劉 蘭，熊大維，李 鵬，黃筱萍

(江西省科學(xué)院微生物研究所，330096，南昌)

0 引言

2-苯乙醇(2-Phenylethanol，2-PE)是一種具有玫瑰香味的芳香醇，天然存在于玫瑰油、橙花油、香葉油等芳香油中，因它具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣，而廣泛用于各種食品、醫(yī)藥、化妝品、煙草、造紙等行業(yè)日化產(chǎn)品中，是配制玫瑰香型食品添加劑，玫瑰香型香精的主要原料[1-2]。并且具有廣譜抗菌作用，可抑制多種細菌和真菌，尤其是果蔬致腐真菌的生長，可作為新型生物保鮮劑應(yīng)用于食品保鮮中[3-4]。利用酵母生長細胞催化L-苯丙氨酸(L-Phe)轉(zhuǎn)化合成2-PE，代謝過程中會生成雜酸(如丁酸、戊酸、異戊酸等)、雜醇(丁醇、異戊醇等)副產(chǎn)物，且培養(yǎng)基組分復(fù)雜(含大量糖、蛋白質(zhì)、核酸等)，在產(chǎn)品的分離純化如精餾過程中會增加產(chǎn)物提純的難度，異味物質(zhì)也會破壞2-PE的原始香氣成分而影響產(chǎn)品品質(zhì)[5-6]。采用酵母靜息細胞作為酶的載體，反應(yīng)液組分非常簡單，除底物和少量輔助底物外，無其他有機碳、氮源，副產(chǎn)物少，有利于產(chǎn)品分離純化[7-9]。

生物轉(zhuǎn)化法合成2-PE的提取方法主要有有機溶劑萃取法、吸附分離法、滲透萃取法和全蒸發(fā)法[10]。有機溶劑液-液萃取法通常采用醇類、烴類等化合物進行萃取，再通過蒸餾獲得2-PE，其優(yōu)點是提取量較大，操作比較簡便，但存在溶劑殘留和精制成本高的缺點[11-12]。

吸附分離法是利用樹脂吸附分離法可以配合發(fā)酵過程中的產(chǎn)物原位分離技術(shù)原理，將達到一定濃度的2-PE及時從發(fā)酵液中移走，從而最大限度降低2-PE的產(chǎn)物抑制作用，大幅提高2-PE的總產(chǎn)量，再用有機溶劑將吸附于樹脂上的產(chǎn)品洗脫[13-14]。滲透萃取法萃取能力較強，但操作復(fù)雜，僅適合于小批量的2-PE提取和實驗室應(yīng)用技術(shù)[15]。全蒸發(fā)法主要用于較低濃度產(chǎn)品的富集。目前2-PE產(chǎn)品精制主要采用精餾分離，田勛[16]采用雙塔精制獲得了高純度的產(chǎn)品，由于2-PE沸點高，需在極低的壓力下完成精餾操作，操作條件嚴(yán)苛。且發(fā)酵液中存在與2-PE沸點相近(如苯乙醛等)的副產(chǎn)物，產(chǎn)物不易與之分離。分子蒸餾是一種高真空下的液-液分離技術(shù)，通過不同物質(zhì)分子運動平均自由程的差別實現(xiàn)分離。當(dāng)蒸汽分子的平均自由程大于蒸發(fā)表面與冷凝表面之間的距離，利用料液中各組分蒸發(fā)速率的差異，對液體混合物進行分離[17-20]。本研究以酵母靜息細胞轉(zhuǎn)化合成的2-PE為原料，采用大孔樹脂對2-PE選擇性吸附，乙醇洗脫，洗脫液通過減壓濃縮，再經(jīng)過二級分子蒸餾精制2-PE，獲得合格產(chǎn)品，為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗原料 酵母靜息細胞生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇：本實驗室生產(chǎn)；食品級乙醇(96%)：南昌南翔化工有限公司；2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(99.5%)：Sigma公司；甲醇：默克股份兩會公司；卡爾費休試劑：天津賽孚瑞科技有限公司；HZ-816大孔樹脂：上海華震科技有限公司；超純水自制，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 7890B氣相色譜儀(FID檢測器，DB-WAX毛細管柱30 m×0.53 mm×1.0 μm)：美國Agilent公司；870KF水份分析儀：瑞士萬通中國有限公司；Practum 224-1CN分析天平：Sartorius科學(xué)儀器北京有限公司；RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；VKL 70-5-WRS-T型刮膜短程蒸餾設(shè)備：德國VTA公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)物的洗脫和收集 吸附在樹脂柱中的2-PE用2.0～2.5倍樹脂柱體積的96%乙醇洗脫，洗脫流速為3.0～4.5 m3/(m3·h)，得到約1.5倍樹脂體積的含2-PE的洗脫液。

