020.0 軟件進行拼接，拼接獲得的Con?tigs 上傳至PATRIC（https://patricbrc.org）數(shù)據庫利用Similar Genome Finder 比對，尋找最接近的參考序列，并以此為模板利用延展法組裝基因，最終形成0 gap 的基因全圖。

1.8 基因組的生物信息學分析組裝完成的E. coli JL05 全基因及質?；蛏蟼髦罭CBI，經PGAP 注釋后，檢測是否存在fec 基因座，并利用VFDB（https://card.mcmaster.ca）和CARD（https://card.mcmaster.ca）數(shù)據庫對毒力基因和耐藥基因進行檢測，分析E. coli JL05 耐藥表型和耐藥基因之間的相關性。

2 結 果

2.1 進化分群結果以arpA、chuA、TspE4.C2 和YjaA 為目的基因，采用四重PCR 方法檢測E. coli?JL05 的系統(tǒng)進化分群情況。結果顯示，對E. coli JL05 僅擴增出arpA 和TspE4.C2 目的基因。進化分群結果表明，JL05 屬于E. coli 的B2 群。

2.2 MIC 及耐藥性檢測結果采用微量肉湯稀釋法測定JL05 對16 種抗菌藥物的MIC，分析其耐藥性。結果顯示，JL05 對β-內酰胺、頭孢菌素、氨基糖苷、抗葉酸、喹諾酮、大環(huán)內酯、四環(huán)素、苯丙醇類等8 類14 種抗生素均耐藥，僅對磺胺異惡唑中介，對呋喃妥因敏感（表2）。MIC 檢測結果表明E. coli JL05 呈多重耐藥，且耐藥性嚴重。

表2 E. coli JL05 MIC 的測定結果Table 2 MIC test of E. coli JL05

2.3 全基因測序結果利用Ion Torrent S5 測序儀對E. coli JL05 進行全基因測序，共獲得≥Q20 的base 453 198 943 bp，總計2 028 231 條reads，其中最大讀長541 bp，最小讀長20 bp，平均讀長237 bp。經Geneious Prime 拼接后得到總長4 731 796 bp 的環(huán)狀DNA（GC 含量50.84%）和總長127 295 bp 的質粒基因（GC 含量51.52%）。全基因測序結果表明，E. coli JL05 測序深度達144 重，滿足基因特征分析要求。

2.4 基因組注釋結果組裝完成的全基因及質?；蛏蟼髦罭CBI，經PGAP 進行注釋得到E. coli JL05的基因總數(shù)為4 617 個（CP049936），其中包括4 507個編碼基因及110 個非編碼RNA。在非編碼基因中含78 個tRNA，10 個ncRNAs，22 個rRNA（5S，16S，23S）。E. coli JL05 質粒pARG01 經注釋得到的基因總數(shù)為145 個（CP049937）。經BLAST 比對，在E. coli JL05 編碼基因中不僅檢索到arpA 和TspE4.C2 基因，還發(fā)現(xiàn)了包含fecI、fecR、fecA、fecB、fecC、fecD、fecE 的fec 基因座，且其上下游存在IS1、IS3 轉座酶基因（圖1），證實E. coli JL05 為MPEC，與前期的乳內感染小鼠模型鑒定結果相符。

圖1 E. coli JL05 fec 基因座Fig. 1 fec locus of E. coli JL05

2.5 毒力基因分析結果采用VFDB 數(shù)據庫對E.coli JL05 全基因組進行比對。結果顯示，E. coli JL05 攜帶黏附、侵襲、轉運、鐵攝取、分泌系統(tǒng)、細菌毒素6 類80 個毒力基因，同時發(fā)現(xiàn)包括fyuA、irp1、irp2、ybtA、ybtE、ybtP、ybtQ、ybtS、ybtT、ybtU、ybtX 毒力基因在內的耶爾森菌強毒力島（HPI），其中包含酪氨酸重組酶（Tyrosine-type recombinase）、tRNA-Asn、tRNA-Ser 基因（圖2）。

圖2 E. coli JL05 中的耶爾森菌強毒力島Fig. 2 Yersinia high pathogenicity island of E. coli JL05

