李 晨，張寬才*，張懿玲，胡瑪爾，尤國(guó)仁，喻理德

(1.江蘇九旭藥業(yè)有限公司，221200，江蘇，徐州；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，330004，南昌)

0 引言

白藜蘆醇(Resveratrol, Res, C14H12O3)，相對(duì)分子質(zhì)量228.25，目前已經(jīng)在21個(gè)科、31個(gè)屬的72種植物被發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在植物體內(nèi)主要以自由態(tài)和糖苷的形式存在，液相色譜研究表明花生皮、花生殼、葡萄皮、葡萄籽、葡萄蒂、牡丹籽、牡丹莢中均含有白藜蘆醇，其中，葡萄皮中白藜蘆醇的含量最高，為50～100 μg/g[1]。

從白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)式來(lái)看，其存在3,5,4-三羥基-順式-二苯乙烯和3,5,4-三羥基-反式-二苯乙烯2種構(gòu)型，在紫外光照射下反式Res易轉(zhuǎn)化為順式Res[2]。2個(gè)苯環(huán)中間的碳鏈包含了一個(gè)碳碳雙鍵，雙鍵的兩端都分別連接著一個(gè)氫原子和另外一個(gè)較優(yōu)基團(tuán)。白藜蘆醇的碳碳雙鍵上的電子云起到了給兩邊苯環(huán)共軛的作用，有效地使整體的離域電子密度降低；由于連在左右苯環(huán)上的羥基的氧原子本身有一對(duì)孤對(duì)電子，而氧原子又正好接在苯環(huán)上的碳原子上，苯環(huán)的大π鍵與氧原子上的孤對(duì)電子發(fā)生p-π共軛效應(yīng)，增大了苯環(huán)上的電子云密度，所以連接在苯環(huán)上的羥基的氫原子非常容易離開(kāi)這個(gè)共軛體系，從而使得多酚物質(zhì)白藜蘆醇被氧化形成碳氧雙鍵得到醌類物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)室保存白藜蘆醇必須注意隔絕氧氣，隔絕光線等[3]。從理化性質(zhì)來(lái)看，白藜蘆醇是無(wú)色結(jié)晶物質(zhì)，與堿性物質(zhì)如氨水溶液反應(yīng)會(huì)使得溶液變紅，同時(shí)與三氯化鐵-鐵氰化鉀(FeCl3-K3[Fe(CN)6])配合物發(fā)生顯色反應(yīng)[4]。白藜蘆醇具有抗炎消菌，預(yù)防心臟疾病，降低血脂等多種藥理作用，盡管其能夠從眾多植物中提取，但合成白藜蘆醇成本更低，純度更高。目前，白藜蘆醇在應(yīng)用上的問(wèn)題是水溶性小，穩(wěn)定性小，生物利用度低，本研究旨在制備白藜蘆醇環(huán)糊精包合物并測(cè)定其性能，探索能夠提高白藜蘆醇生物利用度和穩(wěn)定性的新方法。

圖1 白藜蘆醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)

β-環(huán)糊精包合物(圖2)的環(huán)內(nèi)腔由醚鍵包裹，層層相接，屬于疏水部位，而它環(huán)兩邊卻掛著豐富的羥基，羥基作為一種親水集團(tuán)，非常容易增大在水中的溶解度[5]。利用β-環(huán)糊精包合白藜蘆醇，能有效地把白藜蘆醇在水中溶解度小的問(wèn)題解決，而且β-環(huán)糊精包合物價(jià)格低廉，實(shí)用性高，適合作為藥物中間體，屬于藥學(xué)中藥物制劑領(lǐng)域的一種應(yīng)用廣泛的常見(jiàn)天然空穴包合材料。白藜蘆醇本身性質(zhì)不穩(wěn)定，既不容易溶解于水中，還易被氧化劑氧化。β-環(huán)糊精包合物就承載著一個(gè)保護(hù)的作用，由于它有6、7或者8個(gè)葡萄糖單元[5]，會(huì)與白藜蘆醇分子之間產(chǎn)生一種結(jié)合力，有效地提高了白藜蘆醇分子的藥物效應(yīng)。

圖2 β-環(huán)糊精包合物結(jié)構(gòu)

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

RW 20D攪拌器，XPR分析天平(奧豪斯上海天平儀器有限公司)，氣相色譜儀(山東金普分析儀器)，大燒杯，恒溫水浴鍋，移液管(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，熱風(fēng)循環(huán)烘箱，鼓風(fēng)干燥烘箱(德順烘箱設(shè)備制造)，ZW-808A封閉式微型抽濾裝置(水德科技高品質(zhì)抽濾設(shè)備)。

1.2 試劑與材料

3，5-二羥基苯甲酸、甲醇、氯化芐(純度99.6%)、四氫鋁鋰、三溴化磷、三乙氧基磷、對(duì)氧苯甲?；郊兹?。

2 實(shí)驗(yàn)操作

2.1 環(huán)糊精包合白藜蘆醇的制備過(guò)程

用witing-Horne法合成方法制備高純度白藜蘆醇，然后用噴霧干燥法制備β-環(huán)糊精包合物。

2.1.1 白藜蘆醇的化學(xué)合成 現(xiàn)代對(duì)白藜蘆醇的合成研究方法主要有witing法和witing-Horner法，本研究利用3,5-二羥基苯甲酸為原料，經(jīng)過(guò)羥基保護(hù)與SN2親核取代發(fā)生一系列有機(jī)化學(xué)反應(yīng)[6]。其反應(yīng)線路如圖3。

