劉佑杰，王啟化，陳 晨，趙震宇,，王 博

(1. 海南大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，海南 ?？?570228； 2. 山東科技大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266510；3. 單縣園藝社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，山東 菏澤 274300； 4. 海南健康職業(yè)技術(shù)管理學(xué)院，海南 澄邁 571900)

膠網(wǎng)藻(Dictyosphaeriumsp.)屬于綠藻門(mén)膠網(wǎng)藻屬，現(xiàn)已證實(shí)其具有生長(zhǎng)速度快、高生物量、高油脂含量、高生物活性物質(zhì)含量等特點(diǎn)[1-2]；此外，微藻生物油脂也已被證實(shí)可用于替代不可再生的化石燃料[3]．然而，高密度化和高油脂富集培養(yǎng)始終是制約微藻產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步商業(yè)化的重大因素，因此為了實(shí)現(xiàn)微藻產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步的發(fā)展和踐行清潔高效能源政策，本研究對(duì)膠網(wǎng)藻的高密度高油脂培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化．

1 材料與方法

1.1 微藻的初培養(yǎng)、收獲及生物量(油脂)測(cè)定膠網(wǎng)藻分離純化自海南省?？谑械牡?N 20°02′45.97″, E 110°11′438.39″)，并被儲(chǔ)存在BG-11的培養(yǎng)基中[4]．膠網(wǎng)藻培養(yǎng)的初始接種量為φ(膠網(wǎng)藻)=10%．首先將膠網(wǎng)藻培養(yǎng)在3.2 L的發(fā)酵罐中(INFORS，Labfors，瑞士)，然后進(jìn)行室內(nèi)單因素和響應(yīng)面的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)．隔菌：以0.25 μm的特氟龍透氣膜通過(guò)空氣；戶外培養(yǎng)：將初級(jí)培養(yǎng)的藻液轉(zhuǎn)移至40 L柱形光生物反應(yīng)器中進(jìn)行中級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)；膠網(wǎng)藻的最終中試擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：將逐級(jí)擴(kuò)大的藻液轉(zhuǎn)移至戶外800 L的管道式光照反應(yīng)器中．膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)狀況是通過(guò)測(cè)定680 nm下的光密度值(OD680)來(lái)進(jìn)行監(jiān)控．培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心收獲(8 000 r·min-1，2 min)微藻，并使用去離子水清洗3次以去除無(wú)機(jī)鹽，接著使用冷凍干燥機(jī)干燥(Scientz 10N，寧波)所獲得的藻泥，并將其儲(chǔ)存在- 40 ℃的冰箱中．所得生物量計(jì)算如下：

其中，Pbiomass是生物量；M是冷凍干燥后的微藻質(zhì)量(g)；V是培養(yǎng)基的體積(L)．

微藻油脂的提?。和ㄟ^(guò)V三氧化烷∶V甲烷=2∶1法來(lái)提取微藻油脂[4]，總油脂含量(TLC)和總油脂產(chǎn)量(TLY)的計(jì)算如下：

TLY=TLC×Pbiomass，

其中，ML為微藻油脂的總重(g)．

1.2 光照強(qiáng)度影響的實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用BG-11培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)．將膠網(wǎng)藻置于發(fā)酵罐中，分別使其在光照強(qiáng)度為0，54，90，180，360，540 μmol/(s·m2)條件下培養(yǎng)，控制通氣量為60 L/h，初始pH值為7.0±0.1，培養(yǎng)溫度為27 ℃和培養(yǎng)周期為7 d．最后經(jīng)離心、冷凍、干燥后收獲，并測(cè)定生物量、油脂含量和產(chǎn)量．

1.3 碳源影響的實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)是在原BG-11培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行的優(yōu)化，除碳源以外，其他成分的濃度均保持不變，分別使用Na2CO3和NaHCO3作為唯一碳源，并保證其中碳元素的摩爾濃度相同(0.189 mmol/L)；此外，保持以下條件：通氣量為60 L/h，初始pH值為7.0±0.1，培養(yǎng)溫度為27 ℃，光照強(qiáng)度為180 μmol/(s·m2)，培養(yǎng)周期為7 d．最后，經(jīng)離心、冷凍、干燥后收獲，并測(cè)定生物量、油脂含量和產(chǎn)量．

