韋 茜 黃尤藝 張湘蓮 姜海行 覃山羽

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,南寧 530021)

惡性腹腔積液(malignant ascites，MA)是由多種因素共同作用的結(jié)果，常見于卵巢癌、肝癌、胃癌等疾病的晚期階段，目前其形成機(jī)制尚不完全清楚。除了腫瘤細(xì)胞外，MA中還含有大量的免疫細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞(主要是CD4+淋巴細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等，發(fā)生MA時(shí)，它們被有選擇性地募集到腹腔，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用[1,2]。Th9細(xì)胞是CD4+輔助性T 細(xì)胞亞群，可由轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)和IL-4在體外刺激誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞獲得，主要分泌IL-9 和IL-10，具有免疫調(diào)節(jié)、促炎、抗腫瘤等效應(yīng)[3，4]。本課題組前期研究顯示Th9細(xì)胞在MA的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而anti-IL-9處理可以延長(zhǎng)小鼠MA 模型的中位生存期[5，6]。

微小RNA145(miR-145)是微小RNA家族的一員，miR-145在多種癌癥中普遍下調(diào)，其通過(guò)靶向多種癌基因調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡和侵襲等[7]。研究顯示卵巢癌患者M(jìn)A中的miR-145 表達(dá)下調(diào)[8]。此外，Lam等[9]研究顯示在卵巢癌小鼠模型中，激活miR-145可抑制卵巢腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，從而減少M(fèi)A產(chǎn)生。Wang等[10]研究顯示在實(shí)驗(yàn)性重癥肌無(wú)力大鼠模型中，過(guò)表達(dá)miR-145可抑制Th17 細(xì)胞的分化。目前miR-145 的研究多集中在腫瘤細(xì)胞，但對(duì)MA 免疫微環(huán)境中的miR-145 與Th9 細(xì)胞之間的關(guān)系及其作用機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本研究重點(diǎn)探討上調(diào)miR-145對(duì)Th9細(xì)胞及相關(guān)因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6小鼠(6～8周，雌性)，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(桂)2014-0002。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清(美國(guó)Gibco)；青鏈霉素(北京索萊寶)；Recombinant Human TGF-β1，Recombinant Mouse IL-4(美國(guó)R&D)；EasySepTMMouse Na?ve CD4+T Cell Isolation Kit(加拿大StemCell)；Stain Buffer(FBS)，F(xiàn)ixation/Permeabilization Solution Kit，anti-Mouse CD3e，anti-Mouse CD28，AlexaFluor647標(biāo)記anti-Mouse IL-9抗體，PerCP-Cyanine5.5標(biāo)記anti-Mouse CD4抗體，Leukocyte Activation Cocktail，流式細(xì)胞儀FACSCantoⅡ(美國(guó)BD)；TransIT-TKO轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Mirus)；miRNeasy Micro Kit(德國(guó)QIAGEN)；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，miRNA qPCR Kit(北京天根生化科技)；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa)；TRIzol Reagent，mRNA RT-PCR試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher)；小鼠IL-9 ELISA 檢測(cè)試劑盒(武漢華美生物工程)；miR-145-5p mimic，miR-145-5p mimic Negative Control (韓國(guó) Bioneer)。

1.2方法

1.2.1脾臟單細(xì)胞懸液制備及初始CD4+T細(xì)胞的分選 參考Pham[11]的方法，頸椎脫臼法處死小鼠，無(wú)菌環(huán)境中解剖小鼠，分離脾臟置于盛有預(yù)冷的5 ml RPMI1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用1 ml注射器尾部研磨脾臟，用吸管輕輕反復(fù)吹散細(xì)胞，將組織研磨液用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，以1 500 r/min離心5 min 棄上清，用1 ml紅細(xì)胞裂解液重懸裂解紅細(xì)胞，1 min后立即加入20 ml培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，沉淀用PBS溶液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，再離心留細(xì)胞沉淀。用含2%胎牛血清的PBS重懸形成1×108個(gè)/ml濃度的細(xì)胞懸液。按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞免疫磁珠分選。分選后的細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的純度。

1.2.2Th9細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化 參考Humblin等[12]的方法，將初始CD4+T細(xì)胞種植于預(yù)先包被anti-CD3(2 μg/ml)的96孔板中，加入anti-CD28(2 μg/ml)、IL-4 (20 ng/ml) 和TGF-β(2 ng/ml)誘導(dǎo)為Th9細(xì)胞，對(duì)照組Th0細(xì)胞不加IL-4、TGF-β，各組細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 d。72 h后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR進(jìn)行分析。

