黃海翔，宋洋銘，施建忠，趙東明，楊孝樸，陳化蘭*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

世衛(wèi)組織截止2020 年1 月20 日的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，H5N1 高致病性禽流感病毒（Highlypathogenic avian influenza，HPAI）的累計(jì)致死率高達(dá)52.85%[1]，而流感病毒在水禽和哺乳動(dòng)物之間的跨物種傳播能力則是這一疾病周期性在人群中爆發(fā)的原因之一，長期的病原-宿主共進(jìn)化使得不同物種體內(nèi)表達(dá)的MxA 均具有廣譜抑制RNA 病毒復(fù)制的能力，而哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的黏病毒抵抗蛋白（Myxo?virus resistance protein A，MxA）則對(duì)H5N1 高致病性禽流感病毒（HPAIV）有較高的敏感性[2-3]。流感病毒的感染過程中通常存在病毒蛋白與宿主因子相互結(jié)合并拮抗或增強(qiáng)特定生物學(xué)功能的情況，例如流感病毒NS1 與宿主DOK6 蛋白的相互作用使得NS1 蛋白抑制干擾素表達(dá)的功能受到拮抗[4-5]，因而這一過程中流感病毒密切參與并影響了宿主的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[6-7]。參照生物學(xué)通用互作庫數(shù)據(jù)集（BioGrid，https://thebiogrid.org/），本實(shí)驗(yàn)利用組學(xué)映射數(shù)據(jù)篩選的方法取得了流感病毒感染進(jìn)程相關(guān)的蛋白-蛋白互作（PPI）結(jié)果，通過富集運(yùn)算篩選了互作組因子以后重點(diǎn)分析了包含抗流感免疫因子的互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)包含AT 鉤結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白（Zinc-finger and AT hook domain containing protein，ZFAT）可能調(diào)控MxA 表達(dá)活性的信息。ZFAT 最早由Shirasawa[8]等人在甲狀腺自身免疫病模型中鑒定并發(fā)表，因其在造血干細(xì)胞分化調(diào)控和外周血淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)機(jī)制中的基礎(chǔ)性作用而受到關(guān)注[9]，盡管目前未有詳細(xì)闡明ZFAT 參與抗流感免疫機(jī)制的報(bào)道，但是ZFAT 與其他多個(gè)抗流感因子在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的密切聯(lián)系使得ZFAT 極有可能參與了抗流感免疫進(jìn)程，本實(shí)驗(yàn)擬利用siRNA 干擾技術(shù)下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)，檢測(cè)ZFAT 沉默對(duì)流感病毒復(fù)制的影響，并在流感病毒感染條件下檢測(cè)ZFAT 沉默對(duì)MxA 和干擾素等其他固有免疫因子表達(dá)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料總RNA 提取試劑盒（DP419）購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑HiS?cript III RT SuperMix for qPCR（+g DNA wiper）（R323）及qPCR 試劑ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Primestar DNA 聚合酶（R045A）購自TaKaRa 公司；轉(zhuǎn)染試劑Li?pofectamine LTX and Plus Reagent（15338100）、 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（13778）、Ham's-F12-K、Opti-MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基以及胎牛血清均購自賽默飛世爾科技公司；環(huán)乙酰亞胺（Cyclohexi?mide,CHX，GC17198）購自GlpBio 公司；siRNA 合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；4×蛋白上樣緩沖液（P1015）購自Solarbio；鼠抗ZFAT 單克隆抗體（sc-398058）購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，兔抗MxA（37849S）、GAPDH（2118）多抗以及DyLight 800 近紅外熒光染料偶聯(lián)二抗（5151，5257）購自CST公司。

1.2 細(xì)胞系、病毒以及雞胚A549 以及HEK293T細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存；流感病毒A/Anhui/2/2005（AH05）（H5N1）由禽流感國家參考實(shí)驗(yàn)室鑒定及保存；10日齡SPF雞胚由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供