1.2.2 旋轉(zhuǎn)薄膜減壓蒸餾濃縮2-PE條件 含2-PE樹脂洗脫液通過減壓蒸餾回收乙醇，蒸餾溫度50～60 ℃、壓力在50～200 mbar，測定輕重組分中的2-PE含量，計算2-PE濃縮收率。

1.2.3 分子蒸餾工藝條件 2-PE粗提液從加料器進入短程蒸餾裝置，在刮膜器的作用下，從進料器計量泵入分子蒸餾裝置，均勻分布于蒸發(fā)器表面上，蒸發(fā)器表面溫度由傳熱油精確控制。在高真空條件下，輕組分以氣態(tài)徑直飛向中間冷凝器并冷凝成液體，沿著冷凝器流入輕組分收集瓶中。重組分沿著內(nèi)壁進入重餾分收集瓶中，然后重餾分再次通過蒸餾分離出產(chǎn)品。為了防止揮發(fā)物進入真空系統(tǒng)，須在冷阱中加入液氮作為深冷劑。刮膜系統(tǒng)可以保證整個蒸發(fā)面上液膜的均勻性，液膜表面不斷被更新，從而確保了被加熱原料在蒸發(fā)面上的停留時間。一級分子蒸餾是去除乙醇和水等低沸物，收集重組分；二級分子蒸餾是將重組分重新進行蒸餾，收集輕組分2-PE產(chǎn)品，采用氣相色譜分析樣品及產(chǎn)品中2-PE和乙醇的含量。

1)一級分子蒸餾。物料：2-PE濃縮液，其中2-PE含量892 g/L，乙醇含量40～120 g/L，H2O 1.66%；考察在刮膜轉(zhuǎn)速350 r/min、進料速率4.0 mL/min條件下，溫度分別為70 ℃、75 ℃時，不同蒸餾壓力(200 mbar、250 mbar、300 mbar、350 mbar、400 mbar)對脫醇效果和蒸餾效率的影響。另外考察了在蒸餾溫度70 ℃、刮膜轉(zhuǎn)速350 r/min，蒸餾壓力300 mbar時，不同的進料流速(2.0 mL/min、4.0 mL/min、6.0 mL/min)對脫醇效果和蒸餾效率的影響。一級分子蒸餾的輕組分可以合并至下批次的物料中進行重新分離，重組分作為二級蒸餾的原料進行產(chǎn)品分離。

2)二級分子蒸餾。在刮膜轉(zhuǎn)速350 r/min、進料速率2.0 mL/min條件下，考察溫度分別在120 ℃、125 ℃時，蒸餾壓力為10 mbar、20 mbar、30 mbar、40 mbar、50 mbar的蒸餾效率和產(chǎn)品色度。在刮膜轉(zhuǎn)速為300 r/min，溫度120 ℃，蒸餾壓力30 mbar條件下，考察進料速率分別為2.0 mL/min、4.0 mL/min、6.0 mL/min、8.0 mL/min、10.0 mL/min、12.0 mL/min對蒸餾效率和產(chǎn)品質(zhì)量的影響。在進料速率分別為3.0 mL/min，溫度120 ℃，蒸餾壓力30 mbar條件下，考察刮膜轉(zhuǎn)速分別為100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min、300 r/min、350 r/min、400 r/min對蒸餾效率和產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

1.2.4 GC法測定2-PE和乙醇含量 取適量樣品，用色譜純丙酮稀釋、混勻，0.22 μm聚醚油性濾膜過濾后進樣。色譜柱：Agilent DB-WAX彈性石英毛細管柱(30 m×0.53 mm×1.0 μm)；載氣：99.999%高純氮氣，流速為5 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，進樣器溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，F(xiàn)ID檢測器。升溫程序：80 ℃(2 min)→升溫速率(20 ℃/min)→220 ℃(3 min)；進樣方式：分流進樣，分流比10:1；進樣量1 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂柱中2-PE的洗脫

