撒世娟 伍涵宇 張曉萍 鄭蕊，2 姚新靈，2

（1. 寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧夏大學(xué)，銀川 750021；2. 西部特色生物資源保護(hù)及利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧夏大學(xué)，銀川 750021）

擬南芥基因組注釋中最早識(shí)別了RSM（RADIALIS-like SANT/MYB）的存在，RSM僅含有單個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，這是其不同于其它MYB轉(zhuǎn)錄因子的組成特征［1］，在已測(cè)序的植物基因組中均有RSM基因；在比較擬南芥和水稻MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化關(guān)系研究中，就RSMR是否屬于MYB基因家族存在不同觀點(diǎn)［1-2］。

早期有研究將擬南芥中含有單個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的4個(gè)RSM蛋白（RSM 1、RSM 2、RSM 3和RSM 4）歸為單MYB轉(zhuǎn)錄因子家族；研究顯示，RSM 1（AT4G39250）過(guò)量表達(dá)幼苗生長(zhǎng)頂端彎鉤缺失，下胚軸變短，早期光形態(tài)建成時(shí)對(duì)紅光過(guò)敏；推測(cè)RSM 1參與早期光形態(tài)建成調(diào)控［3］；RSM 1參與了光照誘導(dǎo)頂端分生組織的細(xì)胞分裂調(diào)控和形態(tài)建成。

上調(diào)水稻（Oryza sativa）OsRL3（RADIALIS-LIKE3）表達(dá)，加速葉片黑暗下衰老；osrl3突變體黑暗下葉片葉綠素滯留，光合能力增強(qiáng)，葉綠素降解相關(guān)基因表達(dá)水平低于野生型［4］。水稻OsRL3反向調(diào)控葉綠素代謝，但調(diào)控機(jī)理未知。

研究已明確，一定數(shù)量的葉綠素等色素分子與葉綠素結(jié)合蛋白24（CP24）結(jié)合，保持其穩(wěn)定性和活性；弱光下更多葉綠素與CP24結(jié)合，行使吸收光子功能，強(qiáng)光下更多胡蘿卜素與CP24結(jié)合，發(fā)揮光保護(hù)作用，黑暗下葉綠素和CP24積累迅速減少［5-11］。CP24響應(yīng)光照和黑暗直接參與葉綠素代謝，哪些基因參與CP24表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。

擬南芥RSM1參與其光形態(tài)建成和水稻OsRL3調(diào)控葉綠素代謝的結(jié)果，明確了RSM是光照和黑暗響應(yīng)基因；但轉(zhuǎn)錄因子RSM1如何響應(yīng)光照和黑暗變化有待研究確定。為了確定轉(zhuǎn)錄因子RSM1決定的表型及響應(yīng)光照和黑暗變化的路徑，本研究基于反向遺傳學(xué)思路，以功能未知的馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）基因StRSM1為研究對(duì)象，運(yùn)用基因轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株系表型測(cè)定和目的基因表達(dá)定性測(cè)定等方法，揭示了StRSM1通過(guò)調(diào)控CP24表達(dá)及葉綠素積累響應(yīng)光照和黑暗變化。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為實(shí)驗(yàn)室自行保存和維護(hù)的普通煙草（Nicotiana tabacumL.）K326和馬鈴薯品種紫花白組培苗，以其作為野生型對(duì)照和目的基因轉(zhuǎn)化受體；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、大腸桿菌重組菌BL-pC-35S均由本實(shí)驗(yàn)室保存，委托上海生工生物科技公司合成本研究所用引物，其系列如表1所示。

表1 引物序列

轉(zhuǎn)化株系及WT室內(nèi)培養(yǎng)條件為（24±2）℃，10 h光照，14 h黑暗，光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度60%-80%，土壤水含量70%±5%。采集移栽生長(zhǎng)第30天的幼葉置于液氮，用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 重組StRSM1構(gòu)建和體內(nèi)轉(zhuǎn)化 委托上海生工生物科技公司合成StRSM1基因全長(zhǎng)ORF cDNA，完成重組載體pC-StRSM1+和pC-StRSM1-構(gòu)建，構(gòu)建過(guò)程如圖1所示。電激轉(zhuǎn)化重組載體于根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，卡娜霉素和潮霉素抗性篩選和SRSMF/R引物PCR鑒定，獲得重組菌株GV-StRSM1+和GV-StRSM1-；分別按照已報(bào)道的外源基因馬鈴薯（Solanum tuberosum）和本氏煙草（Nicotiana benthamiana）體內(nèi)轉(zhuǎn)化方法［12］，重組菌侵染外植體、愈傷誘導(dǎo)、陽(yáng)性苗GUS染色選擇后，用特異引物SRSMF/SRSMR和葉片RNA建立RT-PCR反應(yīng)，確認(rèn)陽(yáng)性株系StRSM1表達(dá)，依此獲得本氏煙草和馬鈴薯體內(nèi)StRSM1過(guò)量和抑制表達(dá)株系，兩者轉(zhuǎn)化株系中，選取StRSM1過(guò)量和抑制表達(dá)株系各2株進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

