鄭文亮，郗彥鳳，高 寧，郭江紅，白 瑋，郭艷琳

肺癌是全球最常見的癌癥，也是癌癥死亡的主要類型，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的75%～85%。NSCLC患者一般在確診時已是晚期，預(yù)后較差。近年來，NSCLC的治療在驅(qū)動基因抑制劑、效應(yīng)通路抑制劑和免疫抑制劑的研發(fā)等方面取得發(fā)展。在治療前全面了解NSCLC驅(qū)動基因突變譜，能夠幫助臨床選擇合適的靶向藥物進(jìn)行治療，從而有效延長患者的生存期。目前臨床病理常用的檢測技術(shù)尚存一定的局限性，無法同時進(jìn)行多基因、多位點的定性定量檢測。本實驗通過二代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)對209例NSCLC進(jìn)行10種驅(qū)動基因突變聯(lián)合檢測，分析這些驅(qū)動基因突變特點及其與臨床病理特征的關(guān)系；對NGS檢測與FISH、免疫組化(IHC)、RT-PCR檢測結(jié)果進(jìn)行一致性分析，探討應(yīng)用NGS技術(shù)對NSCLC驅(qū)動基因聯(lián)合檢測的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016年3月～2018年3月山西省腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的209例中晚期NSCLC石蠟包埋組織。其中，男性128例，女性81例；年齡范圍31～82歲，中位年齡59歲，分為兩組：≥60歲104例，<60歲105例；有吸煙史110例，無吸煙史99例；臨床分期：Ⅲ期87例，Ⅳ期122例；腺癌178例，非腺癌(包括肺大細(xì)胞癌、肺鱗癌、肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌及肺腺鱗癌)31例。收集入組病例往期院內(nèi)EGFR-PCR檢測結(jié)果，ALK融合FISH和IHC檢測結(jié)果，ROS1-PCR檢測結(jié)果。

1.2 DNA提取與突變檢測209例肺癌組織樣本按照廈門艾德的核酸提取試劑(FFPE DNA/RNA閩廈械備20150082號)提取DNA用于Illumina MiniSeq測序平臺(Illumina NextSeqCN500貝瑞合康)進(jìn)行測序，根據(jù)廈門艾德人類癌癥多基因突變聯(lián)合檢測試劑盒說明書進(jìn)行基因突變檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，變量組間比較采用χ2檢驗，理論頻數(shù)<5的則采用Fisher確切概率法，不同檢測方法之間的一致性分析采用Kappa檢驗。

2 結(jié)果

2.1 10種驅(qū)動基因聯(lián)合檢測突變情況209例NSCLC中10種驅(qū)動基因突變聯(lián)合檢測總體突變陽性率為69.9%(146/209)，分別是EGFR(37.6%，80/209)、ALK(13.1%，28/209)、KRAS(11.3%，24/209)、ROS1(3.3%，7/209)、HER-2(1.9%，4/209)、PIK3CA(1.4%，3/209)、BRAF(0.9%，2/209)、RET(0.5%，1/209)、MET(0，0/209)、NRAS(0，0/209)。有3例為兩種基因共存突變(表1)。

表1 3例多基因共存突變病例

2.1.1EGFR基因突變情況 在EGFR基因單一突變的78例患者中單位點突變74例，Exon19占48.7%，Exon21占43.6%，Exon20占2.6%；4例雙位點突變(5.1%)。主要包括Exon19del、Exon19delins；Exon20ins、T790M、S786I；Exon21 L858R、L861Q(表2)。

表2 EGFR突變位點情況

2.1.2ALK基因融合突變情況 27例ALK基因融合突變，包括EML4 Exon13-ALK Exon20(51.8%)，EML4 Exon6-ALK Exon20(33.3%)，EML4 Exon18-ALK Exon20(7.4%)，EML4 Exon20-ALK Exon20(3.7%)，EML4 Exon13-ALK Exon20(3.7%)。

