馬平英，羅 雯，詹怡昕，吳楚楚，熊雨順，許小群，陳 梅

(南昌師范學(xué)院生物系，330032，南昌)

0 引言

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種理想型的模式生物，其應(yīng)用價(jià)值很高，培養(yǎng)簡(jiǎn)單快速，具有非致病性及良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)等優(yōu)勢(shì)，是目前生產(chǎn)各種工業(yè)用酶的理想表達(dá)宿主。但是目前，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)仍然存在不完善的地方。本文主要介紹了枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展和應(yīng)用進(jìn)展，旨在為枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究提供參考。

1 枯草芽孢桿菌的優(yōu)點(diǎn)

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性短桿菌，有鞭毛，進(jìn)行依賴性運(yùn)動(dòng)，其運(yùn)動(dòng)細(xì)胞更易形成菌膜[1]。該菌耐熱，在土壤和腐敗的有機(jī)物中易于生存，且不含有外毒素和內(nèi)毒素，在工業(yè)生產(chǎn)和制藥中被認(rèn)為是一種安全的細(xì)菌[2]。并且一直被認(rèn)為可生產(chǎn)復(fù)雜的環(huán)狀脂肽，包括表面活性素、伊圖林和豐霉素等，這些脂肽是很強(qiáng)的表面活性劑并具有抗菌活性，可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3-5]。又因枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)發(fā)育迅速,能在廉價(jià)碳源中良好生長(zhǎng)，易于生存繁衍，可分泌多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有優(yōu)良的發(fā)酵基礎(chǔ)[6]，且能抑制多種菌類的生長(zhǎng)，預(yù)示著其未來具有許多潛在的用途[7]。現(xiàn)已揭示了枯草芽孢桿菌中存在的大量調(diào)控相互作用和2個(gè)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集，因此可以通過網(wǎng)絡(luò)成分分析以及模型選擇綜合分析轉(zhuǎn)錄因子活性并揭示轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[8]。此外還發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌中存在的整合與接合因子(ICEs)能促進(jìn)水平基因轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移所具有的不相容性為轉(zhuǎn)移元件及其宿主細(xì)胞提供了選擇優(yōu)勢(shì)[9]。

2 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展

一直以來，枯草芽孢桿菌都被用作生產(chǎn)與分泌工業(yè)相關(guān)酶的宿主。國(guó)內(nèi)外關(guān)于枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用已有上百年的歷史，早期工作主要是分離鑒定、形態(tài)觀察以及各種功能的鑒定，目前的研究重心逐漸轉(zhuǎn)移到遺傳學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域。從環(huán)境和健康等角度出發(fā)，系統(tǒng)地了解革蘭氏陽性細(xì)菌至關(guān)重要，KOO[10]等構(gòu)建了枯草芽孢桿菌的2個(gè)單基因缺失文庫，據(jù)此分析獲得了一系列功能基因，并提供了一套高通量表型分析方法，為研究革蘭氏陽性細(xì)菌的基因功能、代謝途徑以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了豐富資源。

目前提高枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化效率的方法主要有3種，一是利用多聚體質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化；二是電穿孔法；三是原生質(zhì)法。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化更難實(shí)現(xiàn)，研究者從不同角度就如何提高轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了探索。YOKOI[11]等人設(shè)計(jì)了在2個(gè)不同受體菌之間實(shí)現(xiàn)基因傳遞的RK2系統(tǒng)，并優(yōu)化了從大腸桿菌到枯草芽孢桿菌的基因傳遞。已有研究證明枯草芽孢桿菌的天然感受態(tài)菌株可以攝取多個(gè)不同的DNA分子，YE[12]等人基于這種現(xiàn)象設(shè)計(jì)并構(gòu)建了枯草芽孢桿菌的未標(biāo)記突變體，通過篩選對(duì)壯觀霉素具有抗性的pUS20轉(zhuǎn)化子來獲得靶突變，這種方法能夠以大約30%的頻率傳遞點(diǎn)突變。NADLER[13]等人利用宿主天然的感受性以及同源重組能力開發(fā)了一種異源基因表達(dá)調(diào)控的自動(dòng)化系統(tǒng)，有效克服易形成包涵體、毒性基因劑量效應(yīng)或無法達(dá)到代謝工程所需水平等弊端，實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)化及表達(dá)。這種方法適用性較廣，對(duì)DNA的機(jī)械損傷微乎其微。ZHAO[14]等人使用含有反向選擇標(biāo)記mazF的枯草芽孢桿菌，成功構(gòu)建了一個(gè)具有高轉(zhuǎn)化效率、高陽性率且操作簡(jiǎn)便的新型質(zhì)粒種間轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，為芽孢桿菌的遺傳操作提供了一個(gè)新的方法。