生物轉(zhuǎn)化液中的2-PE經(jīng)HZ-816大孔樹脂吸附，當(dāng)流出液中有2-PE時切換樹脂柱，將吸附飽和的樹脂柱(樹脂裝柱體積為7.3 L，HZ816大孔樹脂濕視密度為0.65～0.75 g/mL，范圍粒度為0.315～1.25 mm，先用約1.5～2倍樹脂體積的純水置換樹脂柱中的轉(zhuǎn)化液，主要去除殘留在樹脂柱中的轉(zhuǎn)化液底物L(fēng)-苯丙氨酸，再用約1.5倍樹脂體積96%乙醇溶液進行洗脫。洗脫流速為1.0～2.5 m3/(m3·h)，收集含2-PE的乙醇洗脫液，不含2-PE的乙醇溶液合并其他脫醇液進行乙醇回收，回收的乙醇用于下一批次的使用。圖1為乙醇在洗脫流速為1.5 m3/(m3·h)動態(tài)洗脫2-PE濃度變化。

圖1 在不同的空間流速下乙醇動態(tài)洗脫2-PE濃度變化

在不同的洗脫流速下所需的乙醇量均為樹脂量體積的1.5～2.0倍之間，洗脫流速為1.5 m3/(m3·h)時2-PE出峰更加集中，洗脫的乙醇量也略低，洗脫效果更佳，因此選擇1.0～2.0 m3/(m3·h)的洗脫流速較為合適。

2.2 2-PE濃縮

將收集的含2-PE洗脫液置于薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進行減壓蒸餾，去除溶劑乙醇和水，濃縮產(chǎn)物。蒸發(fā)條件為溫度60～75 ℃，蒸發(fā)壓力為10～40 kPa。測定餾出液和濃縮液中的2-PE含量，計算收率。表 1為不同批次2-PE收率變化。

表1 減壓蒸餾制備2-PE濃縮液的物料組成和收率

通過旋蒸濃縮乙醇洗脫液，可獲得2-PE濃度為88%～92%的濃縮液，濃縮液呈深棕色，2-PE濃縮收率可達98%以上。

表2表明，3批次乙醇回收率在95%左右，可能會有少量乙醇隨真空排出了系統(tǒng)，可通過控制真空度和冷凝溫度減少乙醇的損失。

表2 減壓蒸餾回收乙醇收率

2.3 一級蒸餾工藝條件

2.3.1 一級蒸餾溫度和壓力對除乙醇效果的影響 通過二級分子蒸餾對2-PE產(chǎn)品進行精制。一級分子蒸餾的目的是去除乙醇和水等低沸物，二級分子蒸餾的目的是獲得2-PE產(chǎn)品。在進料速率為4.0 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速為300 r/min，蒸餾溫度分別為70 ℃和75 ℃時，在不同蒸餾壓力條件下的脫醇效果和蒸餾效率(圖2)。所用原料2-PE濃縮液，其組分2-PE為850～920 g/L，H2O為0.1%～0.6%，乙醇為10～50 g/L。

圖2 不同溫度和系統(tǒng)壓力下重組分中乙醇濃度和分離效率

重組分中乙醇濃度越低，乙醇去除效果越好；重組分：輕組分(w/w)比值越高，分離效率越高。在同一蒸餾溫度下，提高蒸餾壓力，不利于分離乙醇，但蒸餾效率明顯提高；在相同的壓力下，提高蒸餾溫度有利于去除乙醇，但蒸餾效率有所下降，綜合乙醇去除效果和分離效率，較佳的操作條件為蒸餾溫度70 ℃、蒸餾壓力為250～300 mbar。

2.3.2 進料速率對脫醇效果的影響 在70 ℃、蒸餾壓力為250 mbar、300 mbar條件下，進料速率分別為2.0 mL/min、4.0 mL/min、6.0 mL/min進行蒸餾，考察不同進料速率對脫醇效果的影響，結(jié)果見表3。

表3 一級分子蒸餾進料速率對脫醇效果的影響

隨著進料流速的降低，重組分與輕組分的比例下降顯著，重組分中的2-PE收率略有下降。進料速率對乙醇分離效果影響不顯著，但對2-PE蒸餾效率影響較為明顯，因此選用進料流量為4.0 mL/min比較適宜。

