郭梅燕 劉保友 李洋 張曉英 陳玉國 丁新華

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，泰安 271018；2. 山東蓬勃生物科技有限公司，泰安 271000；3. 河南省項城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，項城 466200；4. 山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺 265500；5. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，許昌 461000）

煙草是一種具有藥用價值、食用價值、工業(yè)價值的重要經(jīng)濟作物，也是基礎(chǔ)研究或應(yīng)用研究的理想模式植物，為植物科學(xué)研究提供了極大便利［1］。農(nóng)藥在防病增產(chǎn)、提高收入等方面做出了較大貢獻(xiàn)，但農(nóng)藥的濫用和超劑量使用時常造成面源污染、殘留超標(biāo)等［2］。尋求環(huán)境相容性好、經(jīng)濟且高效的植保新方法是解決農(nóng)藥負(fù)面影響的亟需。

植物免疫誘抗劑具有促進植物生長、激活自身免疫系統(tǒng)提高抗病能力的作用，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展要求，成為農(nóng)藥熱門發(fā)展領(lǐng)域之一［3-4］。利用外在激發(fā)子或誘導(dǎo)子激發(fā)或誘發(fā)植物免疫抗性，將激發(fā)子或誘導(dǎo)子制成免疫或誘抗制劑，用于植物病害防控。迄今發(fā)現(xiàn)的激發(fā)子主要有激活蛋白、寡糖、水楊酸等［5］。邱德文課題組從極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）獲得植物免疫蛋白PeaT1和Hrip1，在煙草、水稻、小麥等植物上均具有抗病性能［6-9］。海帶多糖、殼寡糖等寡聚糖具有增強抗病原菌、誘導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)抗病性的能力［10-12］。作為防御信號途徑關(guān)鍵物質(zhì)的水楊酸可誘導(dǎo)一系列抗性相關(guān)基因表達(dá)和影響許多生理過程［13-14］。

智能聰（ZNC）是一種從野生沙刺內(nèi)生菌宛氏擬青霉菌經(jīng)乙醇提取的新型免疫誘抗劑［15］，具有促進植物生長、提升抗病等抗逆能力、增加產(chǎn)量等作用。含ZNC的氨基酸水溶肥料能促進馬鈴薯抗病基因和生長相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮促生抗病能力，誘導(dǎo)活性氧爆發(fā)，迅速合成胼胝質(zhì)并沉積，根尖生長素水平提升，調(diào)節(jié)根系對N和P的吸收［16］。ZNC水溶肥料增加水稻的株高、穗長、穗數(shù)等指標(biāo)，促生增產(chǎn)效果明顯［17］。植物免疫誘抗劑自身無離體殺菌或抑菌活性［18］，但以上ZNC相關(guān)研究均以灌施方式開展的試驗，并表明其在極低用量下具有促生抗病效果。為明確ZNC在重要經(jīng)濟價值作物和模式作物煙草上的應(yīng)用效果，開展了ZNC在煙草上噴霧并評價其促生、抗病效果的試驗，旨在為植物免疫誘抗劑合理推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為中煙100；免疫誘抗劑ZNC是宛氏擬青霉乙醇提取物［15］，由山東蓬勃生物科技有限公司提供。試驗地設(shè)在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗田，歷年煙草病毒病、赤星病等發(fā)生普遍且均勻。土壤類型為沙壤土，有機質(zhì)19.39 g/kg，全氮0.97 g/kg，速效磷0.13 g/kg，速效鉀0.16 g/kg。

1.2 方法

將ZNC設(shè)3個濃度梯度，分別為50 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL，以清水作為空白對照（CK），共計4個處理。每處理重復(fù)4次，共16個小區(qū)，每個小區(qū)2行，每行20株，株行距為110 cm×55 cm。小區(qū)面積40 m2，隨機排列。

共施藥3次，分別在生根期（5月12日）、團棵期（6月10日）、打頂期（7月15日）各噴施一次。每次施藥后10-14 d，調(diào)查株高、葉數(shù)、莖圍、最大葉面積以及各小區(qū)的發(fā)病情況。生根期、團棵期、打頂后分別調(diào)查病毒病、根莖病害和葉斑類病害，各病害分級標(biāo)準(zhǔn)均按國家煙草病害調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 23222-2008煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》進行。采收時，采收煙葉掛桿烘烤，測定各小區(qū)產(chǎn)量及煙葉品質(zhì)。選擇中桔二C2F煙葉送檢，化學(xué)成分測定依據(jù)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對總糖、還原糖等指標(biāo)進行測定。