基于枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)重組蛋白中所起的重要作用，如何提高表達(dá)效率一直備受關(guān)注。TRAN[15]等人構(gòu)建了在沒有LacI阻遏物的情況下使用IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子的無誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒，并在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效非誘導(dǎo)性表達(dá)，表達(dá)水平是誘導(dǎo)表達(dá)的37倍，該表達(dá)載體既可用于小規(guī)模基因表達(dá)的研究，也可用于大規(guī)模重組蛋白的生產(chǎn)。MARIAN[16]等利用基因工程手段開發(fā)了無標(biāo)記基因缺失系統(tǒng)，用于優(yōu)化枯草芽孢桿菌對(duì)蛋白質(zhì)和低分子量物質(zhì)。FU[17]等人利用包含不同信號(hào)肽的文庫DNA直接轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，對(duì)枯草芽孢桿菌分泌異源蛋白的最佳信號(hào)肽進(jìn)行了系統(tǒng)篩選，顯著提高了AmyS的產(chǎn)量。而GILBERT[18]等則利用枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)開發(fā)了SpyTag-SpyCatcher系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合，利用細(xì)胞外自組裝的優(yōu)勢(shì)為蛋白質(zhì)結(jié)合提供了一種新的靈活策略。RUANGURAI[19]等人將來自食品級(jí)植物乳桿菌BCC9546的天然質(zhì)粒用作載體，基于高效組成型啟動(dòng)子和信號(hào)肽的運(yùn)用，在重組枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)了淀粉酶的高效分泌型表達(dá)。結(jié)果表明谷氨酰胺ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的信號(hào)肽在必需氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用，在開發(fā)有效的異源蛋白分泌表達(dá)系統(tǒng)中具有潛在的用途。

3 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用進(jìn)展

枯草芽孢桿菌的研究無論在理論還是產(chǎn)品應(yīng)用開發(fā)等方面均已取得巨大成功，如工業(yè)發(fā)酵、傳統(tǒng)發(fā)酵食品制備和植物病害生物防治等。

3.1 枯草芽孢桿菌在工業(yè)上的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)成本低、耗費(fèi)時(shí)間少且有利于環(huán)境，是一種重要的表達(dá)宿主，既是有益菌，又是表達(dá)外源蛋白的工具[20]，已廣泛用于合成生物學(xué)、代謝工程和工業(yè)酶的生產(chǎn)[21]。ZHOU等通過優(yōu)化表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)了β-甘露聚糖酶(BcManA)在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)，細(xì)胞外BcManA產(chǎn)量達(dá)到6 041 U/mL，是迄今為止通過搖瓶培養(yǎng)獲得的最高產(chǎn)量，大大降低了該酶的生產(chǎn)成本[22]。重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵能力強(qiáng)，在大規(guī)模發(fā)酵中表現(xiàn)出特有的潛力，通過對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，已證明枯草芽孢桿菌WB600可以作為生產(chǎn)BglTO的合適宿主，其產(chǎn)物活性與已有商業(yè)酶相比更高效，有望在釀造工業(yè)中應(yīng)用[23]。此外，胰蛋白酶[24]、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)[25]、有機(jī)溶劑耐受蛋白酶(OSP)[26]、杜納糖[27]等多種工業(yè)產(chǎn)品均已成功在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。

3.2 枯草芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌對(duì)人類是安全的，被界定為“GRAS”(Generally Recognized as Safe)，其在工業(yè)生產(chǎn)、疫苗開發(fā)、環(huán)境保護(hù)和肽庫構(gòu)建中都起到重要作用[28-29]。將枯草芽孢桿菌MF497446施用到受鎘(Cd)污染的土壤中，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)并消除(或至少減少)農(nóng)作物中Cd的積累，確保食品安全，降低人類健康風(fēng)險(xiǎn)[30-31]。作為安全宿主，在枯草芽孢桿菌168中通過表達(dá)GGT(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)可以提高茶氨酸的產(chǎn)量[32]。