2.1.3KRAS基因突變情況 24例KRAS基因突變中Exon2突變占95.8%(23/24)，包括G12C(33.3%)，G12V(33.3%)，G12A(20.8%)、G12D(4.2%)、G12S(4.2%)；Exon3-Q61H突變1例(4.2%)。

2.1.4其他基因突變情況 7例ROS1融合突變，包括6例CD74-ROS1、1例GOPC-ROS1。HER-2突變4例，均為p.A775_G776insYVMA突變。PIK3CA基因H1047R突變2例。BRAF V600E突變2例。RET融合(KIF5B-RET融合)1例。未檢出MET和NRAS突變陽性病例。

2.2 NGS檢測結(jié)果與臨床標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果一致性分析

2.2.1EGFR基因突變檢測結(jié)果一致性分析 209例NSCLC樣本NGS檢測結(jié)果顯示EGFR陽性突變80例(包含2例雙基因突變)，陽性率為38.3%，分別為19del 40例，L858R 36例，T790M 3例，20ins 2例，L861Q 2例，S768I 1例。RT-PCR檢測結(jié)果顯示EGFR陽性突變72例，陽性率為34.4%，分別為19del 38例，L858R 34例，T790M 2例，L861Q 2例，S768I 1例。一致性分析結(jié)果顯示具有極強一致性(Kappa=0.897，P<0.000 1，表3)。NGS檢測與院內(nèi)RT-PCR檢測EGFR基因突變位點19del、L858R和其他幾種稀有突變一致性分析，均具有極強的一致性(Kappa值分別為0.905、0.897、0.829)。

表3 EGFR基因NGS檢測與PCR檢測結(jié)果一致性分析

2.2.2ALK融合檢測結(jié)果一致性分析 209例NSCLC中205例有ALK院內(nèi)FISH檢查結(jié)果，NGS結(jié)果與FISH檢測結(jié)果一致性分析顯示，兩者具有極強一致性(Kappa=0.898，P<0.000 1)。NGS結(jié)果與IHC檢查結(jié)果一致性分析，兩者具有極強一致性(Kappa=0.920，P<0.000 1，表4)。

表4 ALK融合NGS檢測與FISH、IHC檢測結(jié)果的一致性分析

2.2.3ROS1檢測結(jié)果一致性分析 將本次對ROS1融合基因的NGS檢測結(jié)果與院內(nèi)PCR結(jié)果進(jìn)行一致性分析結(jié)果顯示，兩者具有極強一致性(Kappa=0.931，P<0.000 1，表5)。

表5 ROS1融合突變NGS檢測與PCR檢測結(jié)果一致性分析

2.3 各驅(qū)動基因突變情況與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系EGFR突變與患者性別、是否吸煙、TNM分期、組織學(xué)類型具有相關(guān)性，與患者年齡、腫瘤的發(fā)生部位無關(guān)。ALK基因融合與患者性別、是否吸煙具有相關(guān)性。KRAS基金突變與患者性別、年齡具有相關(guān)性。ROS1基因融合與TNM分期具有相關(guān)性(表6)。

表6 各基因突變與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

我國NSCLC驅(qū)動基因EGFR突變陽性率最高，其次是KRAS和ALK，ROS1和BRAF突變陽性率相對較低[1]，本組NSCLC驅(qū)動基因檢測EGFR突變陽性率為37.6%，KRAS陽性率為11.3%，ALK為13.1%，ROS1為3.3%，BRAF為0.9%，與該研究結(jié)果基本一致。EGFR突變在Exon19高發(fā)，其次是Exon21，Exon20相對較少[2]。在本組EGFR陽性病例中，Exon19突變占48.7%，Exon21占43.6%，Exon20占2.6%，與之前的研究結(jié)果一致。KRAS突變絕大多數(shù)發(fā)生在Exon2，Exon3陽性率較低[2]。KRAS基因突變類型中G12C和G12V最為常見[3]。本組中KRAS陽性Exon2突變占95.8%，主要突變類型是G12C和G12V(66.6%)，與之前的報道基本一致。ALK-EML4是ALK融合的主要類型，并且均為腺癌患者[4]，本組27例均為ALK-EML4融合，在腺癌中的比率為92.6%。本組結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本吻合，不同研究可能會因為檢測方法和檢測樣本的不同導(dǎo)致檢測結(jié)果存在一定的差異。

