郭麗麗 李昱瑩 郭大龍 侯小改

（河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/牡丹學(xué)院，洛陽 471023）

遺傳圖譜（Genetic map）或連鎖圖譜（Linkage map）或遺傳連鎖圖譜（Genetic linkage map），是以遺傳標(biāo)記間重組頻率為基礎(chǔ)的染色體或基因組內(nèi)位點(diǎn)相對位置的線性排列圖［1］?；ɑ苤参镞z傳連鎖圖譜構(gòu)建是開展分子標(biāo)記輔助育種的重要工具，可將遺傳圖譜上的分子標(biāo)記作為框架，標(biāo)記和定位植物體內(nèi)質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀基因座［2］。高密度遺傳圖譜是輔助基因組測序序列組裝的重要工具［3］，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)較為精細(xì)的比較基因組分析［4］。通過整合遺傳圖譜內(nèi)種質(zhì)的基因分型，可以解析基因組連鎖不平衡規(guī)律，為開展全基因組關(guān)聯(lián)分析［5］提供研究基礎(chǔ)。高密度遺傳圖譜還可通過整合物理圖譜和遺傳圖譜，加速主效關(guān)鍵基因和目標(biāo)性狀QTL圖位克隆進(jìn)程，從而有效提高育種效率和改良品種［6］。

分子標(biāo)記是以核苷酸序列變異為基礎(chǔ)，直接反應(yīng)DNA水平遺傳多態(tài)性的遺傳標(biāo)記。計算分子標(biāo)記間的重組率，基于重組率構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，特別是高密度遺傳圖譜，是進(jìn)行遺傳分析和QTL定位的重要手段，是促進(jìn)種質(zhì)資源性狀改良的有效途徑［7］。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，變異類型和變異頻率豐富［8］。高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和成本的不斷降低，使SNP標(biāo)記在高密度遺傳圖譜構(gòu)建研究中的應(yīng)用越來越廣泛［9］。

遺傳圖譜作為分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的重要工具，對重要花卉植物的新品種選育具有重要的指導(dǎo)意義。目前重要花卉植物如牡丹、梅花、月季、菊花、蘭花、荷花、桂花等高遺傳圖譜的構(gòu)建研究已有報道，但圖譜精密度尚無法滿足精細(xì)定位研究的要求。百合、紫薇、郁金香、向日葵等花卉植物高密度遺傳圖譜構(gòu)建研究還相對較少，制約了花卉植物分子標(biāo)記輔助育種研究的進(jìn)程。因此，本文概述了高密度遺傳圖譜構(gòu)建流程及作圖方法（圖1），綜述了重要傳統(tǒng)木本花卉和草本花卉植物遺傳圖譜構(gòu)建研究進(jìn)展，討論了重要花卉植物高密度遺傳圖譜構(gòu)建存在的主要問題，對今后重要花卉植物遺傳圖譜構(gòu)建研究的發(fā)展方向及其在育種中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，以期為花卉植物目標(biāo)性狀QTL定位、輔助基因組組裝、比較基因組學(xué)、圖位克隆、分子標(biāo)記輔助育種等研究提供參考。

1 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

遺傳圖譜構(gòu)建首先需要構(gòu)建一個親本差異顯著的分離群體，通過對分離群體進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選、個體掃描和連鎖分析，使用作圖軟件確定連鎖群中標(biāo)記的相對順序和遺傳距離，利用群體內(nèi)染色體交換重組，構(gòu)建完整的遺傳圖譜［1］。作圖群體是影響遺傳圖譜構(gòu)建質(zhì)量的重要因素，作圖群體的親本選擇、群體類型、群體大小、分子標(biāo)記種類及遺傳距離估計均影響遺傳圖譜的構(gòu)建效果［10］。

圖1 高密度遺傳圖譜構(gòu)建策略

1.1 親本選配

構(gòu)建遺傳圖譜的作圖群體時，雜交組合親本間的遺傳差異應(yīng)盡量大，方可獲得足夠的DNA序列差異。親本間遺傳差異過大，則使雜種染色體間的配對及重組受到抑制［11］，導(dǎo)致連鎖座位間重組率偏低，引起偏分離現(xiàn)象，降低遺傳圖譜的可靠性和適用范圍，還會造成雜種后代結(jié)實(shí)率下降，甚至不育，影響分離群體的構(gòu)建［12］。雙親間遺傳差異過小，則親本間多態(tài)性水平較低，導(dǎo)致獲得相對飽和連鎖圖的難度增加［13］。因此，選擇親本時應(yīng)兼顧親本差異性和后代可育性，同時盡量選擇純度高的材料并通過自交進(jìn)行純化［14］。