用引物qRSMF/R建立PCR反應(yīng)體系，以L25為內(nèi)參基因，完成RSM1 mRNA積累的實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定，反應(yīng)條件為95℃ 5min預(yù)變性后，95℃ 15 s，62℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，熔解曲線65℃-95℃；3次樣品重復(fù)測(cè)定3次，用比較Ct值法計(jì)算StRSM1相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 目的株系生理表型測(cè)定 用日本KONICA MINOLTO公司生產(chǎn)的SPAD-502 Plus型葉綠素儀，測(cè)定普通煙草WT和其轉(zhuǎn)化株35 d幼苗全部葉片及馬鈴薯WT和其轉(zhuǎn)化株40 d幼苗全部葉片葉綠素含量，測(cè)定重復(fù)3次，每次測(cè)定重復(fù)3次，以SPAD作為葉綠素含量計(jì)量單位。

1.2.3StRSM1過(guò)量表達(dá)而變化的葉綠素代謝及結(jié)合蛋白的基因識(shí)別 室內(nèi)培養(yǎng)條件下，設(shè)定14 h光照（CL）和10 h黑暗（CD）作為對(duì)照光照，8 h光照（SL）和16 h黑暗（LD）作為短光照處理，在對(duì)照和處理光照下，培養(yǎng)StRSM1過(guò)量表達(dá)株系35 d幼苗5 d，幼苗苗齡40 d時(shí)，采集其葉片樣品3份，用上述同樣方法，提取和處理葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

基于StRSM1過(guò)量表達(dá)改變了葉綠素積累，檢索馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得參與葉綠素代謝和結(jié)合的基因cDNA序列，依據(jù)序列設(shè)計(jì)葉綠素代謝和結(jié)合的基因特異引物，用光照處理葉片RNA和合成的特異性引物，建立RT-PCR反應(yīng)。依據(jù)StRSM1過(guò)量表達(dá)株系光照處理樣品RT-PCR產(chǎn)物的變化，確定StRSM1過(guò)量表達(dá)變化的葉綠素代謝和葉綠素結(jié)合蛋白的基因。

其中，依據(jù)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)記載的CP24（ID：DMG400012591）DNA序列設(shè)計(jì)并合成其特異引物612F/R，以L25為內(nèi)參基因完成PCR，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min、94℃變性30 s、50℃退火35 s、72℃延伸1min的條件下循環(huán)25次后，72℃延伸10 min，4℃保存；反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖膠電泳觀察不同處理下CP24定性表達(dá)結(jié)果。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用Statistical Program for Social Sciences（SPSS）V19.0中t檢驗(yàn)完成所有測(cè)定數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 載體pC-StRSM 1+和pC-StRSM 1-構(gòu)建過(guò)程示意圖

1.2.5 序列檢索及分析 用茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)https：//solgenomics.net/和馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)https：//www.uniprot.org檢索相關(guān)序列、clustal Omega在線http：//www.clustal.org/軟件序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 StRSM 1及其茄科同源物具有茄科特異性

本實(shí)驗(yàn)室前期研究光照周期處理馬鈴薯，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序識(shí)別了StRSM1和StRSM1含有255 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼84個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)；預(yù)測(cè)氨基酸序列檢索馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，識(shí)別了4個(gè)與StRSM1一致性大于56%的氨基酸序列，比對(duì)結(jié)果如圖2-A所示，其中與StRSM1氨基酸序列最接近的DMP400001385（DMG400000709）一致性僅為65%；與StRSM1同源的擬南芥序列為蛋白質(zhì)RADIALIS-like 1（AT4G39250），兩者氨基酸序列比對(duì)如圖2-B所示，兩者一致性僅為69%。

番茄（Solanum lycopersicum）、野生煙草（Nicotianaattenuata）、普通煙草（Nicotiana tabacumL.）和甜椒（Capsicum annuum）等茄科植物的StRSM1同源物序列比對(duì)，如圖2-C所示，其一致性大于80%，且功能結(jié)構(gòu)域高度保守。

圖2 StRSM 1與不同同源物氨基酸序列比對(duì)

檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與StRSM1同源的擬南芥序列一致性較低，而其茄科同源序列高度保守，表明StRSM1及其茄科同源基因具有茄科特異性，StRSM1是馬鈴薯基因組中的單拷貝基因，其功能有待確定。

2.2 StRSM 1表達(dá)反向調(diào)控葉綠素積累

以pC-35S和StRSM1 cDNA構(gòu)建其過(guò)量和抑制表達(dá)載體pC-StRSM1+和pC-StRSM1-，載體酶切分析和測(cè)序證實(shí)后，分別轉(zhuǎn)化普通煙草和馬鈴薯基因組，依據(jù)報(bào)告基因GUS染色和RSM1表達(dá)定量結(jié)果進(jìn)行選擇，獲得了RSM1過(guò)量表達(dá)普通煙草陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株系ntrsm+1和ntrsm+2、抑制表達(dá)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株系ntrsm-1和ntrsm-2，馬鈴薯過(guò)量和抑制表達(dá)StRSM1株系strsm+1和strsm+2及strsm-1和strsm-2。

RSM1表達(dá)RT-qPCR相對(duì)定量結(jié)果如圖3-A和3-B所示，過(guò)量表達(dá)株系ntrsm+1和ntrsm+2及strsm+1和strsm+2 中RSMmRNA積累倍數(shù)極顯著高于WT（P≤0.01），表明RSM+cDNA體內(nèi)表達(dá)促進(jìn)了NtRSM1和StRSM1同源mRNA表達(dá)；抑制表達(dá)陽(yáng)性株系ntrsm-1和ntrsm-2及strsm-1和strsm-2葉片RSMmRNA積累倍數(shù)極顯著低于WT（P≤0.01），表明RSM-cDNA體內(nèi)表達(dá)抑制了NtRSM1和StRSM1同源mRNA表達(dá)。

普通煙草和馬鈴薯葉片過(guò)量和抑制表達(dá)StRSM1，改變了兩者葉片顏色，如圖3-C所示，與WT相比，過(guò)量StRSM1表達(dá)馬鈴薯陽(yáng)性株系葉色較淺，但抑制StRSM1表達(dá)馬鈴薯陽(yáng)性株系葉片綠色明顯加深。

葉綠素含量（SPAD）測(cè)定結(jié)果如圖3-D和3-E所示，普通煙草和馬鈴薯StRSM1抑制表達(dá)陽(yáng)性株系ntrsm-1和ntrsm-2及strsm-1和strsm-2葉片葉綠素含量極顯著高于對(duì)照（P≤0.01），ntrsm+1和ntrsm+2及strsm+1和strsm+2株系葉片葉綠素含量極顯著低于對(duì)照（P≤0.01）；結(jié)果表明，StRSM1過(guò)量表達(dá)減少了葉綠素積累；抑制StRSM1表達(dá)，葉綠素積累則會(huì)增加；抑制StRSM1表達(dá)的結(jié)果，與已報(bào)道的RSM3突變體倒置使黑暗誘導(dǎo)的葉綠素減少的研究結(jié)果一致。

2.3 隨StRSM表達(dá)變化而改變的葉綠素代謝和葉綠素結(jié)合蛋白基因

檢索數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別了72個(gè)葉綠素代謝和葉綠素結(jié)合蛋白（CMB）編碼基因，用這些基因各自特異引物進(jìn)行RT-PCR，依此作為CMB基因表達(dá)定性結(jié)果，比較對(duì)照和光照處理?xiàng)l件下StRSM1過(guò)量表達(dá)株系中CMB基因隨黑暗和光照的表達(dá)變化，確定隨StRSM1過(guò)量表達(dá)而改變表達(dá)的CMB基因。

RT-PCR結(jié)果顯示，72個(gè)CMB基因中，葉綠素合成酶、葉綠素b還原酶、葉綠素酶、原葉綠素氧化還原酶等編碼基因表達(dá)在處理和對(duì)照間無(wú)可見(jiàn)穩(wěn)定變化，其中葉綠素結(jié)合蛋白CP24基因在光照處理和對(duì)照間表現(xiàn)穩(wěn)定變化。

如圖4所示，在馬鈴薯和普通煙草的野生型（WT）中，RT-PCR僅檢測(cè)到CP24在對(duì)照光照（CL）條件下表達(dá)，對(duì)照黑暗（CD）未檢出可見(jiàn)產(chǎn)物；StRSM1過(guò)量表達(dá)馬鈴薯和普通煙草株系中，CL和CD條件下均獲得明顯可見(jiàn)的RT-PCR產(chǎn)物；StRSM1過(guò)量表達(dá)株系在LD和SL條件下，CP24呈現(xiàn)與CL和CD條件下相同的表達(dá)模式。結(jié)果表明，StRSM1過(guò)量表達(dá)改變了CP24的表達(dá)模式，即增加了黑暗條件下CP24的表達(dá)量。