1.3 ZFAT 影響MxA 表達(dá)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)利用BioGrid 互作組學(xué)數(shù)據(jù)庫獲取ZFAT 和MxA 相關(guān)的一、二級(jí)映射網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape 軟件中制作圖譜，將合并網(wǎng)絡(luò)依據(jù)CytoHubba 插件計(jì)算得出的各節(jié)點(diǎn)degree值并分級(jí)排布，最后通過富集分析獲取抗流感免疫的宿主因子名單，經(jīng)融合后篩選MxA 相關(guān)互作鏈條并將包含ZFAT 及中間節(jié)點(diǎn)的最簡網(wǎng)絡(luò)選出，單獨(dú)繪圖以方便后續(xù)驗(yàn)證及分析。

1.4 qPCR 引物設(shè)計(jì)與合成依據(jù)GenBank 中人源ZFAT（57623）、MxA（4599）、IFNA1（3439）、IFNB1（3456）、IFNL1（282618）、IRF3（3661）、IRF7（3665）、IRF9（10379）mRNA 序列，利用Primer-BLAST 設(shè)計(jì)qPCR 引物（表1），引物由吉林庫美生物技術(shù)有限公司合成。

表1 qPCR 引物Table 1 Primers for qPCR

1.5 ZFAT siRNA 的設(shè)計(jì)與篩選依據(jù)GenBank 人源ZFAT（57623）mRNA 序列設(shè)計(jì)3 條獨(dú)立的siRNA（表2），每條siRNA 取20 pmol 加入50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻后加入1.5 μL RNA iMAX 試劑，滴狀混勻，室溫靜置孵育15 min，懸浮干擾A549 細(xì)胞后37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)36 h。試驗(yàn)設(shè)scrambled siRNA 干擾后的A549細(xì)胞為對(duì)照，通過qPCR 和western blot 試驗(yàn)檢測(cè)上述siRNA 干擾對(duì)ZFAT 的轉(zhuǎn)錄和翻譯的抑制效果并選取最佳siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 siRNA 序列Table 2 siRNA sequence

收獲經(jīng)ZFAT siRNA 和scrambled siRNA 干擾的A549 細(xì)胞，按照總RNA 提取試劑盒說明提取RNA，測(cè)量樣品濃度后每份樣品取1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄，利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 進(jìn) 行qPCR 檢測(cè)，選取表1 中ZFAT-qPCR-F/R 引物對(duì)按照表3 程序檢測(cè)ZFAT 的轉(zhuǎn)錄活性，GAPDH-qPCR-F/R 引物對(duì)用于檢測(cè)A549 細(xì)胞內(nèi)參基因GAPDH 的轉(zhuǎn)錄活性，通過相對(duì)定量計(jì)算2-ΔΔCt值得到目的基因表達(dá)差異，利用GraphPadPrism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表3 qPCR 反應(yīng)程序Table 3 qPCR program

收獲經(jīng)ZFAT siRNA 和scrambled siRNA 干擾的A549 細(xì)胞，制備western blot 檢測(cè)樣品，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂乳封閉后，以稀釋的鼠抗ZFAT 和GAP?DH 抗體（1∶1 000）4 ℃過夜孵育，次日經(jīng)室溫孵育近紅外熒光染料偶聯(lián)二抗（1∶500）1.5 h 后，western blot檢測(cè)ZFAT和GAPDH 的條帶亮度，采用ImageJ 軟件進(jìn)行相對(duì)灰度值分析。

1.6 流感病毒復(fù)制的滴定試驗(yàn)流感病毒原液經(jīng)倍比稀釋后以MOI 0.001 感染經(jīng)ZFAT siRNA 和scram?bled siRNA 干擾的A549 細(xì)胞，37 ℃孵育1 h 后吸凈上清并用PBS 洗滌細(xì)胞，加入1 mL Opti-MEM 培養(yǎng)基置于37 ℃孵育，24 hpi、48 hpi 分別收獲培養(yǎng)基上清并接種于10日齡SPF雞胚中測(cè)定EID50。