采用Excel和SPSS數(shù)據(jù)處理軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析，采用Duncan法進行多重比較，檢驗各處理平均值在P＜0.05水平的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 生根期施用ZNC對煙草生長和病毒病發(fā)生的影響

煙草生根期噴施ZNC后10 d調(diào)查煙株生長發(fā)育。結(jié)果表明，不同的ZNC濃度對煙草影響有所差別，50 ng/mL對增加株高和最大葉面積具有顯著的作用，與CK相比分別增加0.57 cm和10.21 cm2；500 ng/mL ZNC噴施后最大葉面積較CK增加了2.63 cm2，但株高與CK無顯著性差異；1000 ng/mL ZNC對株高和最大葉面積具有抑制作用，均顯著低于CK，分別降低0.33 cm和4.06 cm2（表1）。在莖圍和有效葉片數(shù)指標(biāo)方面，各處理間無顯著性差異。因此，ZNC兩濃度50 ng/mL和500 ng/mL在生根期對煙草具有一定的生長促進作用。

5月底隨著蚜蟲的遷飛，大田開始出現(xiàn)蚜傳病毒病。通過對大田病毒病的調(diào)查可知，施用免疫誘抗劑ZNC后，各處理區(qū)的發(fā)病率和病指均低于CK，且隨著ZNC濃度增加，發(fā)病率和病指呈下降趨勢（表2）。50 ng/mL和500 ng/mL兩處理的發(fā)病率相近，但500 ng/mL病指為1.67，較50 ng/mL的2.36減少0.69。1000 ng/mL發(fā)病率和病指僅為7.50%和1.94，比CK分別降低40.94%和50.13%?？共》矫?，500 ng/mL ZNC對煙草病毒病的防效最高，為57.07%，其次為1000 ng/mL的防效，均顯著高于50 ng/mL的抗病效果。

表1 生根期ZNC對煙草生長的影響

表2 生根期ZNC對煙草病毒病的防效

2.2 團棵期施用ZNC對煙草生長和煙草根莖病的影響

團棵期噴施ZNC 1次，施藥后10 d，調(diào)查煙草株高、莖圍、節(jié)間距等農(nóng)藝性狀后得知，與CK相比，ZNC 50 ng/mL和500 ng/mL對煙草株高和最大葉面積具有顯著促進作用，株高分別增加4.08 cm和3.36 cm，最大葉面積分別增加33.94 cm2和21.19 cm2（表3）。1000 ng/mL對生長表現(xiàn)出顯著的抑制作用，株高和最大葉面積分別較CK減少2.25 cm和29.85 cm2。但在莖圍、節(jié)間距、有效葉片數(shù)等指標(biāo)方面，各處理間均未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異顯著性。

團棵期是煙田根莖類病害的發(fā)生初期，為驗證ZNC能否提高煙株免疫力和降低根莖類病害的發(fā)病率，經(jīng)過調(diào)查各小區(qū)內(nèi)煙草根莖類病害（根腐病/黑脛?。┑陌l(fā)生情況可知，ZNC對煙草根莖類病害具有一定的誘導(dǎo)抗病作用，發(fā)病率和病指比CK低，防效在10.93%-27.73%之間（表4）。ZNC 3個濃度梯度中，500 ng/mL時對煙草根莖類病害的防效最高，為27.73%。

2.3 打頂期施用ZNC對煙草生長和煙草后期葉斑類病害的影響

煙株打頂后消除了頂端優(yōu)勢，有利于中下部葉片的生長，增加干物質(zhì)積累，提高煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)。打頂期噴施ZNC免疫誘抗劑10 d后調(diào)查，ZNC施用后50 ng/mL和500 ng/mL處理的煙草株高未顯著增加，但最大葉面積顯著增加，分別為159.79 cm2和113.80 cm2。1000 ng/mL處理在打頂期也表現(xiàn)出抑制生長的作用，株高、莖圍、最大葉面積等指標(biāo)均顯著低于CK和ZNC 其他兩個處理（表5）。

