劉成琴，趙興旺，康志鈺，丁家娟，孫映雪，王建軍

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

通關(guān)藤[Marsdenia tenacissima(Roxb.) Wight et Arn.]為蘿藦科牛奶菜屬藤本植物，分布于云南、廣西和貴州等省區(qū)，是西南地區(qū)常用的民族藥之一[1-2]。其味苦，性微甘，具有消炎止痛、清熱解毒、止咳平喘等作用。臨床廣泛應(yīng)用于治療各種惡性腫瘤，療效良好，是臨床必用的抗腫瘤藥物之一[3]。云南省紅河州是通關(guān)藤的地道產(chǎn)區(qū)，近幾年通關(guān)藤的貯藏量急劇下降，很多地方的通關(guān)藤遭到了嚴(yán)重砍伐，有些甚至是連根挖走，極不利于通關(guān)藤的自然更新[4]。

蘿摩科植物的花粉以花粉塊的形式存在，這是該科植物的典型特征，通關(guān)藤尤為典型。蘿摩科植物的坐果率一般較低，平均0.33%～5.00%[5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)通關(guān)藤的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理活性、種子萌發(fā)、資源調(diào)查和真?zhèn)舞b定等方面，而對(duì)其花粉活力測(cè)定方法鮮見(jiàn)報(bào)道。目前，規(guī)范化栽培和野生撫育種植的種苗均以種子為繁殖材料[6]。但由于通關(guān)藤坐果率普遍較低，使通關(guān)藤花多果少，產(chǎn)生的種子數(shù)量也少，成為利用種子進(jìn)行擴(kuò)大繁殖的限制因素之一。本研究采用不同方法測(cè)定通關(guān)藤花粉活力，并通過(guò)對(duì)比分析，篩選出通關(guān)藤花粉活力測(cè)定的最佳方法。對(duì)提高通關(guān)藤坐果率具有重要意義，也為通關(guān)藤的快速繁殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料的采集與處理

試驗(yàn)材料于2019 年5—6 月采自云南省紅河州蒙自市水田鄉(xiāng)通關(guān)藤種植示范基地，選取處于初花期、盛花期和末花期的花，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用解剖針將花粉塊取下，分別利用TTC 染色法、醋酸洋紅染色法、I2-KI 染色法、過(guò)氧化物酶染色法以及花粉離體萌發(fā)法5 種方法進(jìn)行花粉活力測(cè)定。

1.2 花粉活力測(cè)定方法

(1) TTC 染色法

取3 朵花的花粉置于普通載玻片上，滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的TTC 溶液2 滴，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，于25～28 ℃放置15～20 min。在顯微鏡下觀察不同的5 個(gè)視野，凡被染成紅色的均為有生活力的花粉粒[7]。

(2) I2-KI 染色法

取3 朵花的花粉于干凈的普通載玻片上，加水1 滴，使花粉散開(kāi)，再加1 滴碘—碘化鉀溶液，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。取5 個(gè)視野進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)，凡被染成藍(lán)色的均為有生活力的花粉粒[7]。

(3)醋酸洋紅染色法

取3 朵花的花粉放在載玻片上，并滴入1～2 滴醋酸洋紅溶液，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，片刻后在顯微鏡下觀察5 個(gè)不同的視野，有活力的花粉被染成紅色[8]。

(4)過(guò)氧化物酶沉淀法

先配制試劑Ⅰ：0.5%聯(lián)苯胺、0.5% α-萘酚、0.25%碳酸鈉各10 mL 混合均勻。在干凈載玻片上放3 朵花的花粉，然后加試劑Ⅰ和0.3% 過(guò)氧化氫各1 滴，攪勻后蓋上蓋玻片，將制片放置30 ℃恒溫箱中10 min，置于顯微鏡下觀察，取5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)并記錄被染為紅色的花粉數(shù)量[9]。

(5)花粉離體萌發(fā)法

先配置A、B 2 種培養(yǎng)基[10]，用解剖針將3 朵花的花粉塊取下放在凹面載玻片上，分別滴入2～3 滴B 培養(yǎng)基，將載玻片放入裝有濕濾紙的培養(yǎng)皿中再蓋上一較大的培養(yǎng)皿，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，取出，滴入20%的KOH 溶液使花粉塊壁溶解，然后壓片并在顯微鏡下選5 個(gè)不同視野觀察并計(jì)數(shù)。

以上5 種方法均在10 倍顯微鏡下觀察，每種方法3 次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 和Excel 2010 處理，顯著性方差分析利用LSD 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同測(cè)定方法下花粉活力比較

