鄧時(shí)銘 ，劉麗 ，吳浩 ，陳湘藝 ，鄒利 ，蔣國(guó)民 ，王冬武 ，2

（1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410153；2.水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與品質(zhì)調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410003）

我國(guó)是世界上稻魚養(yǎng)殖生產(chǎn)規(guī)模最大的國(guó)家[1]，已有20 多個(gè)省、自治區(qū)、直轄市開展[2-3]，養(yǎng)殖面積達(dá)231 萬(wàn)hm2[4]。為了能更好地滿足人民生活高質(zhì)量要求，實(shí)現(xiàn)稻田養(yǎng)殖可持續(xù)健康地發(fā)展，我國(guó)張啟發(fā)院士提出“雙水雙綠”理念，做強(qiáng)水稻、水產(chǎn)“雙水”產(chǎn)業(yè)，做優(yōu)綠色稻米、綠色水產(chǎn)等“雙綠”產(chǎn)品[5]。目前我國(guó)稻漁綜合種養(yǎng)模式主要有：稻-蝦、稻-魚、稻-蛙、稻-鰍等共作、輪作或連作模式，主要進(jìn)行了養(yǎng)殖品種與養(yǎng)殖模式的探究[6-7]、生態(tài)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的支出與效益分析[8-10]、漁米產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)[11-13]等研究。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稻魚綜合種養(yǎng)模式可增加土壤肥力[14-15]，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和循環(huán)[16]，產(chǎn)生了較高的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。而稻龜綜合種養(yǎng)模式研究較少，研究的內(nèi)容也較為簡(jiǎn)單[17-18]，對(duì)稻田生態(tài)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)與利用還未見報(bào)道。

磷是動(dòng)植物生長(zhǎng)、發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，也是細(xì)胞內(nèi)一切生物化學(xué)作用的能量來源。在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易于沉積并在底泥中富集[16]，有機(jī)磷和不溶性磷較難被植物吸收，利用率不高[19]，有效性低，從而使得磷成為稻田土壤中限制性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[20]和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力重要的制約因素之一[15]。該論文按照不同的養(yǎng)殖密度進(jìn)行稻龜綜合種養(yǎng)，不施肥，只投餌。烏龜從飼料中吸收磷營(yíng)養(yǎng)，滿足生長(zhǎng)發(fā)育需求，水稻利用根系吸收底泥有效磷。通過檢測(cè)分析稻田土壤理化性質(zhì)、不同形態(tài)磷營(yíng)養(yǎng)含量及微生物組成與分布等，比較分析其差異性及相關(guān)性，研究稻田磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與利用情況，探索最佳稻田養(yǎng)龜綜合種養(yǎng)模式，以期為綠色稻龜養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中華草龜購(gòu)于湖南呈寶龜類繁養(yǎng)有限公司，為同一批次人工孵化苗，規(guī)格一致，為35～40 g/只。水稻為湖南省水稻研究所提供，試驗(yàn)桶為塑料圓桶，體積約為3 m3，稻田土壤為池塘淤泥和體表土壤混合物，pH 值為 6.50 左右。

1.2 試驗(yàn)方法

設(shè)12 個(gè)試驗(yàn)桶。3 個(gè)為對(duì)照組（control group 簡(jiǎn)稱CG），不放龜，只種稻。另9 個(gè)試驗(yàn)桶為稻龜綜合種養(yǎng)組（rice-tortoise 簡(jiǎn)稱 RT），分設(shè) 3 個(gè)梯度：即2.7 只/m2（rice-tortoise one 簡(jiǎn)稱RT1）、3.3 只/m2（rice-tortoise two 簡(jiǎn)稱 RT2） 和 3.9 只/m2（rice-tortoise three 簡(jiǎn)稱RT3）放養(yǎng)密度，每個(gè)梯度3 個(gè)試驗(yàn)桶，置于室外養(yǎng)殖。

水稻根系主要分布在0～20 cm 土層[21]，試驗(yàn)桶內(nèi)鋪設(shè)20 cm 厚土壤，加水，插稻，待禾苗返青后將室外暫養(yǎng)10 d 的中華草龜隨機(jī)分組放入。第3 天開始投喂含磷92.61 mg/kg 顆粒浮性餌料，日投餌量為龜總體質(zhì)量的3%，分2 次投，投喂1 h 后清除殘餌，養(yǎng)殖周期為11 周。試驗(yàn)期間，12 個(gè)試驗(yàn)桶管理模式一致，不施肥，不撒藥。

1.3 采樣與處理

鑒于沉積物5 cm 磷含量和細(xì)菌多樣性最具有代表性[22]，分別在試驗(yàn)第 1 天、第 34 天、第 54 天和第74 天，也就是禾苗的返青期（Turning green stage,TS）、拔節(jié)孕穗期（Jointing-booting stage, JS）、灌漿期（Filling stage, FS）和成熟期（Mature stage, MS），無(wú)菌條件采集表層5 cm 厚土壤。每個(gè)試驗(yàn)桶設(shè)3 個(gè)采樣點(diǎn),混勻?yàn)橐粋€(gè)樣[23]，微生物檢測(cè)樣無(wú)菌4 ℃保存，1 d 內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.4 土壤磷營(yíng)養(yǎng)及微生物的測(cè)定