圖4 隨RSM 1過(guò)量表達(dá)的CP24基因RT-PCR產(chǎn)物

3 討論

早期許多研究報(bào)道了光照對(duì)葉綠素積累的影響［13-14］，其后的研究就此得到的基本結(jié)論認(rèn)為，強(qiáng)光條件下，葉綠體中類(lèi)胡蘿卜素組分積累增加，發(fā)揮光保護(hù)作用；弱光條件下，葉綠素積累相對(duì)增加；黑暗下，葉綠素和葉綠素結(jié)合蛋白積累迅速減少［5-6］。不同植物色素吸收光譜不同，光照強(qiáng)弱變化改變了LHC中的色素組成。

葉綠體和類(lèi)胡蘿卜素合成均來(lái)自類(lèi)異戊二烯（MEP）途徑，兩者有共同的合成底物［15-16］；弱光條件下，葉綠素積累增加［5-6］；盡管需更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，但依此有理由推測(cè)，高光照誘導(dǎo)類(lèi)胡蘿卜素等光保護(hù)色素積累增加，其合成消耗了更多合成底物，葉綠素合成相對(duì)減少；弱光下，光保護(hù)色素合成減少，更多合成底物用于葉綠素合成，葉綠素相對(duì)增加。RSM1表達(dá)減少增加葉綠素積累的結(jié)果與弱光條件下葉綠素積累增加一致，RSM1表達(dá)減少促進(jìn)葉綠素積累的結(jié)果也表明，RSM1反向調(diào)控葉綠素積累。該結(jié)果與已報(bào)道的水稻RSM3突變體倒置使黑暗誘導(dǎo)葉綠素減少的結(jié)果一致。

葉綠素結(jié)合蛋白CP具有聚集和結(jié)合色素及傳遞電子等功能，色素聚集并結(jié)合于CP［9］，維持色素活性和可測(cè)狀態(tài)，黑暗下葉綠素和CP24積累迅速減少［11-14］，這些結(jié)果同時(shí)也表明，除了不同色素合成平衡響應(yīng)光照外，CP在響應(yīng)光照變化中發(fā)揮更重要作用。本研究黑暗（CD）下未檢測(cè)到WT中CP24存在，證實(shí)了黑暗下CP24積累迅速減少；StRSM1過(guò)量表達(dá)株系中CD和LD下CP24存在的原因是StRSM1過(guò)量表達(dá)，結(jié)果明確了StRSM1參與CP24積累。

天線蛋白聚集色素形成光子吸收和電子傳遞復(fù)合體，光照調(diào)控色素與其結(jié)合蛋白積累變化，維持復(fù)合體光保護(hù)和光合的動(dòng)態(tài)；天線蛋白結(jié)構(gòu)及功能的研究已較多，但其如何受到上游基因表達(dá)調(diào)控還不是很清楚。

本研究初步揭示了StRSM1隨光照調(diào)控CP24表達(dá)，繼而改變?nèi)~綠素積累；該結(jié)果建立了光照、RSM1轉(zhuǎn)錄因子、CP24和葉綠素積累間的聯(lián)系，結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步明確RSM1如何響應(yīng)光照和深刻理解RSM1參與的光照響應(yīng)具有作用。

StRSM1及其茄科同源基因均含有高度保守的單個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，StRSM1在馬鈴薯基因組中是單拷貝，其與擬南芥同源基因相似性較低，這表明了其差異進(jìn)化的特征；單個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域重復(fù)形成了其它MYB轉(zhuǎn)錄因子的事實(shí)，表明了StRSM1是更早出現(xiàn)在基因組中的基因，StRSM1功能的初步確定有助于揭示光合作用這一古老生理現(xiàn)象。

研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)RSM1，增加了馬鈴薯和普通煙草體內(nèi)光照和黑暗下CP24 mRNA的積累，尤其是黑暗下CP24積累增加明顯可見(jiàn)；普通煙草轉(zhuǎn)化株系中，短光照（SL）和對(duì)照光照（CL）下未出現(xiàn)CP24 mRNA積累的可見(jiàn)差異，但長(zhǎng)黑暗（LD）下，CP24 mRNA積累明顯更多，其原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，茄科植物特異單MYB轉(zhuǎn)錄因子StRSM1光照響應(yīng)，反向調(diào)控葉綠素積累，葉綠素結(jié)合蛋白CP24參與了StRSM1對(duì)葉綠素積累的調(diào)控。