莫偉，許秀婷，肖志勛，張文智，林奕霞，周暉，汪何

下肢動(dòng)脈粥樣硬化性病變（lower extremity arterial disease，LEAD）是糖尿病常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)病率逐年上升，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，LEAD 的總體流行率為21.2%［1］。LEAD 若不能及時(shí)治療，則會(huì)成為導(dǎo)致患者致殘和死亡的重要原因，對(duì)其生命和生活質(zhì)量帶來(lái)極大威脅［2-3］。近年來(lái)隨著介入技術(shù)與材料的迅速發(fā)展，介入治療顯然已成為L(zhǎng)EAD 的主要干預(yù)措施。但術(shù)后再狹窄仍是當(dāng)今重大難題，源于介入術(shù)引起的機(jī)械性物理?yè)p傷會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)膜受損增生，加之血管彈性回縮，從而易致血管重塑而出現(xiàn)再狹窄再閉塞［4］。但研究發(fā)現(xiàn)，在中醫(yī)藥的輔助下，對(duì)于LEAD 臨床治療效果明顯提高，并對(duì)糖尿病下肢動(dòng)脈病變介入術(shù)后患者具有明顯療效。

三芪丹顆粒是經(jīng)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，廣東省第二中醫(yī)院治療糖尿病血管病變的常用有效方，由黃芪、桑葚、丹參、三七組成，通過(guò)臨床觀察也證明其能夠有效的改善患者的血糖、血脂等，對(duì)LEAD 介入后患者血管再狹窄閉塞有著一定的療效，但其對(duì)血管損傷修復(fù)的機(jī)制尚不明確。故本實(shí)驗(yàn)旨在探討該方對(duì)糖尿病兔球囊擴(kuò)張后再狹窄的改善作用及機(jī)制，為相關(guān)治療及預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24 只新西蘭大耳白兔，來(lái)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)：44007200071182，質(zhì)量約2.2～2.5 kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的室溫22℃～26℃，相對(duì)濕度40%～60%，明暗交替12 h，自由飲水、采食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循廣東省第二中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范。高脂飼料中熱量百分比分別為：2%膽固醇、0.5%膽酸和5%豬油，92.5%基礎(chǔ)飼料。

1.2 主要試劑與儀器

血糖儀、血糖試紙（輔理善越佳型，Abbott 公司），四氧嘧啶、戊巴比妥鈉（Soalrbi 公司）、PTCA 導(dǎo)絲（直徑0.014 英寸）、普通PTCA 球囊導(dǎo)管（1.5 mm×20 mm，Abbott公司）和壓力泵（北京迪瑪克醫(yī)藥科技有限公司）。TG、TC、HDL-C、LDL-C 測(cè)定試劑盒（規(guī)格：96T，南京建成品牌，批號(hào)：202006）。兔Glu ELISA 試劑盒（批號(hào)：731200622），兔hs-CRP ELISA試劑盒（批號(hào)：336200622），兔IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)：385200622），兔TNF-a ELISA 試劑盒（批號(hào)：569200622），兔ET ELISA試劑盒（批號(hào)：260220622），ELISA 試劑盒均為規(guī)格：48tests，ANRC 品牌。

1.3 藥物選擇及溶液制備

三芪丹顆粒由黃芪、桑葚、丹參、三七組成，均購(gòu)于廣東省第二中醫(yī)院，根據(jù)兔子體重稱取相應(yīng)的劑量顆粒（750 mg/kg·d），并將顆粒溶于400 mL的熱水中，充分溶解，待逐漸冷卻至常溫，分兩次喂食兔子，直至喝完。

1.4 分組及給藥

20 只兔子適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將兔隨機(jī)分為空白組（4 只）、對(duì)照組（8 只）和中藥組（8 只）；空白組不做任何處理，并予普通飼料喂養(yǎng)；對(duì)照組和中藥組采用四氧嘧啶靜脈注射建立糖尿病兔模型，糖尿病建模成功后均予高脂喂養(yǎng)，兩個(gè)組均接受了球囊擴(kuò)張股動(dòng)脈術(shù)。造模完成后對(duì)照組予清水喂食，中藥組予三芪丹顆粒溶液（750 mg/kg·d）喂食。術(shù)后4 周處死取樣。

1.5 糖尿病股動(dòng)脈損傷模型的建立

1.5.1 糖尿病兔模型建立 所有兔子均于SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，1 周后耳緣靜脈測(cè)禁食血糖（FBG）。將濃度為120 mg/mL的四氧嘧啶溶液自按1 mL/kg 靜脈注射入對(duì)照組和模型組兔子的耳緣靜脈，注射3 天后測(cè)空腹血糖，凡血糖≥13.5 mol/L 為糖尿病模型形成，血糖并將持續(xù)增高至處死前。若血糖不達(dá)標(biāo)者一周后追加四氧嘧啶80 mg/（kg·bw），追加后72 h 測(cè)FBG，若仍不達(dá)標(biāo)者一周后再次追加，直至FBG 達(dá)標(biāo)。由于四氧嘧啶會(huì)破壞大量的胰腺β 細(xì)胞，導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)釋放大量胰島素導(dǎo)致兔子低血糖死亡，從而用藥后36 h 均予以自由飲用5%的葡萄糖水以助其渡過(guò)最初的嚴(yán)重代謝失衡階段，從而減少兔子死亡風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于血糖＞33 mmol/L 的兔子均予每日1 次皮下注射2 U 重組人胰島素，直至血糖＜33 mmol/L。