表3 團棵期ZNC對煙草生長的影響

表4 團棵期ZNC對煙草根莖病害的防效

煙草打頂后，葉部病害主要有赤星病、野火病、角斑病等，常在田間混合發(fā)生，因此將它們作為葉斑病害統(tǒng)一進行了調(diào)查（表6）。施用免疫誘抗劑ZNC后葉斑病害發(fā)病率和病指均低于CK，50 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL時相對防效分別為20.00%、29.10%、18.38%，表明使用ZNC對煙草葉斑病害具有一定的免疫誘導(dǎo)抗性。

2.4 施用ZNC后對煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

在煙草大田生長期，分別在生根期、團棵期和打頂期施用3次ZNC免疫誘抗劑后，對煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，經(jīng)過分小區(qū)掛牌采收測產(chǎn)和品質(zhì)分析，可得知，ZNC 50 ng/mL和500 ng/mL對煙草均具有顯著增產(chǎn)作用，分別比CK增產(chǎn)141.48 kg/hm2和127.56 kg/hm2，但1000 ng/mL呈現(xiàn)減產(chǎn)不良影響，較CK減少247.22 kg/hm2（表7）。

表5 打頂期ZNC對煙草生長的影響

表6 打頂期ZNC對煙草葉斑類病害的防效

表7 ZNC對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

高濃度的ZNC處理在提升總糖、還原糖、總氮、K2O等煙草品質(zhì)指標(biāo)方面表現(xiàn)突出，但50 ng/mL處理對品質(zhì)未出現(xiàn)顯著的影響（表7），3個濃度處理對煙堿和氯未呈現(xiàn)顯著影響。500 ng/mL和1000 ng/mL處理的總糖分別為31.50%和28.75%，百分點較CK分別提高5.18和2.43；兩處理還原糖的百分含量分別較CK提高4.34和2.28；兩處理總氮含量分別為2.53%和2.43%，均顯著高于CK的1.83%；同時，促進煙草葉片中鉀的含量，兩高濃度處理的K2O含量分別為1.98%和1.90%，均顯著高于CK。

3 討論

免疫誘抗劑通過植株整體協(xié)調(diào)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗病作用，其抗病作用存在滯后性，有別于傳統(tǒng)殺菌劑的作用方式。煙草周年發(fā)生的病害種類差異較大，因此每次施用ZNC后調(diào)查不同種類的病害。病毒病僅能從提高作物免疫力減輕發(fā)生程度，本研究表明ZNC各濃度梯度均可提高煙草抗病性，且在煙草病毒病的防效上與目前已經(jīng)推廣應(yīng)用的植物誘抗劑氨基寡糖素對煙草病毒病的防效相當(dāng)。余清等［19］研究報道氨基寡糖素噴施4次對煙草病毒病的防效為64.19%，蘇小記等［20］研究報道2.0%氨基寡糖素水劑連續(xù)噴施3-4次對煙草病毒病的防效達(dá)到72.4%-77.9%。在本研究中ZNC 500 ng/mL施用1次，對煙草病毒病的防效為57.07%（表2）。羅剛等［21］報道氨基酸寡糖素與鉀營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑配施防治煙草花葉病毒的平均防效為56.31%。ZNC免疫誘抗劑與氨基寡糖素一樣，在煙草病毒病防治上具有廣闊的應(yīng)用前景。另外，通過本研究還發(fā)現(xiàn)，ZNC可減輕煙草根莖類病害及后期葉部病害的發(fā)生程度。

植物免疫誘抗劑ZNC不僅可誘導(dǎo)煙草對病害產(chǎn)生免疫，而且具有增產(chǎn)和提升煙草品質(zhì)的效果。ZNC 50 ng/mL和500 ng/mL分別較CK增產(chǎn)6.00%和5.41%，且500 ng/mL還增加了總糖、還原糖、總氮、K2O等指標(biāo)的含量，總氮含量增加可能與ZNC調(diào)節(jié)N吸收有關(guān)［15-16］。這與之前報道的ZNC具有促進擬南芥生長［15］、提高馬鈴薯性狀和產(chǎn)量［16］、優(yōu)化水稻產(chǎn)量指標(biāo)［17］等研究結(jié)果相一致，表明ZNC比氨基酸寡糖素具有更多的功能；此外，總糖、還原糖含量還可提升煙葉感官質(zhì)量［22］。

