宋唯一 劉景 白瓊瓊 武希玲 張金鵬 殷德輝

阻燃劑(flame retardant,FR)是一類賦予易燃聚合物難燃性的功能化合物,廣泛應用于多種行業(yè),如塑料、粘合劑、橡膠和染料等。阻燃劑在自然環(huán)境中易殘留,且能在生物體內(nèi)蓄積,尤其是脂肪組織,因此,阻燃劑對人群的毒理學影響以及潛在的生態(tài)風險已經(jīng)引起國際 公共衛(wèi)生領域學者的廣泛關注［1］。目前已有研究表明,用于阻燃的化學品,如多溴化,二苯醚(BDEs)可損害大腦發(fā)育,導致內(nèi)分泌紊亂,干擾生殖功能和導致患癌風險等［2,3］。因此,許多國家/地區(qū)嚴格規(guī)范了某些五溴二苯醚和八溴二苯醚技術配方的使用,例如 BDE-99、BDE-47 和BDE-183。十溴二苯醚最近被《斯德哥爾摩公約》列為持久性有機污染物 POPs［4］。除溴系阻燃劑外,磷酸鹽阻燃劑同樣應用廣泛。目前市面已經(jīng)開發(fā)出多種商用低聚有機磷阻燃劑替代多溴二苯醚等傳統(tǒng)的溴系阻燃劑［5］,TDMPP 近年被確定為是PBDMPP 阻燃劑配方中的雜質(zhì)［6］。體外研究表明,TDMPP 能夠激活雌激素受體(ERα),其效力為雌二醇(E2)的 1/10000,具備干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的潛力［7］。然而對磷酸鹽阻燃劑體內(nèi)毒理影響的評估尚不完善,關于TDMPP 的系統(tǒng)性毒理學評價尚未見報道。本研究中,應用多種斑馬魚轉基因品系,對新型的有機磷阻燃劑TDMPP 進行系統(tǒng)性毒理學評價,包括急性毒性、發(fā)育毒性和器官毒性等,從而為TDMPP 的市場應用和危險度評估提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 TDMPP、MS-222、甲基纖維素、亞甲基藍等均購于美國Sigma 公司。尼康熒光體式顯微鏡Nikon SMZ18,Digit Sight DS-Fi2。上海海圣斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng),Z-A-D5,交配盒。培養(yǎng)箱,HPX-9052MBE。水浴鍋,金壇良友HH-3A。

1.2 斑馬魚品系及養(yǎng)殖 肝胰臟雙標記斑馬魚品系Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP)購于國家斑馬魚中心。采用全套斑馬魚自動化養(yǎng)殖系統(tǒng),水溫 28℃,pH=(7.3±0.2),電導率500～550 μS/cm,氧飽和度≥80%。喂食豐年蟲2 次/d。所以實驗步驟嚴格遵守徐州醫(yī)科大學動物倫理委員會的相關規(guī)定。

1.3 TDMPP 暴露實驗 將50 mM TDMPP 儲液用系統(tǒng)水倍比稀釋至0～2000 μM。以6 孔板為容器,隨機選取270 顆2 h pf 的肝臟胰腺雙標記轉基因斑馬魚胚胎于6 孔板中,將2 h pf 受精卵隨機分為處理組和對照組,每孔30 顆受精卵,每組2 個復孔,確保各組乙醇濃度均＜0.01%,連續(xù)暴露至72 h pf。72 h 后,將幼魚麻醉后(0.03% MS-222),在熒光體視鏡下觀察各組幼魚肝臟及胰腺的發(fā)育形態(tài)并拍照。隨后,統(tǒng)計各組幼魚存活率,應用 SPSS 軟件計算半數(shù)致死量(LC50)。根據(jù)LC50,選取 10 μM 和 100 μM 分別作為低濃度組和高濃度組進行后續(xù)研究。相同的處理方式,72 h 后進一步觀察各組中幼魚的畸形率、出殼率、心率等。

1.4 觀察指標 分析不同TDMPP 濃度對斑馬魚幼魚致死、生長及出殼的影響,TDMPP 早期暴露對斑馬魚幼魚的致畸作用,不同濃度TDMPP 對斑馬魚肝臟及胰腺的發(fā)育毒性影響。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用 GraphPad 6.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),多重比較應用 Tukey 分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同TDMPP 濃度對斑馬魚幼魚致死、生長及出殼的影響分析 TDMPP 對斑馬魚致死、出殼、身長的影響在一定濃度范圍內(nèi),TDMPP 濃度與幼魚死亡率呈正相關(r=0.8707,P＜0.05)。見圖 1A～1B。濃度達到2000 μM 時導致全部幼魚死亡,死亡率為 100%。TMDPP對斑馬魚胚胎的24h LC50 為1792 μM,72 h LC50 為1195 μM。在處理到72 h pf 時,與對照組相比,TDMPP 高濃度組(100 μM)能夠顯著抑制斑馬魚幼魚生長(P＜0.01),而TDMPP 低濃度組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.9832＞0.05),見圖1C。檢查72 h出殼率時,出殼率與暴露濃度呈現(xiàn)正相關(r=0.9078,P＞0.05)。見圖1D。