1.2 群體類型

遺傳圖譜構(gòu)建采用的作圖群體主要有F1群體、F2群體、重組自交系群體（Recombinant inbred lines，RIL）［15］、回 交 群 體（Backcross，BC）［16］、加倍單倍體群體（Doubled haploid，DH）［17］、近等基因系群體（Near-isogenic lines，NILs）［18］、殘留異質(zhì) 系 群 體（Residual heterozygous lines，RHLs）［19］、導(dǎo)入系群體（Introgressive lines，ILs）［20］等。木本植物世代周期長，雜交結(jié)實(shí)率低，獲得具有顯著孟德爾遺傳特征的高世代群體較難；多數(shù)木本植物自交不親和及組培體系不完善，導(dǎo)致F2、BC、DH、RIL等群體不適于其遺傳圖譜構(gòu)建；木本植物遺傳背景復(fù)雜，雜合度高，基因組大，重復(fù)序列多，均制約其遺傳圖譜構(gòu)建研究的深入開展［21］。F1群體是木本植物遺傳圖譜構(gòu)建采用較為廣泛的作圖群體［22］。F2群體在楊樹、桉樹等速生林木遺傳圖譜構(gòu)建上的應(yīng)用較多［13］。半同胞家系（Half-sib family）群體的構(gòu)建無需人工雜交，花粉來源清楚的半同胞家系可用于林木遺傳圖譜的構(gòu)建［23］。母本減數(shù)分裂形成的大配子體（Macrogametophytes）其分離和重組交換不受近交和自由授粉家系的影響，可用于針葉樹種的遺傳圖譜構(gòu)建研究［24］。

1.3 群體大小

作圖群體的大小是遺傳圖譜分辨率和精度的決定因素。群體越小，圖譜精度越低，檢測到的重組圖距偏大，導(dǎo)致QTL定位時檢測不到重組事件，引起標(biāo)記偏分離現(xiàn)象的產(chǎn)生，造成圖譜誤差較大。群體越大，檢測到的重組圖距越小，有利于緊密連鎖位點(diǎn)的區(qū)分。群體太大，則增加實(shí)驗(yàn)費(fèi)用及工作量。開展遺傳圖譜構(gòu)建研究時，應(yīng)根據(jù)群體類型、作圖目標(biāo)、親本間雜合度及標(biāo)記分離情況等確定群體大小。以基因組序列分析和基因克隆為目的的遺傳圖譜構(gòu)建，需要較大的作圖群體；QTL定位分析時宜選擇包含150個單株的隨機(jī)小群體構(gòu)建骨架連鎖圖譜，對性狀進(jìn)行精細(xì)定位時可通過增大群體數(shù)，對目標(biāo)連鎖群進(jìn)行加密［25］。近年來，通過增大作圖群體提高遺傳圖譜精密度的研究日益增多。

1.4 簡化基因組測序在高密度遺傳圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用

基于高通量測序技術(shù)的SNP標(biāo)記開發(fā)，可短時間、低成本、高通量完成基因組DNA分型，有助于快速準(zhǔn)確的找到變異位點(diǎn)，估算等位基因頻率［26］。全基因組測序（Genome sequencing）、簡化基因組測 序（Reduced-representation genome sequencing，RRGS）和轉(zhuǎn)錄組測序（Transcriptome sequencing）是開發(fā)SNP標(biāo)記的主要高通量測序技術(shù)。隨著越來越多植物全基因組測序的完成，使基于全基因組測序的重測序技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜應(yīng)用越來越廣泛。而大部分多年生木本植物基因組龐大且復(fù)雜，全基因組測序成本太高，使重測序技術(shù)在其遺傳圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用受到限制，重測序技術(shù)較為適用于規(guī)模較小的自然群體、骨干親本和極端混池測序（Bulked segregant analysis，BSA）［27］。