1.5.2 股動(dòng)脈血管狹窄模型建立 取出建立糖尿病模型成功后的模型組兔子，將戊巴比妥鈉用生理鹽水配成溶液，并以40 mg/kg 的劑量于耳緣靜脈注射進(jìn)行麻醉，約2～3 min 后兔子意識(shí)喪失，四肢肌肉松軟，麻醉成功，若兔子仍有掙扎則進(jìn)行少劑量補(bǔ)打，并持續(xù)監(jiān)測(cè)兔子呼吸及心跳。麻醉成功后將兔的四肢及頭部固定于兔固定器，并予備皮，常規(guī)消毒鋪巾。無(wú)菌條件下，在股動(dòng)脈搏動(dòng)最明顯處，沿股動(dòng)脈走行方向切開皮膚及皮下組織，鈍性分離股總、股深、股淺動(dòng)脈。于股深動(dòng)脈血管壁逆行穿刺，引入導(dǎo)絲，逆行插入球囊導(dǎo)管至股總動(dòng)脈水平，插入深度為2～5 cm，應(yīng)用壓力泵（壓力為～6 atm）擴(kuò)張球囊，回拉球囊約1 cm 左右，將球囊送至原位，反復(fù)4～5 次，確保股總動(dòng)脈內(nèi)膜拉傷。自股深動(dòng)脈退出球囊導(dǎo)絲后，股深動(dòng)脈結(jié)扎止血，依次縫合切口，再用慶大霉素注射液沖洗傷口以預(yù)防感染，最后用紗布包扎傷口。術(shù)后連續(xù)3 天每天傷口予涂紅霉素軟膏并紗塊包扎以保持傷口潔凈。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，各時(shí)間點(diǎn)之間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA）。

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病兔模型建立的效果

16只兔參與建模，成功率87.5%。給與四氧嘧啶藥劑后兔子出現(xiàn)精神懶散，動(dòng)作遲鈍，其中2 只第2 天出現(xiàn)低血糖現(xiàn)象，精神萎靡，四肢無(wú)力，拒絕進(jìn)食進(jìn)水，測(cè)血糖血糖儀顯示為low（血糖值低至測(cè)不出），予10%葡萄糖耳緣靜脈注射20 mL 后兔子狀態(tài)逐漸恢復(fù)，并可以主動(dòng)進(jìn)食進(jìn)水，2 h 后復(fù)測(cè)血糖分別為5.2 mmol/L 及7.5 mmol/L，之后所有對(duì)照組及模型組的兔子藥物靜脈注射3d 后血糖大于13.5 mmol/L，有的出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀。股動(dòng)脈血管狹窄模型制作時(shí)給予戊巴比妥鈉麻醉時(shí)有1 只體重較輕的兔子出現(xiàn)心臟、呼吸驟停而死亡，另有1 只兔子在造模完成后2 天后出現(xiàn)不明原因死亡。其他股動(dòng)脈球囊拉傷的兔子精神和飲食狀況皆可。給藥后4 周各組體重及血糖變化：進(jìn)入實(shí)驗(yàn)前，組兔子的體重及血糖均無(wú)明顯差異（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，空白組的體重較前顯著上升，對(duì)比造模組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.2 實(shí)驗(yàn)兔病理形態(tài)學(xué)觀察

模型組家兔動(dòng)脈表面形態(tài)凹凸不平，邊緣不齊，血管顏色呈淡黃色，彈性最差，血管中間區(qū)域可見明顯增粗區(qū)域，管腔內(nèi)膜有明顯大小不等的突起于內(nèi)膜表面的黃白色脂質(zhì)條紋及隆起脂質(zhì)斑塊形成；解剖可見肝臟為明顯的脂肪肝改變（如圖1a）；兔子眼睛晶狀體出現(xiàn)渾濁（如圖1b）。HE病理提示：空白組血管未見異常（如圖1d），油紅染色提示陰性；中藥組病理顯示所示：動(dòng)脈內(nèi)壁環(huán)狀增厚，有泡沫細(xì)胞小灶性聚集（如圖1e）；對(duì)照組顯示動(dòng)脈粥樣化病變，鏡下可見粥樣斑塊，內(nèi)膜、中膜有大量泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積，約75%血管管腔堵塞（如圖1f），油紅染色提示陽(yáng)性（如圖1c）。

