張紀(jì)文，王露露，李 芳，劉 杏，趙東明，步志高

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

CRISPR-Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）是存在于細(xì)菌或古生細(xì)菌中的一種抵御外源DNA侵入的適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)[1]。目前，CRISPR/Cas9作為一種能夠?qū)Σ溉閯?dòng)物細(xì)胞基因組進(jìn)行精準(zhǔn)修飾的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用在功能性基因的篩選[2]。最近，利用CRISPR/Cas9 高通量篩選技術(shù)研究基因功能、基因治療、藥物研發(fā)、疾病作用機(jī)理和病毒宿主相互作用的關(guān)鍵分子篩選等方面取得了重大進(jìn)展[3-6]?？袢∈且环N急性致死性的人獸共患傳染??；病毒在細(xì)胞內(nèi)寄生，具有嚴(yán)格的嗜神經(jīng)性[7]。當(dāng)前尚未見基于CRISPR/Cas9 高通量篩選研究狂犬病病毒（RV）感染神經(jīng)細(xì)胞的報(bào)道，因此本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的N2a-Cas9 單克隆細(xì)胞系，為基于CRISPR/Cas9全基因組高通量篩選技術(shù)探究神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵宿主基因調(diào)控RV 嗜神經(jīng)性提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞株人胚胎腎細(xì)胞（Human embo?rynic kidney cell，HEK293T）、鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞（N2a）細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。LentiCas9-Blast 質(zhì)粒、pXPR-011 質(zhì)粒、慢病毒pMD2.G、pSPA X2 骨架質(zhì)粒購(gòu)自Addgene 公司。

1.2 主要試劑大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔源Cas9 單克隆抗體（MAb）和HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（IgG-HRP）購(gòu)自Abcam 公司；Polybrene、殺稻瘟菌素（Blasticidin）、Puromycin 購(gòu)自Sigma 公司；CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 購(gòu)自Promega 公司；TransIT?-Len?ti Transfection Reagent 購(gòu)自Mirus 公司。

1.3 慢病毒的包裝和感染劑量的確定按照TransIT?-Lenti Transfection Reagent 說(shuō)明書方法，將LentiCas9-Blast、pMD2.G 和pSPA X2 共 轉(zhuǎn) 染 至HEK-293T，包裝慢病毒。72 h 后收集慢病毒上清液并離心，再用0.45 μm 濾器過濾。將慢病毒按照不同劑量（320 μL、160 μL、80 μL、40 μL、20 μL、10 μL、5 μL）感染N2a 細(xì)胞，設(shè)不加慢病毒及無(wú)殺稻瘟菌素的細(xì)胞對(duì)照組。慢病毒感染24 h 后，換為含有20 μg/mL 殺稻瘟菌素的完全培養(yǎng)基。對(duì)于無(wú)抗生素選擇的對(duì)照孔，換為完全培養(yǎng)基。在不同的感染劑量下分析存活細(xì)胞數(shù)的差異來(lái)確定最佳慢病毒感染劑量。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染和N2a 表達(dá)Cas9 蛋白細(xì)胞系的獲得將含LentiCas9-Blast 慢病毒的上清液以MOI 0.3感染N2a 細(xì)胞，加入含10 μg/mL Polybrene DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，更換為新鮮的選擇培養(yǎng)基。陰性對(duì)照組細(xì)胞全部死亡時(shí)，初步篩選出陽(yáng)性細(xì)胞。采用終點(diǎn)稀釋法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞株亞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后取細(xì)胞，用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，取細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE（7.5%），之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至0.2 μm PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉，以兔源Cas9 MAb（1∶1 000）為一抗，以羊抗兔IgG-HRP（1∶10 000）為二抗孵育。采用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)N2a 細(xì)胞系表達(dá)的Cas9 蛋白，最終獲得N2a-Cas9 細(xì)胞系。

1.5 表達(dá)Cas9 蛋白的N2a 細(xì)胞切割活力檢測(cè)按照1.3 的步驟將質(zhì)粒pXPR-011 包裝成慢病毒。用pXPR-011 包裝的慢病毒感染N2a 和N2a-Cas9 細(xì)胞系（MOI 1）。48 h 后，更換含有2 μg/mL 嘌呤霉素完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。14 d 后，將N2a 細(xì)胞系和轉(zhuǎn)導(dǎo)pXPR-011 的N2a 細(xì)胞系分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，用流式細(xì)胞儀CytomicsTMFC 500對(duì)樣本進(jìn)行分析。