EGFR突變好發(fā)于具有以下特征人群：亞洲人、女性、非吸煙者、腺癌[5]，本組EGFR突變在性別、是否吸煙及組織學(xué)類型的統(tǒng)計結(jié)果與文獻(xiàn)報道相一致。另外，Ⅳ期較Ⅲ期突變陽性率高，差異有顯著性，與黃清潔等[6]報道一致。ALK重排在女性患者、非吸煙人群及腺癌中多見[7]。本組中ALK陽性在患者性別和是否吸煙組差異具有顯著性，與該報道一致。我國男性NSCLC患者KRAS基因突變陽性率高于女性，并且在腺癌中多見[8]，在本組中KRAS突變多為60歲以上男性患者。KRAS突變與吸煙的關(guān)系存在爭議，在本組中KRAS突變陽性吸煙者明顯高于非吸煙者。

在NSCLC中，極少數(shù)患者有2個或3個基因突變共存，其中EGFR/KRAS最常見，其次是ALK/KRAS[1]。EGFR與ALK在NSCLC中也有共存現(xiàn)象，盡管這種共存突變的幾率相對較小[9]，其他研究中也有報道EGFR和ALK聯(lián)合突變的病例[10]。本組中發(fā)現(xiàn)共存突變EGFR/ROS1、EGFR/PIK3CA、ALK/BRAF各1例。MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化、遷移和凋亡，而EGFR、ALK、ROS1、BRAF和PIK3CA對這兩種信號通路均有調(diào)節(jié)作用[11]。這幾種基因在單獨突變激活狀態(tài)下都可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但是對于基因共存突變的發(fā)生機(jī)制以及共存狀態(tài)下是否彼此影響尚不清楚。另外，聯(lián)合突變是否比單一突變患者的預(yù)后更差尚不清楚。相關(guān)的臨床靶向治療研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EGFR突變合并有其他驅(qū)動基因改變時，會降低對EGFR-TKIs的敏感性[12]。說明驅(qū)動基因共存狀態(tài)下可能產(chǎn)生了某種“協(xié)同作用”，從而產(chǎn)生了靶向藥物抵抗。因此，多基因共存突變的發(fā)生機(jī)制以及在腫瘤中作用機(jī)制的研究應(yīng)當(dāng)引起重視。

在NSCLC靶向治療前，全面了解腫瘤突變情況才能針對腫瘤的高度異質(zhì)性實施有效治療。許多新的治療方案也在開發(fā)中，比如聯(lián)合不同腫瘤的靶向藥物進(jìn)行治療[13]，聯(lián)合同一突變基因各代靶向藥物進(jìn)行治療[14]?；颊呋蛲蛔儽硇托枰M(jìn)行準(zhǔn)確且全面的掌握，甚至需要動態(tài)檢測。目前在臨床病理中使用的檢測技術(shù)尚有不足，F(xiàn)ISH價格昂貴、技術(shù)要求高，IHC無法明確融合基因類型[15]；RT-PCR對于從福爾馬林固定石蠟包埋樣品組織中提取的RNA質(zhì)量較差；Sanger測序法成本高、通量低。而且臨床靶向藥物的多樣化導(dǎo)致檢測項目增多，在實際診斷檢測過程中微量標(biāo)本難以滿足多項檢測，而NGS技術(shù)只需從福爾馬林固定石蠟包埋組織樣品中提取10 ng DNA或RNA，就能有效地擴(kuò)增和測序多個基因。本組對NGS與其他幾種檢測技術(shù)結(jié)果的一致性進(jìn)行分析，結(jié)果證明其準(zhǔn)確性極高。因此，NGS檢測正是目前臨床病理診斷以及靶向藥物治療優(yōu)秀的輔助檢測手段，可以為臨床NSCLC驅(qū)動基因突變的診療提供可靠支持。