2.3 三芪丹顆粒對(duì)對(duì)血糖、血脂指標(biāo)的影響

與空白組相比，對(duì)照組FBG、TC、TG、LDL-C 含有量均顯著升高（P＜0.01），HDL-C 含有量顯著降低（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，中藥組FBG、TG、LDL-C均有降低（P＜0.05），HDL-C 含有量升高（P＜0.05）。具體見表1。

2.4 三芪丹顆粒對(duì)炎癥相關(guān)因子的影響

圖1 實(shí)驗(yàn)兔病理形態(tài)學(xué)觀察

表1 三芪丹顆粒對(duì)對(duì)血糖、血脂指標(biāo)的影響（±s，mmol/L）

表1 三芪丹顆粒對(duì)對(duì)血糖、血脂指標(biāo)的影響（±s，mmol/L）

組別空白組對(duì)照組中藥組n 4 7 7 FBG 5.85±0.75 19.03±0.47 18.24±0.62 TC 7.03±0.74 14.14±0.72 13.11±1.07 TG 1.48±0.45 8.40±0.57 7.5±0.79 LDL-C 1.30±0.25 4.24±0.35 3.59±0.63 HDL-C 3.54±0.41 1.63±0.29 2.02±0.28

與空白組比較，對(duì)照組hs-CRP、IL-6、TNF-α、ET 含有量均顯著升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，中藥組hs-CRP、IL-6、TNF-α、ET 含有量降低（P＜0.05），具體見表2。

表2 三芪丹顆粒對(duì)炎癥相關(guān)因子的影響（x±s）

3 討 論

近年來(lái)，血管內(nèi)球囊擴(kuò)張術(shù)治療因其創(chuàng)傷小、可迅速改善癥狀、不需要開放性手術(shù)等優(yōu)點(diǎn)成為治療糖尿病下肢動(dòng)脈狹窄的主要治療手段［5］，然而術(shù)后內(nèi)膜自愈可引發(fā)再狹窄，且術(shù)后狹窄率高達(dá)30%［6］。血管彈性回縮、血栓形成、炎癥因子的過(guò)度表達(dá)、血管平滑肌增殖等被認(rèn)為是導(dǎo)致血管內(nèi)膜損傷后病理性重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7］。其中，炎癥反應(yīng)及血管平滑肌過(guò)度增殖在其發(fā)病過(guò)程中起著極其重要的作用。hs-CRP、ET、IL-6、TNF-a 等炎癥因子的增加可引起局部炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致球囊擴(kuò)張后血管內(nèi)膜過(guò)度修復(fù)，最終形成血管狹窄［8，9］。與此同時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致的內(nèi)膜增生也被認(rèn)為是血管病理性重構(gòu)的主要細(xì)胞學(xué)因素［10，11］。因此，抑制炎性細(xì)胞因子和平滑肌過(guò)度增殖是改善球囊擴(kuò)張術(shù)后再狹窄的一種新的治療方法［12］。

我院汪何教授結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論及臨床多年經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為糖尿病患者多病程長(zhǎng)、才易并發(fā)血管病變，故其發(fā)病機(jī)制多為氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)的虛實(shí)夾雜之證。因此補(bǔ)氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)是治療糖尿病下肢病變的關(guān)鍵，通過(guò)中醫(yī)辨證施治，從整體上改善局部微循環(huán)，起到緩解疼痛、預(yù)防介入后再閉塞的作用。由此思想為基礎(chǔ)，汪何教授創(chuàng)制三芪丹顆粒應(yīng)用于臨床，有著良好的臨床療效。方中黃芪為君藥，既是補(bǔ)氣生血要藥，又能活血，對(duì)氣虛血瘀者能標(biāo)本兼治；三七為臣藥，具有活血化瘀，散瘀止血之功效；桑葚能滋陰潤(rùn)燥，丹參能活血化瘀，排膿止痛，具與為佐藥。諸藥合用，具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀功效。因此該方用于2 型糖尿病下肢血管病變治療時(shí)可與血管介入球囊擴(kuò)張方式聯(lián)合應(yīng)用，則可發(fā)揮協(xié)同作用，在減輕球囊擴(kuò)張后再狹窄的同時(shí)可以改善臨床不良癥狀。

本次的實(shí)驗(yàn)研究表明，三芪丹顆粒能有效地改善血糖、血脂等相關(guān)指標(biāo)和Y 抑制炎癥因子的生成，同時(shí)減輕了因球囊擴(kuò)張?jiān)斐傻膬?nèi)膜增殖和管腔狹窄，逆轉(zhuǎn)了球囊擴(kuò)張引起的股動(dòng)脈組織的病理性損害，從而改善血管介入球囊擴(kuò)張后再狹窄的生理狀態(tài)。綜上所述，表明該方對(duì)糖尿病有一定治療作用，并可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生并減少糖脂代謝紊亂，同時(shí)抑制血管內(nèi)膜的過(guò)度增生，最終達(dá)到改善糖尿病下肢動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)后再狹窄的發(fā)生率。