圖1 不同TDMPP 濃度對斑馬魚幼魚致死、生長及出殼的影響

2.2 TDMPP 早期暴露對斑馬魚幼魚的致畸作用分析 72 h pf 時形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),TDMPP 對斑馬魚的致畸作用主要體現(xiàn)在心包水腫、脊柱畸形、腹腔水腫和色素形成異常等。見圖2A～F。定量分析顯示,低濃度組和對照組的表型率比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.2726＞0.05),但高濃度組與對照組的表型率比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0022＜0.05)。對于其他三種表型,可以發(fā)現(xiàn)相似的情況,100 μM TDMPP 早期暴露導致脊柱彎曲、腹腔水腫和色素減弱的表型率均顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0244、0.0072、0.0118＜0.05)。圖2G～J。

2.3 不同濃度TDMPP 對斑馬魚肝臟及胰腺的發(fā)育毒性影響分析 TDMPP(10 μM 和 100 μM)處理3 d 后,應用轉基因斑馬魚在體式熒光顯微鏡下觀察肝臟形態(tài)。對照組可以看到清晰的紅色熒光標記的肝臟,形態(tài)正常。見圖3A。然而 TDMPP 處理組能夠觀察到明顯的肝臟異常形態(tài),發(fā)育受到阻滯,且呈現(xiàn)顯著的劑量-效應關系。Image pro 定量分析進一步確認,處理組斑馬魚個體的肝臟尺寸小于對照組,100 μM 高濃度組與對照組和低濃度組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0019、0.0274＜0.05)。見圖3B。TDMPP 早期暴露對胰腺發(fā)育同樣有顯著的抑制作用。見圖 3A。低濃度組和高濃度組中幼魚胰腺尺寸均顯著低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0016、0.0009＜0.05)。見圖3C。

圖2 TDMPP 早期暴露對斑馬魚幼魚的致畸作用

圖3 不同濃度TDMPP 對斑馬魚肝臟及胰腺的發(fā)育毒性影響

3 討論

本研究針對新型有機磷阻燃劑 TDMPP 進行了系統(tǒng)全面的毒理學評價,包括致死率、致畸率、出殼率和心率等。同時應用多種高效的轉基因斑馬魚品系,評估TDMPP 早期暴露對肝臟、胰腺及心臟的發(fā)育毒性。

本研究發(fā)現(xiàn),TDMPP 早期暴露可誘導幼魚出現(xiàn)明顯心包水腫、脊柱彎曲、腹腔水腫和色素形成異常等表型,且高濃度組變化明顯。出殼是胚胎器官發(fā)育的重要指標,但是本研究中作者沒有觀察到 TDMPP 對出殼有影響,而出殼后測量身長發(fā)現(xiàn),TDMPP 高濃度組對生長具有顯著的抑制作用。有研究表明,斑馬魚早期生長遲緩可能與芳香烴受體(AHR)介導的毒副作用相關,這種毒作用是血流減少導致的生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)缺失所引發(fā)［9］。

斑馬魚具有和哺乳動物相似的肝臟代謝功能,對外源化合物呈現(xiàn)相近的代謝途徑,在72 h pf 發(fā)育成全功能性肝臟［10］。本研究首次發(fā)現(xiàn),TDMPP 早期暴露(2～72 h)可顯著抑制斑馬魚的肝臟發(fā)育,處理組呈現(xiàn)明顯的濃度-效應關系,處理組個體的肝臟形態(tài)明顯處于異常狀態(tài)。有體外研究表明,TDMPP 具有較強的類雌激素作用,其效力甚至高于知名的外源雌激素雙酚A(BPA),可激活 ERα 表達［7］。因此 TDMPP 抑制肝臟發(fā)育可能通過雌激素核受體介導,相關內(nèi)容值得進一步深入研究。在小鼠的研究中表明,TDMPP 具有內(nèi)分泌干擾物特性,能夠直接進入新生小鼠大腦,從而影響與性別相關的腦結構變化,并損傷雌性的生殖功能［6］。

斑馬魚的胰腺發(fā)育早期起源于胚胎背側的內(nèi)胚層細胞,而位于腹側的內(nèi)胚層分化成肝芽,發(fā)育成胰腺組織的內(nèi)胚層細胞分別于24 h pf 在腸道的背部面上形成初級胰島,隨后在胰島前端,34 h pf 后形成胰管、胰外分泌腺和部分胰內(nèi)細胞。本研究中發(fā)現(xiàn),胰腺是除肝臟外的另一個主要靶器官,TDMPP 處理72 h pf 能夠顯著抑制胰腺的發(fā)育。相似的研究報道,阻燃劑PFOS 早期暴露會顯著斑馬魚胚胎的胰腺長度和面積,干擾脂質(zhì)代謝相關基因的表達。

綜上所述,斑馬魚幼魚在早期暴露于 TDMPP 后導致發(fā)育遲緩、誘導畸形,其主要的毒作用靶器官為肝臟和胰腺,可為TDMPP 的生產(chǎn)、應用和安全性評價提供直接依據(jù)。