丁聞潔，趙繼開(kāi)，吳佳君，韓昱晨

肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的惡性腫瘤之一?；颊叩?年生存率低于20%，主要死亡原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。根據(jù)NCCN指南TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，即使腫瘤直徑≤3 cm，只要侵犯臟層胸膜，應(yīng)歸為T(mén)2期，而非T1期。因此對(duì)肺癌患者進(jìn)行準(zhǔn)確臨床分期具有重要意義，正確判斷腫瘤是否侵犯臟層胸膜尤為重要[1-2]。本科室在實(shí)際工作過(guò)程中采用維多利亞藍(lán)彈力纖維染色結(jié)合免疫組化雙重染色，能清楚地顯示肺癌組織彈力纖維與腫瘤細(xì)胞間的關(guān)系，以準(zhǔn)確判斷是否存在胸膜侵犯。

1 材料與方法

1.1 材料選取上海市胸科醫(yī)院2018年手術(shù)切除的肺腺癌標(biāo)本42例，所有患者術(shù)前均未接受放、化療。標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋，3 μm厚切片。

1.2 試劑(1)維多利亞藍(lán)染液的配制：維多利亞藍(lán)2 g，糊精0.5 g，間苯二酚4 g，蒸餾水200 mL；將蒸餾水倒入500 mL燒杯中，加入維多利亞藍(lán)、糊精和間苯二酚溶解，慢火中煮沸；再用另一只燒杯煮沸30%三氯化鐵液25 mL，慢慢倒入維多利亞藍(lán)混合液中，繼續(xù)煮沸3 min，不斷攪拌呈膠體物。冷卻后過(guò)濾，將沉渣和濾紙放在60 ℃燒箱內(nèi)烤干。取另一只燒杯盛70%乙醇400 mL溶解沉渣，再加入冰醋酸4 mL和苯酚6 g作為防腐劑，放置1周成熟后使用。(2)免疫組化試劑：一抗TTF-1購(gòu)自上海泉輝公司，calretinin購(gòu)自北京中杉金橋公司，二抗系統(tǒng)、DAB顯色液購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)公司。(3)免疫組化儀器：Benchmark XT全自動(dòng)免疫組化機(jī)，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)公司。

1.3 方法在同一張切片上行免疫組化雙重染色及彈力纖維染色。首次染色采用免疫組化法：(1)將切片置于60 ℃電熱培養(yǎng)箱中烤2 h后，放入Benchmark XT全自動(dòng)免疫組化機(jī)中，EZ prep脫蠟1次，每次10 min；(2)脫蠟后的切片依次置于Reaction Buffer各2 min逐級(jí)水化，蒸餾水漂洗2次，每次1 min；(3)0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液加熱法進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，自然冷卻后PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次5 min；(4)每張切片滴加1滴(50 μL)3%過(guò)氧化氫阻斷液，室溫孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗5 min×3次；(5)每張切片滴加100 μL一抗TTF-1，室溫孵育60 min；(6)PBS沖洗5 min×3次，每張切片滴加1滴(100 μL)二抗，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次；(7)每張切片滴加DAB 100 μL，沖洗終止顯色；(8)一抗calretinin室溫孵育60 min；(9)PBS沖洗5 min×3次，二抗37 ℃孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次；(10)每張切片滴加Fast Red溶液100 μL，沖洗終止顯色；每批染色均用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。第二重染色按維多利亞藍(lán)法顯色彈力纖維：(1)免疫組化顯色終止水洗后加入1%高碘酸氧化10 min；(2)水洗；(3)70%乙醇稍洗；(4)置入維多利亞藍(lán)液內(nèi)染120 min；(5)95%乙醇分色數(shù)秒；(6)流水稍沖洗；(7)蘇木精10 min；(8)水洗；(9)0.5%鹽酸乙醇1～2 s返藍(lán)；(10)干燥、透明、中性樹(shù)膠封固。

2 結(jié)果

第一重染色，肺腺癌細(xì)胞核表達(dá)TTF-1，DAB顯色呈棕色；胸膜表面間皮細(xì)胞中calretinin呈核質(zhì)著色，F(xiàn)ast Red顯色呈紅色。第二重染色，彈力纖維為藍(lán)綠色，粗細(xì)不等，呈波浪狀(圖1)。42例肺腺癌標(biāo)本分別采用傳統(tǒng)胸膜彈力纖維染色和免疫雙染進(jìn)行分組后觀察T分期變化(表1)，1例T2期腫瘤(3 cm<腫瘤最大徑<5 cm)雖然分期不變，胸膜情況則由原來(lái)的侵破臟層胸膜間皮層降為侵犯臟層胸膜彈力層但未突破間皮層(圖1)。2例T1期腫瘤提升為T(mén)2期，免疫組化雙重染色加彈力纖維染色能夠清楚地顯示單個(gè)或散在侵犯臟層胸膜彈力層的腫瘤細(xì)胞(圖2)。