1.4 氮源影響的實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)是在原BG-11培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行的優(yōu)化，除氮源以外，其他成分的濃度均保持不變，分別使用NaNO3、甘氨酸和尿素作為唯一氮源，并保證其中氮元素的摩爾濃度相同(17.65 mmol/L)，同時(shí)，保持以下條件：通氣量為60 L/h，初始pH值為7.0±0.1，培養(yǎng)溫度為27 ℃，光照強(qiáng)度為180 μmol/(s·m2).培養(yǎng)周期為7 d．最后，經(jīng)離心、冷凍、干燥后收獲，并測(cè)定生物量、油脂含量和產(chǎn)量．

1.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)1.3和1.4的結(jié)果對(duì)BG-11培養(yǎng)基建立4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)．獨(dú)立因素分別為：碳源濃度(X1，mmol/L)、氮源濃度(X2，mmol/L)、磷源濃度(K2HPO4，X3，g/L)和通氣量(X4，L/h)．表1顯示了編碼的水平和獨(dú)立因素．響應(yīng)值總生物量(TB,Y1)、總油脂含量(TLC,Y2)和總油脂產(chǎn)量(TLY,Y3)是使用多項(xiàng)式回歸方程來(lái)表示：

表1 4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

其中，Y是響應(yīng)值;α0是截距;αi，αii，αij分別表示線性、二次和交互回歸系數(shù);Xi和Xj表示編碼的獨(dú)立因素;k是獨(dú)立因素個(gè)數(shù).

1.6 戶外中試培養(yǎng)利用800 L管道式生物反應(yīng)器和優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)膠網(wǎng)藻進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并對(duì)比一次性加料和分批加料對(duì)微藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響．即一組按照BG-11培養(yǎng)基組分一次性加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(一次性加料)，另一組則是將BG-11培養(yǎng)基組分均分成三等分，每2天補(bǔ)充一次營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(分批加料)．此外，利用遮陽(yáng)布和灑水方式，分別將光照強(qiáng)度和溫度控制在360 μmol(s·m2)和25～28 ℃，初始pH值控制在7.0±0.1，培養(yǎng)周期控制在7 d．最后，經(jīng)離心、冷凍、干燥后收獲，測(cè)定生物量、油脂含量和產(chǎn)量．

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析所有實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3遍，并采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行顯著性分析；響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)則采用Design-Expert 7.0進(jìn)行設(shè)計(jì)．

2 結(jié)果與分析

2.1 光照強(qiáng)度影響的分析圖1展示了光照強(qiáng)度對(duì)膠網(wǎng)藻生長(zhǎng)狀況的影響，膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)在不同光照強(qiáng)度下展現(xiàn)出顯著差異，當(dāng)無(wú)光照時(shí)，膠網(wǎng)藻幾乎停止生長(zhǎng)，表明膠網(wǎng)藻不適應(yīng)異養(yǎng)生長(zhǎng)；隨著光照強(qiáng)度的增加，膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)逐漸改善，在360 μmol/(s·m2)時(shí)達(dá)到最佳，進(jìn)一步增加光照強(qiáng)度則會(huì)造成膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)受到抑制．同樣如表2所示，膠網(wǎng)藻的生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量也在光照強(qiáng)度為360 μmol/(s·m2)時(shí)達(dá)到最高，且在180 μmol/(s·m2)和360 μmol/(s·m2)之間無(wú)顯著差異(P<0.05)．雖然光照強(qiáng)度在一定程度的增加會(huì)有助于生物量、油脂產(chǎn)率和油脂產(chǎn)量的提高，但是過(guò)高的光強(qiáng)則有可能破壞微藻油脂的產(chǎn)生和光合作用系統(tǒng)，因此，隨著生物量的下降，油脂產(chǎn)率和油脂產(chǎn)量也下降．在光缺乏條件下，光照不能為光合作用提供足夠的能量，如此會(huì)導(dǎo)致甘油三酯(主要包括中性脂肪)的積累下降；另外，由此弱光無(wú)法透過(guò)高密度微藻細(xì)胞所產(chǎn)生的黑色區(qū)域，因而會(huì)導(dǎo)致在光照生物反應(yīng)器中微藻細(xì)胞對(duì)光的利用率不足[5]．因此，360 μmol/(s·m2)的光照強(qiáng)度被用于后續(xù)室外擴(kuò)大培養(yǎng)的研究中．

圖1 不同光照強(qiáng)度下膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)狀況

表2 光照強(qiáng)度對(duì)膠網(wǎng)藻生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量的影響