RRGS技術(shù)不受參考基因組限制，利用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行酶切，僅富集具有限制性酶切位點(diǎn)的基因組片段，極大的降低了基因組復(fù)雜度和測序數(shù)據(jù)量，且采集盡可能覆蓋全基因組的遺傳變異信息，解決了高成本重測序技術(shù)的局限性［28］。RRGS技術(shù)主要有（1）簡化文庫（Reduced representation libraries，RRLs）［29］和簡化多態(tài)序列復(fù)雜性（Complexity reduction of polymorphic sequences，CroPS）［30］；（2）限制性酶切位點(diǎn)關(guān)聯(lián)DNA測序（Restriction-site-associated DNA sequencing，RADseq）：RAD（Restriction-site associated DNA）［31］、ddRAD［32］、2b-RAD［33］、SLAF-Seq（Specific-locus amplified fragment sequencing）［34］；（3）低 覆 蓋 基因分型文庫：多元鳥槍法基因分型（Multiplexed shotgun genotyping，MSG）［35］和基于測序的基因分型（Genotyping by sequencing，GBS）［36］。CroPS適用于基因組含有大量重復(fù)序列且DNA多態(tài)性較低的物種，GBS和RAD-seq適用于大樣本和復(fù)雜基因組物種［37］。

1.5 遺傳圖譜構(gòu)建軟件

構(gòu)建遺傳圖譜時需要將分子標(biāo)記劃分成若干連鎖群，每個連鎖群中的標(biāo)記排序后確定標(biāo)記位點(diǎn)在遺傳連鎖群上的位置，標(biāo)記間的位置以遺傳距離表示［38］。常用的作圖軟件主要有Mapmaker［39］、JoinMap［40］、FsLinkageMap［41］等。但是，由于同一作圖軟件并不能包含所有的分離類型，不同軟件構(gòu)建的遺傳圖譜也存在差異，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適合的軟件。

2 木本花卉植物高密度遺傳圖譜構(gòu)建

2.1 牡丹

以牡丹“鳳丹白”M24ד紅喬”雜交，構(gòu)建包含195個子代的F1群體為作圖群體，采用SLAFseq簡化基因組測序技術(shù)，構(gòu)建了首張牡丹高密度遺傳連鎖圖譜，該圖譜含5個連鎖群，1189個SNP標(biāo)記和72個SSR標(biāo)記，遺傳圖距1061.94 cM，標(biāo)記間平均遺傳圖距0.84 cM，最大連鎖群306.85 cM，最小連鎖群96.32 cM［42］。以“鳳丹”ד新日月錦”F1群體為作圖群體（120個子代），采用GBS技術(shù)構(gòu)建了包含3868個SNP標(biāo)記和35個SSR標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，總遺傳圖距13175.5 cM，覆蓋5個連鎖群，連鎖群平均長度2635.1 cM，標(biāo)記數(shù)變化范圍322-1224，平均標(biāo)記位點(diǎn)773.6個，標(biāo)記間平均距離3.406 cM，基因組覆蓋范圍1428.378 cM-3786.571 cM［2］。以“青龍禾墨池”ד墨子蓮”雜交獲得F1分離群體為材料，采用RAD-seq技術(shù)構(gòu)建牡丹高密度遺傳圖譜，該圖譜分別覆蓋父母本965.69 cM和870.21 cM，標(biāo)記間平均間隔分別0.66 cM和1.10 cM［43］。

2.2 月季

通過‘Red New Dawn’（RND）בMorden Centennial’（MC）雜交，構(gòu)建了包含177個子代的F1作圖群體，構(gòu)建了月季高密度遺傳圖譜，該圖譜含有1929個SNP標(biāo)記，覆蓋25個連鎖群，遺傳圖距765.5 cM，平均標(biāo)記距離0.9 cM［44］。采用GBS技術(shù)構(gòu)建月季F1分離群體J06-20-14-3בLittle Chief’（J14-3×LC），J06-20-14-3בVineyard Song‘（J14-3×VS）和‘Old Blush’בRed Fairy’（OB×RF）的整合高密度遺傳圖譜，該圖譜包含3527個SNP標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離0.25 cM，遺傳圖距892.2 cM，覆蓋7個連鎖群，連鎖群大小95-167 cM，最大連鎖群LG7（167 cM），標(biāo)記密度最高（6標(biāo)記/cM）且平均距離最?。? cM/bin標(biāo)記）的連鎖群為LG2，遺傳缺口最大的連鎖群為LG5（11.2 cM）。整合圖譜長度比單個圖譜增加近390 cM，圖譜密度和標(biāo)記間平均距離有所改善，標(biāo)記密度和標(biāo)記順序可靠性得到提高［45］。使用RAD-seq技術(shù)構(gòu)建了Rosa chinensis‘Old Blush’和R. wichuraiana‘Basyes Thornless’回交群體BC1F1（152個子代）的高密度連鎖圖譜，該圖譜包含2213個標(biāo)記，分布在7個連鎖群上，遺傳圖譜總長度為1027.425 cM，標(biāo)記間平均距離0.96 cM，將1.21/23.14 Mb（12.18/44.52%）未組裝‘Old Blush’的scaffolds錨定到7條pseudochromosomes上［46］。