在E. coli JL05 所有的毒力基因中，屬于黏附與侵襲類的毒力因子及相關基因數(shù)量最多, 包括CFA/I菌毛（CFA/I fimbriae）、大腸桿菌層粘蛋白結合菌毛（E. coli laminin-binding fimbriae，ELF）、大腸桿菌共生菌毛（E. coli common pilus，ECP）、粘附素EaeH、出血性大腸桿菌菌毛（Hemorrhagic E. coli pilus,HCP）、I 型菌毛（Type I fimbriae）、腦內皮細胞侵襲（Invasion of brain endothelial cells，Ibes）7 種29 個毒力基因；其次是分泌系統(tǒng)中的ACE T6SS 基因，共18 個；再次為鐵攝取毒力因子，均為耶爾森菌素合成（Yersiniabactin siderophore）基因，共20 個。VFDB比對結果顯示，E. coli JL05 毒力因子的特征與E. coli O104∶H4 str. 2011C-3493 和E. coli VR50 接近（圖3）。

圖3 E. coli VR50、E. coli O104∶H4 str. 2011C-3493與E. coli JL05 毒力因子比較Fig. 3 Comparison of virulence factors of E. coli VR50,E. coli O104∶H4 str. 2011C-3493, and E. coli JL05

2.6 耐藥基因分析結果利用CARD 數(shù)據庫對E.coli JL05 基因組及質粒經進行抗性基因識別。結果顯示，E. coli JL05 染色體及質粒共有抗生素外排、抗生素失活、抗生素靶點改變、降低對抗生素的滲透性等4 類耐藥機制的53 個耐藥基因（表3）。在所有的耐藥基因中，涉及抗生素外排機制的耐藥基因最多，共42 個，占79.25%，主要分為耐藥結節(jié)分化家族（RND）、主要易化子超家族（MFS）、ATP 結合盒超家族（ABC）。且除acrD、baeR、baeS、emrA、em?rB、emrK、emrR、emrY、mdtA、mdtB、mdtC、mdtG、mdtH、msbA、tet（A）、YojI 基因僅對單類抗菌藥物耐藥外，其他基因均對多種藥物耐藥。

在E. coli JL05 質 粒pARG01 中 發(fā) 現(xiàn)aadA、dfrA17、TEM-1、sul2、APH（3''）-Ib、APH（6）-Id、tet（A）等耐藥基因高度集中在同一區(qū)域，且在這一區(qū)域中存在IS6、intI 等重組酶、轉座子及整合子基因（圖4）。

表3 E. coli JL05 耐藥基因分析結果Table 3 Resistance gene analysis results of E. coli JL05

圖4 質粒pARG01 部分耐藥基因分布Fig. 4 Distribution of some of the resistance genes in plasmid pARG01

在所有僅對單類抗菌藥物耐藥的基因中，以氨基糖苷類耐藥基因（AAC（3）-IId、aadA、APH（3''）-Ib、APH（6）-Id、acrD、baeR、baeS、cpxA、kdpE、mdtA、mdtB、mdtC）最多，其次是氟喹諾酮類耐藥基因（mdtH、emrB、emrR、emrA、gyrA）、肽類耐藥基因（bacA、eptA、pmrF、YojI、ugd）、頭孢菌素類耐藥基因（ampC、ampC1、ampH、PBP3）、核苷類耐藥基因（mdtN、mdtO、mdtP）、抗四環(huán)素類耐藥基因（emrK、emrY、tetA）、 磷 霉 素 耐 藥 基 因（mdtG、GlpT）、依法菌素耐藥基因（EF-Tu）、硝基咪唑耐藥基因（msbA）、二氨基嘧啶類耐藥基因（dfrA17）、β-內酰胺類耐藥基因（TEM-1）、葉酸類耐藥基因（sul2）。耐藥基因分析結果表明，E. coli JL05 攜帶的耐藥基因所代表的耐藥性與耐藥表型基本一致。