1.4.1 土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的測(cè)定 按照NY/T 88、NY/T 1121.7 和NY/T 1121.6 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行土壤總磷、有效磷和有機(jī)質(zhì)的檢測(cè)分析，采用歐盟推薦SMT 法[24-25]進(jìn)行土壤無(wú)機(jī)磷的測(cè)定。

1.4.2 微生物培養(yǎng)及計(jì)數(shù)方法 參考李翠[22]方法進(jìn)行土壤無(wú)機(jī)磷細(xì)菌、有機(jī)磷細(xì)菌和厭氧菌[26]的計(jì)數(shù)分析，采用李振高等[27]方法進(jìn)行亞硝化細(xì)菌計(jì)數(shù)，細(xì)菌總數(shù)和硝化細(xì)菌分別用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[28]、改良的斯蒂芬遜培養(yǎng)基 B 計(jì)數(shù)[29]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（`X±SD）表示，用軟件 SPSS23.0 進(jìn)行單因素分析，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）時(shí)，則用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻田土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化

土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化如圖1 所示，對(duì)照組（CG）土壤表層有機(jī)質(zhì)含量變化不顯著，稻龜組（RT）降幅大，灌漿期達(dá)最低，其后逐步增加，RT2 和RT3 組降幅極顯著地高于RT1（P＜0.01）。對(duì)照組（CG）土壤表層總磷隨著水稻生長(zhǎng)而逐步降低，成熟期達(dá)最低，降幅較為緩慢。稻龜RT1 組土壤總磷先增加，其后逐步降低，而稻龜RT2 和RT3 土壤總磷先降低，在灌漿期達(dá)最低值，降幅大，隨后逐步增加。所有試驗(yàn)田土壤有效磷含量隨著水稻的生長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，其降幅組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＞0.05），但成熟期，稻龜組（RT）土壤有效磷含量極顯著高于稻田組（P＜0.01），RT2 組達(dá)最高，其次是 RT1 組和 RT3 組。

圖1 稻田土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化趨勢(shì)圖

2.2 稻田土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)性

根據(jù)土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行相關(guān)性和顯著性分析發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組（CG）土壤總磷與有機(jī)質(zhì)、無(wú)機(jī)磷和有效磷相關(guān)系數(shù)＜0.70，無(wú)顯著強(qiáng)相關(guān)性（P＞0.05）。稻龜組（RT）土壤總磷與有機(jī)質(zhì)的相關(guān)系數(shù)＞0.90（表1），兩者呈極顯著直線正相關(guān)（P＜0.01，R2= 0.8852）（圖2）；土壤總磷與無(wú)機(jī)磷的相關(guān)系數(shù)，隨著中華草龜養(yǎng)殖密度的增加而逐步增大，相關(guān)性增強(qiáng)，但無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05，R2=0.1683）；而土壤總磷與有效磷的相關(guān)系數(shù)，在中華草龜養(yǎng)殖密度為2.7～3.3 只/m2時(shí)，隨著養(yǎng)殖密度的增加而變大，相關(guān)性增強(qiáng)，3.3～3.9 只/m2時(shí)逐步下降，兩者相關(guān)性達(dá)顯著水平（0.01＜P＜0.05，R2=0.3335）。因此，根據(jù)稻龜組（RT）土壤總磷與有機(jī)質(zhì)、有效磷的相關(guān)性，擬合回歸模型方程為Y=0.029928X1+14.75773X2-0.03891（Y 為總磷 g·kg-1，X1為有機(jī)質(zhì) g·kg-1，X2為有效磷 g·kg-1）。

表1 土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)系數(shù)

圖2 土壤總磷與有機(jī)質(zhì)、無(wú)機(jī)磷和有效磷的相關(guān)性

2.3 稻田土壤微生物種類、數(shù)量及相關(guān)性

隨著禾苗的生長(zhǎng)，稻龜組（RT）土壤微生物總量不斷增加，到水稻成熟期達(dá)最大值，對(duì)照組（CG）灌漿期達(dá)最大值，其后降低。稻龜組（RT）微生物總量增速非常明顯，從灌漿期開始極顯著地高于稻田組（CG）（P＜0.01），稻龜組間差異也顯著（P＜0.01），以RT1 組增速最快，微生物總量最高，其次是RT3 和RT2 組，具體見圖3。

圖3 禾苗不同生長(zhǎng)期土壤細(xì)菌總數(shù)變化

稻田土壤微生物有厭氧菌、有機(jī)磷菌、無(wú)機(jī)磷菌、硝化細(xì)菌和亞硝化菌等種類，厭氧菌含量低，并隨禾苗的生長(zhǎng)，稻龜RT1 和RT2 組極顯著下降，待禾苗成熟期時(shí)才略有上升，對(duì)照組（CG）則逐步增加，而稻龜RT3 組先增加，灌漿期下降，隨后成熟期上升。到水稻成熟期時(shí)，各試驗(yàn)組土壤厭氧菌含量差異不明顯，具體見表2。