3.3 枯草芽孢桿菌在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

曲霉二糖在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景，但卻無法大規(guī)模分離和提取曲霉二糖，而蔗糖磷酸化酶(SPase)可用于生產(chǎn)曲二糖，由于枯草芽孢桿菌一般被認(rèn)為是安全的生物，WANG[33]等人首次在食品級(jí)枯草芽孢桿菌菌株中異源表達(dá)出了青春雙歧桿菌SPase，這為大規(guī)模制備曲二糖提供了基礎(chǔ)。芽孢的表達(dá)系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括安全性高、抵抗力高、成本低以及易制備，軍事科學(xué)研究院化學(xué)防御研究所宋天宇[34]等人構(gòu)建表達(dá)有機(jī)磷水解酶和脫水酶的重組芽孢，結(jié)果顯示芽孢展示可能有助于有機(jī)磷降解酶的實(shí)際應(yīng)用，并提供了有望降解有機(jī)磷化合物的生物修復(fù)方案?？莶菅挎邨U菌在生產(chǎn)具有藥理活性的重組蛋白方面具有多種優(yōu)勢(shì)，如質(zhì)量和效率、安全性和分泌能力等，因此優(yōu)于大腸桿菌。MAHDI[35]等人檢驗(yàn)了將TPD(生物合成特立帕肽)以標(biāo)簽融合形式表達(dá)和分泌到枯草芽孢桿菌外的可行性，SDS-PAGE和western blotting結(jié)果表明，hPTH(人甲狀旁腺激素)融合重組體成功表達(dá)并分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。抗菌肽由于其很少甚至是不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)不會(huì)在機(jī)體內(nèi)殘留得到科學(xué)家們的關(guān)注。PR-FO是一種新型的α-螺旋混合抗菌肽，具有較強(qiáng)的抗菌活性和較高的穩(wěn)定性，具有發(fā)展成為新一代抗菌藥物的潛力。ZHANG[36]等人在枯草桿菌WB800N中成功表達(dá)了重組PR-FO，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有較高的抑制活性，對(duì)人紅細(xì)胞的溶血活性較低?？莶菅挎邨U菌是一種具有益生菌特性的內(nèi)生孢子和生物膜形成細(xì)菌，其芽孢具有獨(dú)特的物理、化學(xué)以及生化特性，是口服疫苗遞送的強(qiáng)大平臺(tái)。通過構(gòu)建一系列重組枯草芽孢桿菌菌株，測(cè)試了口服芽孢后狗的免疫應(yīng)答能力，并據(jù)此建立了枯草芽孢桿菌用作腸道疫苗制劑的主要步驟[37]。研究也已證明枯草芽孢桿菌芽孢的口服遞送可抵抗草魚呼腸孤病毒感染[38]。

4 小結(jié)和展望

相比枯草芽孢桿菌而言，大腸桿菌仍然是藥物蛋白工業(yè)生產(chǎn)中最常用的宿主，因其較易實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，依然是藥物開發(fā)項(xiàng)目先導(dǎo)階段的首選。相比之下，芽孢桿菌的使用還存在一些問題，例如缺乏合適的表達(dá)載體、質(zhì)粒不穩(wěn)定性、易發(fā)生蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤等。

如今，枯草芽孢桿菌的完整基因組序列是已知的，未知基因的功能也已得到研究?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等現(xiàn)代技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為進(jìn)一步優(yōu)化已經(jīng)存在的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌株鋪平了道路。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，枯草芽孢桿菌底盤細(xì)胞的潛力也逐漸被揭示[39]。枯草芽孢桿菌是科學(xué)研究中的重要模式菌種，是一種具有極高研發(fā)潛力的微生物，其安全系數(shù)高、對(duì)環(huán)境無污染、高效且應(yīng)用廣泛，現(xiàn)已逐漸發(fā)展成生物技術(shù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著基礎(chǔ)研究和應(yīng)用技術(shù)更深入的研究和推進(jìn)，未來枯草芽孢桿菌將成為一個(gè)超級(jí)分泌細(xì)胞工廠[40]。