圖3 白藜蘆醇合成線路

首先用甲醇使3,5-二羥基苯甲酸酯化，然后用氯芐保護(hù)羥基，再使用四氫鋁鋰還原酯基為芐醇，而后用溴取代醇羥基生成溴芐，然后用witing-Horne法構(gòu)建白藜蘆醇的雙鍵[6]，之后再去掉保護(hù)酚羥基的-Bz基，得到最終產(chǎn)物白藜蘆醇。

2.1.2 噴霧干燥法制備β-環(huán)糊精包合物 將環(huán)糊精粉末倒入水溶液中攪拌，向一定濃度下的環(huán)糊精溶液中倒入制成的白藜蘆醇成品并繼續(xù)攪拌，直到攪拌均勻后形成混合充分的溶液，之后將該溶液用微米級(jí)別的膜過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，并使用噴霧干燥機(jī)對(duì)過(guò)濾出來(lái)的產(chǎn)品進(jìn)行干燥，得到的產(chǎn)物為淡黃色粉末[7]。

2.2 β-環(huán)糊精包合白藜蘆醇的性能

研究表明，白藜蘆醇能對(duì)人體內(nèi)乙?；傅幕虍a(chǎn)生積極影響，促進(jìn)清除自由基與抗氧化能力，保持的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，延緩細(xì)胞衰老。乙?；甘且环N防止人體內(nèi)健康細(xì)胞衰老的基因，能夠防治癌癥當(dāng)中正常細(xì)胞的生長(zhǎng)變化，β-環(huán)糊精能夠有效促進(jìn)白藜蘆醇的水溶性，使白藜蘆醇通過(guò)此藥物制劑的方式被人體口服利用[8]。以下是對(duì)環(huán)糊精白藜蘆醇包合物的性能的測(cè)定。

2.2.1 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的性能對(duì)比 設(shè)置實(shí)驗(yàn)溫度梯度分別為25℃(室溫光照)、45℃(光照)、65℃光照3個(gè)條件下觀察白藜蘆醇和被β-環(huán)糊精包合的白藜蘆醇的保留程度。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在各個(gè)溫度下的保留程度都極低；而β-環(huán)糊精包合的白藜蘆醇卻只失去了一小部分，溫度的影響較小，儲(chǔ)藏穩(wěn)定性都比較高。

2.2.2 水溶性能的對(duì)比 控制實(shí)驗(yàn)的其他變量一致，在2個(gè)盛有適量水溶液的燒杯中比較β-環(huán)糊精包合的白藜蘆醇和單純的氧化白藜蘆醇的溶解程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為用環(huán)糊精包合的產(chǎn)物溶解度達(dá)到了15 mg/mL，約為普通白藜蘆醇直接溶解的500倍。

2.2.3 藥物作用效果對(duì)比 經(jīng)過(guò)環(huán)糊精包合的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，濃度過(guò)高的白藜蘆醇會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，但β-環(huán)糊精包合的白藜蘆醇能在0～100 μM濃度范圍有較強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞作用[9]。

3 討論與展望

3.1 RES的2種吸光度關(guān)系

根據(jù)吸光度值來(lái)看，當(dāng)將RES的濃度控制在0.005～0.020 mmol/L的范圍內(nèi)，用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)可在一定的波長(zhǎng)內(nèi)收到的吸光度逐漸遞增。這說(shuō)明了在這個(gè)濃度范圍之內(nèi)的白藜蘆醇具有的水中溶解度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)(表1)。

表1 吸光度隨濃度變化表

由β-環(huán)糊精包合的RES分子在水中的溶解度增加了39.8～46.7倍，其中，吸光度與物質(zhì)在水中的濃度呈現(xiàn)正比關(guān)系。用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)可見(jiàn)，可在306 nm處測(cè)出比普通RES濃度遞增的更大的吸光度。

3.2 RES的包合物應(yīng)用前景

本實(shí)驗(yàn)采用witing-Horne法合成方法制備高純度白藜蘆醇，然后用噴霧干燥法制備β-環(huán)糊精包合物，方法簡(jiǎn)便快捷, 形成的包合物的理化性質(zhì)發(fā)生了不同客體分子的改變，彌補(bǔ)了白藜蘆醇在水中溶解度差、容易被氧化劑氧化且受光線照射易降解的缺陷。RES作為未來(lái)的一種高能藥物，發(fā)揮出來(lái)的醫(yī)療藥效與人體吸收度密切相關(guān)。由于白藜蘆醇在水中的溶解度低，提高其水溶性的相關(guān)研究是非常有必要的。

本研究為開(kāi)發(fā)抗衰老、抗癌的新型藥物制劑提供了理論依據(jù)，白藜蘆醇具有很好的臨床應(yīng)用背景，而其溶解度的提高，不僅擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，還能使其在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。RES的環(huán)糊精包合物無(wú)論在儲(chǔ)藏穩(wěn)定性或者水溶解性能亦或是藥物效果上都領(lǐng)先于未被包合的產(chǎn)物，目前水溶液的RES產(chǎn)品價(jià)值高出原產(chǎn)品數(shù)倍。由此可見(jiàn)，β-環(huán)糊精包合的方式有效地解決了白藜蘆醇水溶性低的問(wèn)題。在今后的研究中，若拓寬RES的利用領(lǐng)域，我國(guó)將在抗癌防衰老與預(yù)防心血管疾病等領(lǐng)域中更進(jìn)一步。