1.6 N2a-Cas9 細(xì)胞活力檢測(cè)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N2a 和N2a-Cas9 細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞數(shù)約為5×104個(gè)/100 μL，每種細(xì)胞設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，接種到96 孔不透明細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。按照CellTiter-Glo 試劑盒操作步驟檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力，最后用Glomax96 microplate luminometer 檢測(cè)發(fā)光信號(hào)值，比較分析兩種細(xì)胞系的活力差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 慢病毒感染劑量的確定將含慢病毒上清液進(jìn)行倍比稀釋，使病毒以不同劑量感染N2a 細(xì)胞系。在抗生素加壓篩選72 h后，當(dāng)不加病毒對(duì)照組的細(xì)胞全部死亡，且無(wú)抗生素對(duì)照組細(xì)胞密度為80%～90%。使用Logos Luna Ⅱ自動(dòng)細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示慢病毒感染劑量與細(xì)胞存活率存在劑量依賴關(guān)系（圖1）。為了保證每個(gè)細(xì)胞僅感染一個(gè)慢病毒，本實(shí)驗(yàn)選取感染率為30%作為最佳慢病毒感染劑量。結(jié)果表明，40 μL 慢病毒為理想的病毒感染劑量，經(jīng)計(jì)算病毒滴度為1.8×106TU/mL。感染率=抗生素選擇條件下的細(xì)胞數(shù)量/無(wú)抗生素選擇下的細(xì)胞數(shù)量，病毒滴度（TU/mL）=（初使感染細(xì)胞數(shù)×感染率）/（每孔感染病毒體積）×1 000。

2.2 表達(dá)Cas9 蛋白N2a 細(xì)胞系的獲得用RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，以N2a 細(xì)胞裂解液為陰性對(duì)照。Western blot 結(jié)果顯示，2 號(hào)和9 號(hào)細(xì)胞系的Cas9 蛋白表達(dá)水平較高（圖2）。表明2 號(hào)和9 號(hào)比較適合后續(xù)N2a 細(xì)胞系Cas9 蛋白切割活力的檢測(cè)。

圖2 Western blot 分析N2a 細(xì)胞表 達(dá)的Cas9 蛋白Fig. 2 Western blot analysis for the expression of Cas9 protein in N2a cells

2.3 表達(dá)Cas9 蛋白的N2a 細(xì)胞切割活力檢測(cè)結(jié)果質(zhì)粒pXPR-011 同時(shí)含有GFP 和針對(duì)GFP 的gRNA 序列，細(xì)胞內(nèi)Cas9 蛋白會(huì)在gRNA 的引導(dǎo)下對(duì)GFP 基因進(jìn)行切割，因此細(xì)胞表達(dá)的GFP 越少，說(shuō)明Cas9 蛋白的切割活力越高。采用質(zhì)粒pXPR-011包裝成的慢病毒分別感染N2a 和N2a-Cas9 細(xì)胞系14 d 后，利用流式細(xì)胞儀CytomicsTMFC 500 對(duì)樣本進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，2 號(hào)單克隆細(xì)胞系表達(dá)的GFP較少，Cas9 切割活力較好，且Cas9 蛋白能在N2a 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)（圖3）。表明2 號(hào)N2a-Cas9 細(xì)胞系可以用于CRISPR 文庫(kù)篩選。

2.4 N2a-Cas9 細(xì)胞系活性的測(cè)定結(jié)果采用CellTiter-Glo 試劑盒檢測(cè)N2a 和2 號(hào)N2a-Cas9 細(xì)胞系的增殖活力。結(jié)果顯示，在相同的條件下，與對(duì)照細(xì)胞相比兩者無(wú)差異（圖4）。結(jié)果表明，Cas9 蛋白不影響細(xì)胞的增殖活性。

RV 侵入宿主細(xì)胞是由細(xì)胞受體介導(dǎo)的膜吸附啟動(dòng)的感染過程[8]。目前，一些研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種受體在病毒吸附階段發(fā)揮了重要作用，但這些均不是嚴(yán)格意義上的特異性受體[9]。有學(xué)者以小鼠N2a 細(xì)胞為模型研究RV 感染過程中的嗜神經(jīng)性，發(fā)現(xiàn)在感染過程中細(xì)胞伴侶蛋白CCTγ 能夠促進(jìn)RV 復(fù)制[10]。基于能夠進(jìn)行多重測(cè)序的二代測(cè)序技術(shù)，可以利用構(gòu)建的N2a-Cas9細(xì)胞，結(jié)合Addgene上的鼠全基因組sgRNA 文庫(kù)以及本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的ERA-GFP 報(bào)告病毒，在單細(xì)胞水平上進(jìn)行大規(guī)模干擾表型實(shí)驗(yàn)，篩選能調(diào)控RV 侵染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵宿主因子[11]。因此，本研究利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的N2a-Cas9 單克隆細(xì)胞系，為基于CRISPR/Cas9 全基因組高通量篩選技術(shù)鑒定RV 嗜神經(jīng)性相關(guān)特異性受體及探究病毒與宿主蛋白相互作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

圖3 檢測(cè)N2a 細(xì)胞Cas9 蛋白的切割活力Fig. 3 Detection of Cas9 protein cleavage activity in N2a cells

圖4 N2a-Cas9 細(xì)胞系中Cas 基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響Fig. 4 The analysis of cell proliferation activity on N2a-Cas9 cell line with the expression of Cas