1.7 流感病毒同步感染試驗(yàn)與ZFAT 沉默后對(duì)MxA和干擾素等其他固有免疫因子表達(dá)活性的檢測(cè)流感病毒以MOI 1 感染CHX 處理后的ZFAT siRNA 和scrambled siRNA 干擾A549 細(xì)胞，4 ℃孵育1 h 吸凈上清并用PBS 洗滌細(xì)胞，加入1 mL Opti-MEM 培養(yǎng)基置于37 ℃孵育，分別于6 hpi、12 hpi收獲細(xì)胞樣品，將scrambled siRNA 干擾設(shè)為對(duì)照，選取表1 中除ZFATqPCR-F/R 以外的所有引物對(duì)，GAPDH-qPCR-F/R 用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)參基因，參考1.5 所示方法，收獲流感病毒感染前后的A549 細(xì)胞樣品，利用表3 所示程序通過qPCR 檢測(cè)抑制ZFAT 表達(dá)在流感病毒感染前后對(duì)MxA、 IFNA1、 IFNB1、 IFNL1、 IRF3、 IRF7、IRF9、JAK1 以及STAT1 轉(zhuǎn)錄活性的影響，同時(shí)參照1.5 所示western blot 方法，利用兔抗MxA 一抗檢驗(yàn)下調(diào)ZFAT表達(dá)后對(duì)MxA翻譯的影響。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)BioGrid 互作組學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)融合和富集算法處理后，在Cytoscape 軟件中利用Cyto?Hubba 插件將節(jié)點(diǎn)分級(jí)排列，選取以MxA 和ZFAT 為中心的一級(jí)和二級(jí)網(wǎng)絡(luò)單獨(dú)繪圖（圖1），圖示中ZFAT 與MxA 處于同一個(gè)互作關(guān)系網(wǎng)，節(jié)點(diǎn)顏色表示與該節(jié)點(diǎn)蛋白存在直接互作的蛋白數(shù)量，紅色越深則表示該節(jié)點(diǎn)參與的互作關(guān)系越復(fù)雜，其中熱休克蛋白B1（HSPB1）及與之直接互作的干擾素刺激基因15（ISG15）、三聯(lián)基序蛋白25（TRIM25）均有參與抗流感免疫的報(bào)道[10-12]，因而該網(wǎng)絡(luò)可以被簡單劃分為相對(duì)獨(dú)立的兩個(gè)部分，即以MxA 表達(dá)調(diào)節(jié)為核心功能的PPI 網(wǎng)絡(luò)和以ZFAT 為中心的PPI 網(wǎng)絡(luò)，其中HSPB1 是與ZFAT 存在直接互作的3 個(gè)蛋白之一，在連接兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)的同時(shí)也體現(xiàn)出ZFAT 具有參與固有免疫進(jìn)程的潛在可能，考慮到MxA 通常是受到固有免疫信號(hào)調(diào)控的下游效應(yīng)分子，推測(cè)ZFAT 可能對(duì)MxA 的表達(dá)或功能具有調(diào)控作用。

圖1 ZFAT 影響MxA 表達(dá)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 1 Bioinformatical prediction for ZFAT influencing MxA expression

2.2 ZFAT siRNA-3 干擾后ZFAT 蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果ZFAT siRNA 和scrambled siRNA 干擾后的A549細(xì)胞經(jīng)37 ℃孵育36 h 后收獲細(xì)胞樣品，將scrambled siRNA 設(shè)為條件對(duì)照，通過qPCR 及western blot 試驗(yàn)檢測(cè)ZFAT siRNA-1、ZFAT siRNA-2、ZFAT siRNA-3在A549 細(xì)胞上的干擾效果。qPCR 結(jié)果顯示，siRNA干擾A549細(xì)胞中ZFAT的2-ΔΔCt值相比對(duì)照細(xì)胞分別下調(diào)了2.97%、73.73%（p＜0.01）和91.33%（p＜0.01），其中ZFAT siRNA-3 干擾效果最佳（圖2）。Western blot結(jié)果顯示ZFAT 在ZFAT siRNA-3 干擾的A549 細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)抑制現(xiàn)象，ZFAT 條帶的相對(duì)灰度值相比對(duì)照下調(diào)了77.10%（圖3），表明通過ZFAT siRNA-3干擾A549細(xì)胞可以有效降低ZFAT的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性。

圖2 ZFAT 影響MxA 表達(dá)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 2 Bioinformatical prediction for ZFAT influencing MxA expression

圖3 ZFAT siRNA-3 干擾抑制ZFAT 蛋白表達(dá)Fig. 3 ZFAT protein expression inhibited by ZFAT siRNA-3 interference