從5 種通關(guān)藤花粉活力測(cè)定結(jié)果來(lái)看(圖1)：花粉活力由高到低依次為I2-KI 染色法＞醋酸洋紅染色法＞TTC 染色法＞過(guò)氧化物酶染色法＞花粉離體萌發(fā)法。其中花粉離體萌發(fā)法測(cè)得的花粉活力最低，只有0.02%。醋酸洋紅染色法、TTC 染色法和過(guò)氧化物酶染色法也比較低，分別為52.10%、51.44% 和39.02%，且三者之間差異不顯著。I2-KI 染色法測(cè)得的花粉活力最高，達(dá)到了90.85%。因此最適合的通關(guān)藤花粉活力測(cè)定方法為I2-KI 染色法。

圖1 不同測(cè)定方法下通關(guān)藤花粉活力比較Fig.1 Comparison of pollen viability of M.tenacissima under different determination methods

2.2 不同花期花粉活力比較

由于測(cè)定花粉活力最好的方法為I2-KI 染色法，所以用該方法測(cè)定了通關(guān)藤初花期、盛花期和末花期的花粉活力。從各個(gè)時(shí)期花粉活力比較來(lái)看(圖2)，花粉活力最高的為初花期達(dá)到90.85%，盛花期次之為79.40%，最低的是末花期花粉活力為69.16%。初花期和末花期差異顯著，初花期和盛花期差異不顯著，盛花期和末花期差異不顯著。

圖2 不同花期通關(guān)藤花粉活力比較Fig.2 Comparison of pollen viability in different M.tenacissima flower periods

3 討論

花粉活力直接關(guān)系到雜交授粉的成功率?；ǚ刍盍z測(cè)方法主要有花粉離體培養(yǎng)法和染色法[11]?；ǚ垭x體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力時(shí)易受溫度、pH 值、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和礦質(zhì)元素等的影響[12]。染色法對(duì)花粉活力測(cè)定具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，但不同植物花粉適宜的染色方法不同[13]。因此篩選適合測(cè)定某種植物花粉活力的染色法在雜交育種上具有非常重大的意義。

本研究采用的TTC 染色法、醋酸洋紅染色法、I2-KI 染色法、過(guò)氧化物酶染色法和花粉離體萌發(fā)法5 種測(cè)定通關(guān)藤花粉活力的方法中，TTC染色法、醋酸洋紅染色法和過(guò)氧化物酶染色法測(cè)出的花粉活力都相對(duì)較低，顏色較淺，染色效果不佳。可能是由于花粉塊的膜沒(méi)有充分破壞，導(dǎo)致花粉不能完全分散開(kāi)，也有可能是通關(guān)藤花粉塊的特殊結(jié)構(gòu)和含有特殊成分使得這3 種方法不適合其花粉活力的測(cè)定。此外，TTC 染色法的染色效果還可能與花粉的呼吸作用和花粉外壁的結(jié)構(gòu)有關(guān)[14]?；ǚ垭x體萌發(fā)法測(cè)定的花粉活力最低，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4、6 和8 h 花粉都不萌發(fā)，只在培養(yǎng)24 h 時(shí)分別在初花期和盛花期的1 個(gè)視野中發(fā)現(xiàn)了1 粒花粉萌發(fā)?？赡苁潜驹囼?yàn)所用培養(yǎng)基不適合通關(guān)藤花粉萌發(fā)，對(duì)其萌發(fā)最適合的培養(yǎng)基的確定還有待進(jìn)一步的研究。本研究中I2-KI 染色法的染色率最高，而且各重復(fù)之間差異顯著，所以I2-KI 染色法能準(zhǔn)確地反應(yīng)通關(guān)藤的花粉活力，可作為測(cè)定通關(guān)藤花粉活力最佳的方法。這與在肋柱花[13]、大葉相思[15]等植物上的研究結(jié)果一致。這可能是通關(guān)藤花粉中淀粉含量較高，I2-KI 容易滲透進(jìn)花粉壁使花粉粒著色。在本研究中還發(fā)現(xiàn)通關(guān)藤花粉活力隨著花齡的增大而減小，但是在通關(guān)藤的整個(gè)花期中都保持著花粉活力，這可能是通關(guān)藤適應(yīng)蘿藦科植物傳粉率低、坐果率低的一種機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究采用的5 種測(cè)定通關(guān)藤花粉活力方法中，TTC 染色法、醋酸洋紅染色法和過(guò)氧化物酶染色法測(cè)出的花粉活力都相對(duì)較低，顏色較淺，染色效果不佳，而I2-KI 染色法測(cè)得的花粉活力高達(dá)90.85%。所以，I2-KI 染色法為測(cè)定通關(guān)藤花粉活力有效的方法，并且隨著花齡增大花粉活力有所下降。