圖2 不同碳源下膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)狀況

表3 不同碳源對(duì)膠網(wǎng)藻生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量的影響

2.3 氮源因素影響的分析由圖3所示，使用NaNO3和尿素作為氮源時(shí)，膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)狀況相似，但是，當(dāng)使用甘氨酸時(shí)，膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)得到了顯著的改善，并且，尿素和甘氨酸組持續(xù)生長(zhǎng)，而NaNO3組在第6天就達(dá)到了平穩(wěn)期．此外，在三組中甘氨酸組的生長(zhǎng)最快，這些結(jié)果表明：甘氨酸和尿素可以明顯地延長(zhǎng)指數(shù)增長(zhǎng)期，并提高膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)速率．由表4可知，使用甘氨酸作為氮源時(shí)，生物量和油脂含量均得到提高，其中，以甘氨酸為氮源時(shí)其生物量最高[(1.64±0.08) g/L]，NaNO3的生物量最低[(1.47±0.04) g/L]，而油脂含量在三組中并沒(méi)有明顯的不同．結(jié)果表明：不同氮源對(duì)膠網(wǎng)藻的油脂含量沒(méi)有明顯的影響，但是卻對(duì)生物量和油脂產(chǎn)量有較大的影響，究其原因可能是：不同種類(lèi)的氮源對(duì)于不同微藻的生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量的影響也不相同．通常微藻對(duì)不同形式的氮利用率為：氨氮>硝態(tài)氮>亞硝態(tài)氮，而無(wú)機(jī)氨態(tài)氮可以通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用直接合成氨基酸，經(jīng)過(guò)脫氨作用后培養(yǎng)基的pH會(huì)急劇地下降，從而導(dǎo)致微藻生物量和油脂總量下降．相比之下，尿素和NaNO3可以明顯地提高微藻的生物量和油脂總量，因此它們是大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中被普遍應(yīng)用的氮源，然而，NaNO3的低毒性和強(qiáng)氧化性有可能會(huì)導(dǎo)致一些微藻的氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷，因此其不利于微藻的培養(yǎng)．由于尿素的水解產(chǎn)物主要為有機(jī)態(tài)氨氮，其與無(wú)機(jī)態(tài)氨氮相比含有更多的氨，其一部分被用于合成氨基酸，而另一部分則被轉(zhuǎn)變?yōu)榘睔?，故?dǎo)致了培養(yǎng)基的pH上升．與尿素和NaNO3相比，甘氨酸是一種無(wú)毒的非必需氨基酸，它不僅可以提供足夠的氮，而且還可以參與三羧酸循環(huán)(TCA)．三羧酸循環(huán)幾乎是在每一種好氧生物中普遍存在的代謝途徑，也是碳水化合物、脂肪、氨基酸等合成的樞紐和最終代謝途徑．首先，甘氨酸可以與甲酰四氫葉酸合成絲氨酸，然后，絲氨酸在絲氨酸脫水酶的作用下脫水脫氫，轉(zhuǎn)化為丙酮酸而直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)．此外，甘氨酸(具抗氧化能力)可以有效地清除活性氧，從而保證微藻的正常生理活動(dòng)，并降低微藻代謝廢物所帶來(lái)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[6-8]．因此甘氨酸被用于后續(xù)BG-11培養(yǎng)基的優(yōu)化．?dāng)M合方程R2值(0.911 9>0.9)表明擬合度良好，K2HPO4含量和通氣量在模型中分別表現(xiàn)出顯著和極顯著影響，這說(shuō)明二者相比于碳源和氮源更能夠決定最終膠網(wǎng)藻的油脂產(chǎn)量．

圖3 膠網(wǎng)藻在不同氮源下的生長(zhǎng)曲線

表4 不同碳源對(duì)膠網(wǎng)藻生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考慮到微藻油脂的高附加值，因此本次優(yōu)化主要針對(duì)膠網(wǎng)藻的最終油脂產(chǎn)量．由表5所示，該模型極顯著(P<0.001)，說(shuō)明該模型中的變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系顯著，因而該模型的置信度高．失擬項(xiàng)P值(0.608 8)>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合的情況良好．根據(jù)回歸方程及模型ANOVA分析結(jié)果，繪制了兩因子效果圖(圖4)．4個(gè)獨(dú)立因素兩兩交互關(guān)系均呈現(xiàn)出拋物線趨勢(shì)，并存在一個(gè)極大值點(diǎn)．通過(guò)響應(yīng)面分析，最終得到如下預(yù)測(cè)結(jié)果：NaHCO30.19 mmol/L、甘氨酸14.86 mmol/L、K2HPO40.1 g/L和通氣量9.8 L/h(達(dá)到最大油脂產(chǎn)量0.74 g/L)．為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在發(fā)酵罐中使用了優(yōu)化后的條件來(lái)培養(yǎng)膠網(wǎng)藻，并進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，最終得到的油脂產(chǎn)量為(1.02±0.03)g·L-1．真實(shí)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果接近，表明模型的置信度高．