2.3 下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)對(duì)流感病毒復(fù)制影響結(jié)果將流感病毒以MOI 0.001 感染ZFAT siRNA-3和scrambled siRNA干擾后的A549細(xì)胞，24 hpi、48 hpi分別收獲無血清培養(yǎng)基上清，通過接種雞胚測(cè)定EID50。結(jié)果顯示病毒滴度在24 hpi 和48 hpi 相比對(duì)照分別降低了2.61 倍（p＜0.05）和8.25 倍（p＜0.01）（圖4），表明ZFAT沉默可以顯著抑制流感病毒復(fù)制。

2.4 下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)對(duì)MxA 的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性影響結(jié)果將ZFAT siRNA-3 和scrambleds iRNA 干擾后的A549 細(xì)胞進(jìn)行流感病毒同步感染后6 hpi、12 hpi 分別收集細(xì)胞樣品，將scrambled siRNA 干擾設(shè)為條件對(duì)照，通過qPCR和western blot 檢測(cè)ZFAT表達(dá)抑制在流感病毒感染前后對(duì)MxA 轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響。qPCR 結(jié)果顯示：在ZFAT 表達(dá)受到抑制的情況下，MxA 的2-ΔΔCt值 在 未 感 染、6 hpi 以 及12 hpi 的A549 細(xì)胞中相比對(duì)照分別上調(diào)了3.32 倍（p＜0.01）、1.68 倍（p＜0.01）以及1.42 倍（p＜0.01）（圖5），western blot 結(jié)果顯示，ZFAT 沉默后的MxA 蛋白表達(dá)在未感染、6 hpi 以及12 hpi 的A549 細(xì)胞中相比對(duì)照出現(xiàn)上調(diào)，MxA 條帶的相對(duì)灰度值分別上調(diào)了1.90 倍、1.15倍和1.19 倍（圖6）。表明抑制ZFAT 的表達(dá)可以顯著提升A549細(xì)胞中MxA的表達(dá)。

圖4 ZFAT 表達(dá)沉默抑制流感病毒的復(fù)制Fig. 4 Silencing of ZFAT expression leads to the inhibition of influenza virus replication

圖5 ZFAT siRNA-3 干擾在流感病毒感染前后的A549 細(xì)胞中上調(diào)MxA 轉(zhuǎn)錄活性Fig. 5 MxA transcription activity in A549 cells upregulated by ZFAT siRNA-3 interference before or after influenza virus infection

圖6 ZFAT siRNA-3 干擾在流感病毒感染前后的A549 細(xì)胞中激活MxA 蛋白表達(dá)Fig. 6 MxA protein expression in A549 cells induced by ZFAT siRNA-3 before or after influenza virus infection

2.5 下調(diào)ZFAT 表達(dá)對(duì)干擾素及下游信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄活性影響結(jié)果將ZFAT siRNA-3 和scrambled siR?NA 干擾后的A549 細(xì)胞進(jìn)行流感病毒同步感染后分別收集6 hpi、12 hpi的細(xì)胞樣品，將scrambled siRNA 干擾設(shè)為對(duì)照，通過qPCR 檢驗(yàn)ZFAT 的表達(dá)抑制在流感病毒感染前后對(duì)干擾素及下游信號(hào)因子轉(zhuǎn)錄活性的影響。qPCR 結(jié)果顯示，ZFAT 沉默使得A549 細(xì)胞在6 hpi 相比對(duì)照表現(xiàn)出I 型、III 干型擾素以及下游信號(hào)分子IRF3、IRF7、IRF9轉(zhuǎn)錄活性的顯著上調(diào)，其中IF?NA1、IFNB1 和IFNL1 的2-ΔΔCt值分別相比對(duì)照上升了2.02 倍、1.84 倍以及1.42 倍（p＜0.05）；IRF9、JAK1、STAT1 的2-ΔΔCt值在12 hpi 相比對(duì)照呈現(xiàn)顯著抑制，分別降低了0.52 倍、0.29 倍以及0.37 倍（p＜0.01）（圖7）。表明下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)可以廣泛影響干擾素及其干擾素受體下游信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄活性。

圖7 對(duì)干擾素及其下游信號(hào)分子轉(zhuǎn)錄活性的qPCR 檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 Transcriptional activity of IFNs and downstream molecules detected by qPCR