2.3 梅花

采用RAD-seq簡化基因組測序技術(shù)，在含190個子代的梅花“粉瓣”ד扣子玉蝶”F1群體中，檢測到1484個SNP標(biāo)記，構(gòu)建了包含8個連鎖群的梅花高密度遺傳圖譜，總遺傳圖距780.9 cM，標(biāo)記間平均距離為0.5 cM，錨定513條梅花基因組組裝序列，覆蓋基因組84%［47］。該遺傳圖譜輔助梅花全基因組組裝，提高了梅花基因組組裝質(zhì)量［3］。利用梅花品種“六瓣”ד粉臺垂枝”含387個子代的F1作圖群體，采用SLAF-seq技術(shù)構(gòu)建了梅花高密度遺傳圖譜，圖譜包含8個連鎖群，8007個遺傳標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離0.195 cM，遺傳總圖距為1550.62 cM，SNP標(biāo)記在F1群體中的平均完整度為96%，垂枝性狀定位在7號染色體10.54 Mb-11.68 Mb之間，10個SNP分子標(biāo)記與梅花垂枝性狀緊密連鎖［48］。

2.4 桂花

采用桂花‘Wan Yin Gui’（Albus Group）為父本，‘Huang Chuan Jin Gui’（Luteus Group）為母本，構(gòu)建了包含129個子代的F1作圖群體，使用SLAFseq技術(shù)構(gòu)建了桂花高密度遺傳圖譜，該圖譜包含14189個高質(zhì)量SLAF標(biāo)記，分布在23個遺傳連鎖群上，總長度2962.46 cM，相鄰標(biāo)記間平均距離0.21 cM［49］。

3 草本花卉植物高密度遺傳圖譜構(gòu)建

3.1 蓮花

“中國古代蓮”×美洲黃蓮‘AL1’雜交構(gòu)建F1作圖群體（51個子代）［50］，基于RAD-seq技術(shù)構(gòu)建了蓮高密度遺傳連鎖圖譜，使用美洲黃蓮‘AL1’遺傳圖譜錨定“中國古代蓮”基因組圖譜框架序列，3603個SNP標(biāo)記將234個individual scaffold sequence錨定在9個megascaffolds，覆蓋基因組67%［51］。以較大的“中國古代蓮”×美洲黃蓮‘AL1’F1群體（80個后代）為材料［52］，以“中國古代蓮”基因組為參考序列［53］，利用RAD-seq技術(shù)構(gòu)建美洲黃蓮‘AL1’的高密度遺傳圖譜，該圖譜由1515個SNP標(biāo)記組成，分布在10個連鎖群上，基因組覆蓋長度563.6 cM，平均圖距0.38 cM。通過‘Man tian xing’בJu wu ba’F1群體自交，獲得F2作圖群體（96個子代），采用ddRAD-seq技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜，圖譜包含8971 SNP標(biāo)記，覆蓋8個連鎖群，遺傳圖距581.3 cM，平均標(biāo)記間隔為0.74 cM，錨定基因組框架序列809個，wild sacred蓮花基因組覆蓋度70.6%［54］。采用‘Chinese Tai-zi’ בThailand Chiang Mai’ F2作圖群體（181個子代），基于RADseq技術(shù)構(gòu)建N. nucifera高密度遺傳圖譜，輔助‘Chinese Tai-zi’基因組組裝，使基因組scaffold N50從0.989 Mb 增加至1.48 Mb，提高了基因組組裝質(zhì)量［55］。中國蓮“金秋”（多瓣）ד白花建蓮”（少瓣）構(gòu)建F2 作圖群體（121個子代），采用全基因組重測序技術(shù)構(gòu)建了中國蓮高密度遺傳圖譜，圖譜由8個連鎖群組成，包含1939個區(qū)間標(biāo)記和79596個SNPs標(biāo)記，標(biāo)記平均圖距為0.49 cM，遺傳圖距總長度為772.92 cM，連鎖群平均長度為96.61 cM［56］。