在禾苗生長(zhǎng)過程中，稻龜RT1 和RT2 組土壤有機(jī)磷菌和無(wú)機(jī)磷菌含量逐步上升，亞硝化菌含量始終高于硝化菌含量，對(duì)照組（CG）和稻龜RT3 組有機(jī)磷菌含量呈下降趨勢(shì)，硝化菌含量呈逐步上升趨勢(shì)，具體見圖4。

2.4 稻田土壤微生物與磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的相關(guān)性

將試驗(yàn)田土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量與微生物數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組（CG）土壤總磷和有效磷分別與厭氧菌和硝化菌數(shù)量的相關(guān)系數(shù)（|r|＞0.9）呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與有機(jī)磷菌和無(wú)機(jī)磷菌呈顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而稻龜組（RT）的負(fù)相關(guān)性明顯減弱；對(duì)照組和稻龜組土壤有機(jī)質(zhì)和無(wú)機(jī)磷含量與厭氧菌、有機(jī)磷菌、無(wú)機(jī)磷菌等微生物數(shù)量相關(guān)系數(shù)（|r|＜0.7）無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），具體見表3。

表2 土壤厭氧菌含量 %

表3 微生物數(shù)量與磷營(yíng)養(yǎng)含量相關(guān)性

圖4 土壤微生物含量變化

3 討論

3.1 稻田養(yǎng)龜肥效分析

禾苗在生長(zhǎng)過程中一直都從土壤吸收營(yíng)養(yǎng)，但隨著禾苗的生長(zhǎng)，水稻根系吸收土壤營(yíng)養(yǎng)越來越強(qiáng)，到抽穗灌漿期達(dá)高峰，其后營(yíng)養(yǎng)吸收量開始下降[30]。因此，對(duì)照組（CG）土壤總磷、有效磷和有機(jī)質(zhì)一直呈下降趨勢(shì)，成熟期達(dá)最低，而稻龜綜合種養(yǎng)田（RT）灌漿期達(dá)最低。這是因?yàn)榈君旔B(yǎng)殖，投喂飼料，增加水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)水稻根系吸收能力降低時(shí)，稻田土壤總磷、有效磷和有機(jī)質(zhì)出現(xiàn)積累，使得磷營(yíng)養(yǎng)增加。也就表明，稻龜綜合種養(yǎng)模式能明顯增加稻田土壤磷肥。

稻田土壤有效磷降幅在一定程度上反映出水稻根系對(duì)有效磷的吸收量，對(duì)照組（CG）和稻龜組（RT）有效磷濃度的降幅差異不明顯，表明水稻根系吸收磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)總量差異不大，但到水稻成熟期后，稻龜組（RT）土壤有效磷濃度極顯著地高于對(duì)照組（CG），且稻龜組（RT）有機(jī)質(zhì)降幅極顯著地高于對(duì)照組（CG）。這說明中華草龜?shù)耐段古c活動(dòng)，加快了稻田土壤有機(jī)質(zhì)的循環(huán)與利用，提高了稻田土壤的磷肥力，使得土壤肥效強(qiáng)且持久，以RT2 組為最佳模式，土壤總磷含量與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈極顯著直線正相關(guān)，土壤有效磷與總磷呈顯著直線正相關(guān)。

3.2 稻田微生物總量、菌落結(jié)構(gòu)與活性

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分[31]，不但影響著土壤正常的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化，而且影響著土壤的肥力[32]，是體現(xiàn)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[33]。稻田養(yǎng)殖中華草龜后，不但顯著地增加土壤表層微生物總量，而且隨著禾苗的生長(zhǎng)，水稻根系吸氧能力的提升[34]，對(duì)照組（CG）土壤厭氧狀態(tài)越來越嚴(yán)重，厭氧菌含量逐步增加，而稻龜組（RT）土壤厭氧菌含量則大大降低，亞硝化菌含量增加，扭轉(zhuǎn)了有機(jī)磷菌的變化趨勢(shì)，極明顯地改變了土壤微生物菌落的分布與豐度。這可能是由于中華草龜?shù)娜粘；顒?dòng)，加強(qiáng)了對(duì)土壤表層的攪拌，提升了土壤表層含氧量，抑制了厭氧菌的繁殖，促進(jìn)了好氧的亞硝化菌和兼性厭氧的有機(jī)磷菌和無(wú)機(jī)磷菌的生長(zhǎng)，加強(qiáng)了土壤硝化作用[35]和磷循環(huán)，增強(qiáng)了土壤養(yǎng)分供應(yīng)能力。

中華草龜生長(zhǎng)速度慢，吸收能力差，排泄物肥力足，極易污染環(huán)境。稻田養(yǎng)殖中華草龜，不但充分利用了烏龜排泄物肥料，減少污染，而且還促進(jìn)土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放與利用，提高稻田土壤的肥力。