圖4 膠網(wǎng)藻油脂產(chǎn)量響應(yīng)面影響因子的交互關(guān)系3D圖

表5 膠網(wǎng)藻油脂產(chǎn)量的多元二次多項(xiàng)式模型及ANOVA分析

2.5 戶外中試培養(yǎng)及加量方式分析戶外800 L管道培養(yǎng)中，使用了優(yōu)化后的培養(yǎng)基，并以其用于探究不同加料方式對(duì)膠網(wǎng)藻生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量的影響，同時(shí)與原BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行了對(duì)比(光照控制在360/[μmol/(s·m2)]．如圖5所示，在最初兩天，一次性加料和分批加料后其生長(zhǎng)情況沒(méi)有明顯不同，只是一次性加料的生長(zhǎng)速率略高于分批加料的生長(zhǎng)速率，但兩天后分批加料比一次性加料的生長(zhǎng)速率高，這可能是由于最初兩天一次性加料的營(yíng)養(yǎng)元素濃度高于分批加料的營(yíng)養(yǎng)元素濃度的緣故.但隨著時(shí)間的推移，由于多余的營(yíng)養(yǎng)元素會(huì)使水體富營(yíng)養(yǎng)化，從而導(dǎo)致雜菌的滋生，富集的菌種在后期的培養(yǎng)中會(huì)與微藻產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，進(jìn)而導(dǎo)致微藻的生長(zhǎng)受到抑制．此外，過(guò)營(yíng)養(yǎng)化還可能引起微藻的沉淀，增大微藻收獲的難度[8-10]．在一次性加料的培養(yǎng)基和原始BG-11培養(yǎng)基的培養(yǎng)中，膠網(wǎng)藻在第四天達(dá)到平穩(wěn)期，而在分批加料的培養(yǎng)基中其在指數(shù)生長(zhǎng)期仍未達(dá)到平穩(wěn)期．在整個(gè)生長(zhǎng)階段，原始BG-11培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線始終處于一次性加料和分批加料培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線之下，這說(shuō)明優(yōu)化后的培養(yǎng)條件在室外條件下仍然適用．如表6所示，使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，膠網(wǎng)藻的生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量全部顯著地提高．在不同加料方式的培養(yǎng)中，生物量、油脂產(chǎn)率和油脂產(chǎn)量也存在著較為明顯的差異(P<0.05)，采用分批加料方式后，生物量、油脂產(chǎn)率和油脂產(chǎn)量相較于原始BG-11培養(yǎng)基分別提高了65.17%，22.02%和108.00 %，綜上所述，分批加料更適合膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)．通過(guò)對(duì)比室內(nèi)發(fā)酵罐的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，于戶外培養(yǎng)，其油脂產(chǎn)量降低，其原因?yàn)椋河趹敉馍L(zhǎng)無(wú)法保證密閉生長(zhǎng)，且培養(yǎng)基無(wú)法進(jìn)行無(wú)菌處理；此外，戶外環(huán)境多變，難以精確控制，這也造成了微藻最終油脂產(chǎn)量的降低[11-12]．

圖5 不同加料方式對(duì)膠網(wǎng)藻生長(zhǎng)狀況的影響

表6 不同加料方式對(duì)膠網(wǎng)藻生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量的影響

3 結(jié) 論

本研究對(duì)膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)條件和培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，并發(fā)現(xiàn)碳酸氫鈉和甘氨酸是最佳的碳源和氮源．采用油脂產(chǎn)量作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)最終確定膠網(wǎng)藻的最佳培養(yǎng)條件為：NaHCO30.19 mmol·L-1、甘氨酸14.86 mmol·L-1、磷酸氫二鉀0.1 g·L-1、通氣量9.8 L·h-1和光照強(qiáng)度360 μmol(s·m2)．室內(nèi)發(fā)酵罐培養(yǎng)得到的最高油脂產(chǎn)量為1.02 g·L-1．通過(guò)戶外800 L管道式生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分批加料更有利于膠網(wǎng)藻的生長(zhǎng)及油脂積累，且其最大油脂產(chǎn)量為0.85 g·L-1．本研究為膠網(wǎng)藻的開(kāi)發(fā)與利用提供了實(shí)驗(yàn)和理論的基礎(chǔ)．