3.2 菊花

采 用 菊 花DB36451×DB39287（P2） 雜交F1群體（406個子代）構(gòu)建六倍體菊花（Chrysanthemum×morifolium，2n=6x=54） 的高密度遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含30312個SNP標(biāo) 記，覆 蓋9個 連 鎖 群［57］。通 過Chrysanthemum×Morifolium‘Candy’（雙 花/扁 平花）和Chrysanthemum×Morifolium‘225’（單花/管狀花）雜交，獲得包含305個個體的F1作圖群體，使用SLAF-seq技術(shù)構(gòu)建菊花高密度遺傳連鎖圖譜，圖譜包含6452個標(biāo)記，總遺傳圖距4301.5 cM，平均距離為0.76 cM；LG平均長度159.315 cM，包含270個標(biāo)記，跨度為120.84 cM；最長連鎖群LG9包括299個標(biāo)記，遺傳圖譜距離263.37 cM，平均標(biāo)記間距離0.88 cM；最短連鎖群LG18含147個標(biāo)記，遺傳圖譜距離84.66 cM，平均標(biāo)記間距離0.58 cM；LG2遺傳缺口最大（18.92 cM），LG20中遺傳缺口最?。?.23 cM）［58］。

3.3 蘭花

通過蘭花‘Dendrobium nobile’בDendrobium wardianum’雜交構(gòu)建包含100個子代的F1作圖群體，采用RNA-seq技術(shù)鑒定到9645個有效多態(tài)性SNP標(biāo)記，構(gòu)建了蘭花高密度整合遺傳圖譜，圖譜覆蓋19個連鎖群，總遺傳圖距為3612.12 cM，平均標(biāo) 記間隔為0.41 cM［59］。利用‘Dendrobium moniliforme’בD. officinale’雜交，獲得含111個后代的F1作圖群體［60］，采用SLAF-seq技術(shù)構(gòu)建了蘭花高密度遺傳連鎖圖譜，圖譜包含8573個SNP標(biāo)記，分布在19個連鎖群上，總遺傳圖距為2737.49 cM，標(biāo)記間平均遺傳距離為0.32 cM［61］。

3.4 矮牽牛

通過單瓣矮牽牛×重瓣矮牽牛雜交獲得F1群體，從F1群體中隨機(jī)選取一株重瓣后代為父本，選擇一株單瓣后代為母本，雜交獲得F2群體，從F2群體中選取50株單瓣和51株重瓣植株，以此作為作圖群體，采用全基因組重測序技術(shù)，構(gòu)建了矮牽牛高密度遺傳連鎖圖譜。使用Join Map4.1構(gòu)建的遺傳圖譜包含4474個標(biāo)記，總遺傳距離2022.786 cM，平均遺傳距離0.758 cM；使用Lepmap構(gòu)建的遺傳圖譜包含8030個標(biāo)記，總遺傳距離453.39 cM，平均遺傳距離1.00 cM，重瓣性狀定位在LG5［62］。

3.5 康乃馨

以康乃馨‘85-11’בPretty Favvare’雜交F2作圖群體為材料，采用ddRAD-seq技術(shù)構(gòu)建了康乃馨高密度遺傳圖譜，該圖譜包含285個SSR和2119個SNP標(biāo)記，覆蓋15個連鎖群，遺傳圖距為971.5 cM，標(biāo)記間平均距離為0.4 cM［63］。

4 總結(jié)與展望

全基因組測序、簡化基因組測序、RNA-Seq等高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，為分子標(biāo)記開發(fā)提供了成本更低更高效的手段。梅花［3］、菊花［64］、蓮花［53，65-67］、牡丹［68］、桂花［69］、康乃馨［70］、蘭花［71-73］、矮牽牛［74］等基因組的發(fā)布，有利于基于全基因組重測序的高密度遺傳圖譜構(gòu)建研究的深入開展，有利于推動花卉植物生物學(xué)和分子育種研究的進(jìn)程。然 而，目 前 牡 丹［2，42-43］、月 季［44-46］、梅 花［47-48］、桂花［49］、蓮花［51，54-56］、菊花［57-58］等重要觀賞植物所構(gòu)建的遺傳圖譜，其精密度尚無法滿足精細(xì)定位及圖位克隆研究的需求，百合、紫薇、郁金香、向日葵等重要觀賞植物高密度遺傳圖譜構(gòu)建尚見未開展，制約了觀賞植物分子育種研究進(jìn)程。今后應(yīng)加大基于大群體、多群體、高世代群體及野生資源為親本群體的高密度遺傳圖譜構(gòu)建研究，提升現(xiàn)有遺傳圖譜的精密度，使其應(yīng)用于精細(xì)定位和圖位克隆等研究。種質(zhì)資源的商業(yè)化開發(fā)與應(yīng)用，導(dǎo)致其遺傳變異特性的局限性，探索原始野生種的基因遺傳變異對促進(jìn)遺傳改良具有重要意義。