表1 42例肺腺癌T分期變化[n(%)]

①A①B①C②A②B②C

3 討論

彈力纖維在人體分布廣泛，皮膚、耳廓、血管壁、韌帶、腺管壁、氣管、支氣管、肺泡等部位較豐富，由彈性蛋白組成，纖維細(xì)小，交織成網(wǎng)。常規(guī)HE染色難以區(qū)分膠原纖維和網(wǎng)狀纖維。彈性纖維染色在肺中主要用于判斷胸膜浸潤(rùn)存在的問(wèn)題，有無(wú)突破彈力層直接影響著患者的臨床分期，目前彈力纖維染色與免疫組化雙重染色在心血管系統(tǒng)疾病中已有研究報(bào)道[3-5]，但在肺中免疫組化雙重染色及彈力纖維染色法并無(wú)相關(guān)報(bào)道，本組中彈力纖維染色采用的是維多利亞藍(lán)染色法，較堿性品紅等染色方法有明顯優(yōu)點(diǎn)：染色時(shí)間短，僅用1～2 h；染液能保存數(shù)年，且能反復(fù)使用；HE、VG復(fù)染效果清晰等。維多利亞藍(lán)染色的主要原理是利用間苯二酚與三氯化鐵組成帶有弱正電荷的染料非極性吸著彈性纖維完成染色。

由于臟層胸膜彈力層和癌組織間有大量的纖維組織及血管增生，臟層胸膜覆蓋在肺表面并深入肺葉間隙，HE染色時(shí)難以觀察胸膜是否被真正侵犯，且在日常工作中，一些腫瘤組織靠近胸膜的蠟塊又同時(shí)需要行免疫組化和彈力纖維染色時(shí)，反復(fù)的修整蠟塊，容易造成貼近胸膜少量癌巢被修掉而造成胸膜判斷的不準(zhǔn)確性，所以在一張切片行彈力纖維與免疫組化雙重染色可以清晰地顯示一些癌組織浸潤(rùn)情況及與彈力纖維的關(guān)系，臟層胸膜間皮細(xì)胞下面的第一層彈力纖維經(jīng)染色后呈藍(lán)色，如果癌細(xì)胞破壞藍(lán)色彎曲的彈力纖維的連續(xù)性，則證明存在胸膜侵犯。

本組非小細(xì)胞肺癌病例在經(jīng)過(guò)彈力纖維染色加HE與彈力纖維染色加免疫組化對(duì)比后，T1、T2分期中2例T2期低分化癌未被檢出，被錯(cuò)誤劃分為T(mén)1期，T3、T4期無(wú)顯著差別，根據(jù)國(guó)際肺癌研究會(huì)(IASLC)第7版提示肺臟層胸膜侵犯為腫瘤T1和T2期關(guān)鍵指標(biāo)，所以在分化較差的腫瘤中彈力纖維加免疫組化雙重染色能更準(zhǔn)確的顯示腫瘤和胸膜的浸潤(rùn)情況，采用免疫組化雙重染色技術(shù)，更有利于對(duì)腫瘤組織學(xué)結(jié)構(gòu)判讀，從而更易作出正確判斷，減少誤差。本實(shí)驗(yàn)采用肺常規(guī)檢查免疫組化TTF-1和calretinin，再與彈力纖維染色相互聯(lián)用，使之更直觀的看清腫瘤組織對(duì)胸膜的侵犯程度。這樣對(duì)一些微小的病變區(qū)域的診斷提供更客觀和直觀的依據(jù)，如果分開(kāi)免疫組化、彈力纖維染色等各自單染，反復(fù)的修切蠟塊也易造成胸膜分期的不確定性，所以現(xiàn)實(shí)工作中取材時(shí)靠近胸膜的位置取2塊組織，并在常規(guī)HE切片中與彈力纖維染色加免疫組化雙重染色一同制片，提供最可靠的胸膜侵犯診斷依據(jù)，為臨床提供更可靠的數(shù)據(jù)。

在染色過(guò)程中主要需注意：(1)維多利亞藍(lán)染液浸染后，用乙醇分色要注意其分化時(shí)間，動(dòng)作應(yīng)迅速；(2)蘇木精染色后用鹽酸乙醇動(dòng)作也應(yīng)迅速，避免彈力纖維褪色，也可以選擇Mayer蘇木精，這樣可以減少鹽酸乙醇對(duì)蘇木精的褪色，本組實(shí)驗(yàn)因不使用伊紅所以也減少?gòu)?fù)染對(duì)彈力纖維染色的覆蓋與褪色，能更清晰的顯示彈力層，操作簡(jiǎn)便，便于操作。

總之，隨著病理學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特殊染色與免疫組化雙重染色越來(lái)越多地運(yùn)用于病理工作中，為病理診斷及科研提供了幫助。