3 討 論

根據臨床感染情況，E. coli 可分為共生性、腸道致病性和腸道外致病性3 個類型，按照arpA、ch?uA、TspE4.C2 和YjaA 基因分為A、B1、B2、D 共4個系統(tǒng)進化群[8]。腸外致病性大腸桿菌（Extraintesti?nal pathogenic E. coli，ExPEC）是一類能引起腸道以外器官疾病的病原菌，其特點是攜帶的一些特別的毒力基因使該菌能夠侵入宿主的非消化道器官定植并誘導疾病的產生[10]，大多數(shù)ExPEC 屬于B2 和D群[11]。作為ExPEC 的一種，MPEC 的致病機制近年來逐漸被發(fā)現(xiàn)，Shlomo 等證實了由fecI、fecR、fe?cA、fecB、fecC、fecD、fecE 組 成 的fec 基 因 座 是MPEC 的核心及特征，其高度表達可使MPEC 從檸檬酸鹽中捕獲鐵，是E. coli 在牛乳腺定植所必需的[1]，其致病的解剖學部位和致病嚴重程度與其攜帶的毒力因子（Virulencefactor，VF）的種類和數(shù)量有關[12]。本實驗結果顯示，E. coli JL05 屬B2 群，且存在完整的fec 基因座，其毒力基因以黏附（29/80）、鐵攝?。?0/80）、分泌系統(tǒng)（18/80）3 類毒力因子為主，其中黏附毒力因子與細菌的定植有關，鐵攝取毒力因子與ExPEC 的侵襲、內化和系統(tǒng)感染有關，分泌系統(tǒng)毒力因子對毒力調控發(fā)揮作用。

在ExPEC 中，HPI 基因被認為是強毒株的特征之一，其相對不穩(wěn)定性與其在腸道桿菌不同種屬間的廣泛分布是毒力島通過基因水平轉移并獲得的一個強有力的證據[13]。HPI 基因長度為35 kb～45 kb，含有編碼鐵載體耶爾森菌素介導的鐵攝取系統(tǒng)以及編碼耶爾森菌素受體的基因，核心功能區(qū)為irp2-fyuA 基因簇[14]。研究表明含有HPI 的E. coli 在導致奶牛乳房炎的E. coli 中占有很高的比例。徐繼英等從7 個省市奶牛乳腺炎樣品分離得到的190 株E. coli 中檢出26.31%的irp2 基因，18.94%的fyuA 基因[15]。孫武文從140 株致犢牛腹瀉的E. coli 中檢出59 株HPI 陽性，其中fyuA 為49.15%，asn_tRNA_intB 為32.20%[16]。金文杰等檢測了216 株禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic E. coli，APEC），有44.9%的菌株攜帶有HPI[17]。本實驗結果顯示，E. coli JL05 的HPI 一端與int_tRNA-Asn 基因相連，證明了該基因由水平轉移而來。

細菌的耐藥性可分為天然的或是突變產生的，即染色體遺傳基因介導的耐藥性和獲得耐藥性以及質粒介導的耐藥性，后者所攜帶的耐藥基因更易于傳播，在臨床上占有重要地位[18]。在抗生素的選擇性壓力下細菌為了生存便通過各種耐藥機理與抗生素對抗，對抗菌藥物的耐藥機理主要分為以下幾類：產生滅活酶或鈍化酶破壞抗生素的活性；影響細胞膜滲透作用進而阻礙抗菌藥物的進入；加快細菌主動外排作用，排出菌體內的抗生素；改變抗生素作用靶位[19]。本實驗結果顯示，E. coli JL05 染色體及其質粒上攜帶的耐藥基因種類及數(shù)量十分豐富，但數(shù)量最多的還是外排機制的耐藥基因（42/53）。這些外排機制的耐藥基因多呈現(xiàn)對多類抗菌藥物的耐藥性，如H-NS、evgA、evgS 兼具了RND 和MFS 兩種耐藥機制，TolC 兼具了RND、MFS、ABC 3種耐藥機制，soxS 基因除兼具RND、MFS、ABC 3種外排機制外，還具有改變抗生素作用靶點和降低抗生滲透性的機制。多樣的抗生素外排系統(tǒng)提示E.coli JL05 一直處于高濃度的抗生素環(huán)境中，巨大的選擇壓力下形成了多藥耐藥的特性。

高通量測序技術不僅在新耐藥基因的發(fā)現(xiàn)、耐藥基因的傳播機制、耐藥菌、耐藥基因的進化分析等方面均起到了至關重要的作用[4]，還可以對包括基因組島、CRISPR-Cas 系統(tǒng)、前噬菌體在內的具有水平轉移功能的可移動元件進行預測[20]。本研究通過對E. coli JL05 的全基因測序，不僅發(fā)現(xiàn)了MPEC的特征基因-fec 基因座，還發(fā)現(xiàn)了大量的毒力基因及耐藥基因，且無論是fec 基因座，還是HPI 以及質粒中耐藥基因的上下游均發(fā)現(xiàn)了多種轉座子元件和I 型整合子，提示了E. coli JL05 復雜的進化史，有利于更全面地認識MPEC 菌株基因組的特征，為MPEC的感染治療和長期防控提供參考依據。