2.4 二級分子蒸餾工藝

2.4.1 蒸餾溫度和壓力對2-PE收率和質(zhì)量的影響 以一級蒸餾的重組分為原料，重新泵入進料器，蒸出的2-PE冷凝在中間冷凝器壁面上，靠重力作用逐漸流入底部的目的組分收集瓶中，未蒸餾出的重組分流入重組分收集瓶中。在蒸餾溫度為120～125 ℃，壓力為10～50 mbar，進料速率為4.0 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速為350 r/min的條件下進行二級分子蒸餾，結(jié)果見表4、圖3。

表4 不同蒸餾條件對產(chǎn)品純度、收率及色度的影響

圖3 二級分子蒸餾溫度和壓力對2-PE純度和收率的影響

在不同蒸餾溫度和壓力下，產(chǎn)品2-PE濃度均可達到985 g/L以上，在同一壓力下，提高溫度有利于2-PE濃度和收率的提高，低壓蒸餾收率較高，但產(chǎn)品色度較深，呈較明顯的淡黃色，隨著壓力的增加，收率略有下降，但產(chǎn)品色度明顯下降。綜合考慮產(chǎn)品收率、濃度和質(zhì)量，在120 ℃、30 mbar下，2-PE收率達到82.99%，產(chǎn)品濃度和質(zhì)量亦達到食品添加劑QB/T1782—2014標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.2 二級分子蒸餾過程中進料速率和刮膜轉(zhuǎn)速對產(chǎn)品質(zhì)量和蒸餾效率的影響 物料在蒸發(fā)壁上的停留時間取決于進料速率，在120 ℃、30 mbar，刮膜速率350 r/min下進行不同進料速率對產(chǎn)品蒸餾效率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 進料速率和刮膜轉(zhuǎn)速對2-PE收率的影響

提高進料速率和刮膜轉(zhuǎn)速均可提高2-PE收率，提高進料速率，產(chǎn)品的色度有所增加，這可能是進料速率大，液膜厚度增加，重組分物質(zhì)分離效果會有所下降，刮膜的轉(zhuǎn)速是物料在加熱壁面形成液膜的時間與厚度主要原因之一，而液膜的均一性和厚度會影響蒸發(fā)效率、綜合產(chǎn)品質(zhì)量和設(shè)備分離效率。在進料速率為6.0 mL/min、轉(zhuǎn)速為300 r/min時產(chǎn)品色度合格。優(yōu)化的二級分子蒸餾條件為：溫度120 ℃、壓力30 mbar，進料速率6.0 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速350 r/min，在此條件下，2-PE產(chǎn)品純度均達99.0%以上，質(zhì)量達食品添加劑QB/T1782—2014標(biāo)準(zhǔn)，收率達82.54%。由于一級分子蒸餾輕組分中的2-PE可以通過去除乙醇和水后再次回到一級分子蒸餾操作，即2-PE可以全部回收,因此在分子蒸餾過程中2-PE的收率取決于二級分子蒸餾的收率。由于2-PE濃縮收率可達98%以上，因此2-PE總收率可達80.9%。

3 結(jié)論

1)采用乙醇進行動態(tài)洗脫2-PE，洗脫流速為1.5 m3/(m3·h)時2-PE效果較佳，其用量為樹脂量體積的1.5～2.0倍。通過薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓蒸餾濃縮洗脫液，可獲得88%～90%的2-PE濃縮液，濃縮液呈深棕色，2-PE收率可達98%以上, 乙醇回收率在95%左右。

2)生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的2-苯乙醇通過二級蒸餾實現(xiàn)產(chǎn)品精制。一級分子蒸餾目的是去除乙醇和水等低沸物，二級分子蒸餾是分離出2-PE產(chǎn)品。確定了分子蒸餾的最佳運行條件，一級蒸餾的工藝條件為蒸餾溫度70 ℃、蒸餾壓力250～300 mbar，進料流量為4.0 mL/min；二級蒸餾的工藝條件為蒸餾溫度120 ℃、蒸餾壓力30 mbar，進料流量為6.0 mL/min；在此條件下產(chǎn)品色度呈淡黃色，2-PE純度達99.0%以上，收率亦達到82.99%，提取精制2-PE的總收率為81.3%。

3)與傳統(tǒng)精餾精制操作條件相比，采用二級分子蒸餾分離純化2-PE，分子蒸餾條件易于控制，蒸餾溫度大大降低，蒸餾效率較高，產(chǎn)品純度和色度均可達到食品添加劑的要求，為生物法轉(zhuǎn)化合成2-PE的工業(yè)化生產(chǎn)提供有效的工藝參數(shù)。