本研究所試驗的新型免疫誘抗劑ZNC來源于野生沙刺內(nèi)生菌宛氏擬青霉菌Paecilomyces variotii。內(nèi)生菌所起的作用被認(rèn)為與菌根真菌相似，均具有內(nèi)生互惠共生關(guān)系、與環(huán)境相容性高且安全等優(yōu)勢［23-24］。擬青霉屬Paecilomyces包含100多個種，具有多種作用［25］，其中P. variotii已用于魚和人類上控制致病細(xì)菌侵染［26-27］，表明該菌具有很高的安全性。但P. variotii可促進植物生長的研究相對較少，通常認(rèn)為該類內(nèi)生菌所發(fā)揮的改善作物生長作用與其抑制線蟲病發(fā)生有關(guān)［28］。在作用機理方面有少量研究報道，P. variotii分離物促進產(chǎn)生含鐵細(xì)胞和IAA，提升植物生長［29］。Lu等［15］研究表明ZNC在擬南芥上具有促生抗病作用，在1-10 ng/mL極低濃度下可誘導(dǎo)ROS積累、胼胝質(zhì)沉淀和PR基因表達(dá)，誘導(dǎo)抗性依賴于SA生物合成及信號途徑。Peng等［30］明確了ZNC在100-150 ng/mL濃度下可誘導(dǎo)ROS積累和增加SA含量，從而增強煙草對馬鈴薯X病毒的抗病能力。本研究ZNC對田間煙草病毒具有良好的防效，其機理可能與Peng等［30］研究的ZNC作用機理有關(guān)，但仍需開展試驗驗證。

另外，植物免疫誘抗劑對作物的保護作用和促進作用受環(huán)境條件、施用劑量和施用時間等限制，施用不當(dāng)會產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。達(dá)到一定劑量的藥物才能發(fā)揮良好的效應(yīng)作用，但超過合理的劑量范圍就可能表現(xiàn)為毒性效應(yīng)，如1000 ng/mL ZNC在煙草上噴霧施用明顯表現(xiàn)出抑制煙草生長的負(fù)面影響。本研究確定了新型植物免疫誘抗劑ZNC在重要經(jīng)濟作物和模式作物煙草上的應(yīng)用效果，確定了以500 ng/mL濃度噴霧使用既可減輕病害發(fā)生程度又能增加產(chǎn)量。室內(nèi)環(huán)境下，ZNC對擬南芥在1-10 ng/mL范圍內(nèi)表現(xiàn)出促進生長抗病的功能［15］，提升煙草抗馬鈴薯X病毒的劑量范圍為100-150 ng/mL［30］，但本研究明確的500 ng/mL ZNC噴霧使用濃度更適于煙草田間實際生產(chǎn)，且用量低于其他同類功能性產(chǎn)品。市面上現(xiàn)在使用的氨基酸寡糖素田間噴霧用量一般為3×104-5×104ng/mL，為ZNC用量的60-100倍，這體現(xiàn)出ZNC極高活性的特性。盡管灌施ZNC可顯著提升水稻、馬鈴薯等作物的產(chǎn)量［16-17］，但ZNC灌施用量和成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于噴霧的。另外，ZNC采用噴霧方式應(yīng)用相對簡便，且可以與葉面肥、農(nóng)藥等現(xiàn)混現(xiàn)用。下一步還將繼續(xù)評價ZNC與化學(xué)藥劑等農(nóng)用化學(xué)品混用后的效果，探索其減少農(nóng)用化學(xué)品使用量的作用。

4 結(jié)論

本研究通過大田試驗確定了新型植物免疫誘抗劑ZNC在煙草上的促生抗病效果，明確ZNC對煙草具有較好的促生、抗病的作用。確定出ZNC田間噴霧濃度為500 ng/mL時效果最佳，不僅可激發(fā)煙草產(chǎn)生免疫和降低了不同病害的發(fā)生程度，而且提升了煙草產(chǎn)量和品質(zhì)，具有較好的推廣應(yīng)用前景。