3 討 論

流感病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制過程始終受到固有免疫系統(tǒng)的監(jiān)控和抗病毒免疫機(jī)制的抑制[13-14]，病原-宿主共進(jìn)化使得病原不斷獲得有效的免疫逃逸機(jī)制來完成自身的復(fù)制[11]。相比于其他亞型的流感病毒，哺乳動(dòng)物表達(dá)的MxA 對(duì)H5N1 禽流感病毒具有更強(qiáng)的特異性和敏感度，同時(shí)MxA 表達(dá)活性受到I 型、III 型干擾素的嚴(yán)密調(diào)控[15]，MxA 通過抑制病毒vRNP 復(fù)合體的入核進(jìn)程與聚合酶功能達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用[2]。宿主與病原長期斗爭的歷史使得雙方不斷發(fā)生適應(yīng)性的進(jìn)化，然而生物復(fù)雜的進(jìn)化歷史又使得任何適應(yīng)性背后的分子機(jī)制無法成為絕對(duì)獨(dú)立的單元，蛋白互作組學(xué)使得研究者有機(jī)會(huì)通過分子之間的共軛結(jié)合辨析一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)中特定因子可能發(fā)揮的作用[16]。

本實(shí)驗(yàn)通過蛋白互作組預(yù)測(cè)ZFAT 可能參與了固有免疫因子MxA 的表達(dá)調(diào)控，而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)可以顯著提高M(jìn)xA 的轉(zhuǎn)錄與翻譯活性，并抑制H5N1 HPAIV 在A549 細(xì)胞中的復(fù)制，在細(xì)胞受到感染以前，下調(diào)ZFAT 表達(dá)促使A549 細(xì)胞提前進(jìn)入“抵抗?fàn)顟B(tài)”，所以當(dāng)感染發(fā)生時(shí)活躍的MxA 表達(dá)及其抗病毒效應(yīng)將持續(xù)抑制病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制；H5N1 HPAIV感染后，下調(diào)ZFAT表達(dá)使得細(xì)胞在顯著提升干擾素及其下游信號(hào)分子轉(zhuǎn)錄活性的同時(shí)具有了更強(qiáng)的MxA表達(dá)活性與抗病毒能力。

MxA的表達(dá)激活是固有免疫信號(hào)通路末端效應(yīng)的一部分，正常細(xì)胞受到病毒感染以后誘導(dǎo)表達(dá)大量的I 型和III 型干擾素，α 干擾素受體發(fā)出的下游信號(hào)使得大量信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）以二聚體磷酸化形式入核并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，大幅提升干擾素應(yīng)答元件（ISRE）中包括MxA 在內(nèi)的所有效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄活性，以此使得細(xì)胞產(chǎn)生了強(qiáng)大的抗病毒能力[17-18]，固有免疫應(yīng)答產(chǎn)生的大量I 型和III 型干擾素是誘導(dǎo)MxA 表達(dá)的必要條件[15]。然而本研究中ZFAT 沉默卻可以抑制未被流感病毒感染的A549 細(xì)胞中I 型干擾素的轉(zhuǎn)錄活性，效應(yīng)分子MxA 與干擾素表達(dá)活性在ZFAT 表達(dá)下調(diào)后表現(xiàn)出的分化提示ZFAT 可能在正常生理?xiàng)l件下參與了兩類固有免疫因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，即在維持I 型干擾素轉(zhuǎn)錄水平的同時(shí)，抑制III 型干擾素以及MxA 等干擾素效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)病毒感染發(fā)生時(shí)，能夠協(xié)助流感病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的NS1 蛋白等病毒因子可能會(huì)與ZFAT 通過相互作用強(qiáng)化對(duì)MxA 等固有免疫效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄抑制作用；而在ZFAT 表達(dá)下調(diào)的情況下，這一免疫逃逸機(jī)制受到抑制并使得MxA 的表達(dá)高于對(duì)照細(xì)胞，進(jìn)而影響流感病毒的復(fù)制，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證ZFAT 與H5N1 HPAIV 的相互作用并嘗試找到ZFAT 鋅指結(jié)構(gòu)域的核酸結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)ZFAT 在流感病毒感染進(jìn)程中發(fā)揮的作用，相信隨著固有免疫研究的深入，更多的真相將會(huì)被一步步揭示出來。