1.2.3細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染 取初始CD4+T細(xì)胞隨機(jī)設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，按1×105個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)分別轉(zhuǎn)染miR-145 mimic、miR-145 mimic NC，空白組不轉(zhuǎn)染?；蜣D(zhuǎn)染步驟按TransIT-TKO轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后24 h收集各組細(xì)胞應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)miR-145表達(dá)水平。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞純度及Th9細(xì)胞誘導(dǎo)比例 加入Leukocyte Activation Cocktail (2 μl/ml)刺激細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)4～6 h后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按1×105個(gè)/管分裝至流式管中，1 500 r/min離心5 min，PBS洗1遍，離心后棄上清，用100 μl PBS重懸細(xì)胞，加入PerCP-Cyanine5.5 標(biāo)記CD4抗體，4℃避光染色20 min，PBS洗1遍，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入Fixation/Permeabilization固定/破膜液250 μl，室溫固定30 min，加入2 ml Perm/Wash液洗1遍，1 500 r/min離心5 min棄上清，以50 μl Perm/Wash液重懸細(xì)胞，加入AlexaFluor647標(biāo)記IL-9抗體，室溫避光染色30 min，Perm/Wash洗1遍，1 500 r/min離心5 min棄上清，用200 μl PBS重懸后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5ELISA檢測(cè)Th9細(xì)胞上清液IL-9的分泌水平 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞誘導(dǎo)分化3 d，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測(cè)IL-9的分泌。按照試劑盒說(shuō)明操作，加入配好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，37℃溫育2 h，倒掉液體，加生物素標(biāo)記抗體混勻，37℃溫育1 h，洗3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素工作液，37℃溫育1 h，洗5次，加TMB底物，37℃溫育15～30 min，加終止液終止反應(yīng)，5 min內(nèi)讀板，450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。

1.2.6RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞miR-145、NFATc1 mRNA、IL-9 mRNA及Smad3 mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞，按miRNeasy Micro Kit說(shuō)明書提取細(xì)胞miRNA，并按miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成，反應(yīng)條件：42℃ 60 min、95℃ 3 min(1個(gè)循環(huán))。按照miRcute Plus miRNA qPCR Kit說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增條件：95℃ 15 min(1個(gè)循環(huán))，94℃ 20 s、64℃ 30 s、72℃ 34 s(5個(gè)循環(huán))，94℃ 20 s、60℃ 34 s(43個(gè)循環(huán))。以U6為內(nèi)參照基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-145的相對(duì)表達(dá)量，miR-145及U6特異性引物均由生工公司設(shè)計(jì)合成，miR-145上游引物序列為5′-ACGGTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′。于轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞檢測(cè)NFATc1 mRNA，于轉(zhuǎn)染并誘導(dǎo)3 d后收集細(xì)胞檢測(cè)IL-9 mRNA及Smad3 mRNA，按TRIzol試劑操作說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：37℃ 15 min、85℃ 5 s(1個(gè)循環(huán))。按照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)。擴(kuò)增條件：UDG酶激活95℃ 2 min(1個(gè)循環(huán))，預(yù)變性95℃ 2 min (1個(gè)循環(huán))，95℃ 15 s、60℃ 1 min (40個(gè)循環(huán))。以GAPDH為內(nèi)參照基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1Th9細(xì)胞誘導(dǎo)分化比例 分選后的細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)比例為(91.4±2.7)%，獲得高純度的初始CD4+T細(xì)胞。按Th9、Th0細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)72 h后，分別檢測(cè)兩組的細(xì)胞標(biāo)志物，結(jié)果顯示，Th9組CD4+IL-9+細(xì)胞比例高于對(duì)照Th0組[(10.9±2.0)% vs (2.22±0.2)%,P<0.05]， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Th9細(xì)胞誘導(dǎo)成功，見圖1。

圖1 CD4+細(xì)胞純度及Th9細(xì)胞誘導(dǎo)流式分析Fig.1 Flow cytometry analysis of CD4+ cell purity and Th9 cellsNote:Naive CD4+T cell were differentiation under a Th9 cell-inducing conditions for 3 d,and then CD4+T cells were first gated on FSC and SSC to remove debris and conjugates,Th9 cells were defined as CD4+IL-9+ subpopulations by flow cytometry.Compared with Th0 group,*.P<0.05.

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-145的表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染24 h后分別提取各組細(xì)胞miRNA，并逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)cDNA，以其作為模板對(duì)miR-145進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-145 mimic NC組和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-145 mimic組細(xì)胞miR-145表達(dá)水平均顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 RT-PCR分析轉(zhuǎn)染后miR-145的表達(dá)Fig.2 RT-PCR analysis of miR-145 expression after transfectionNote:Naive CD4+T cells were transfected with miR-145 mimic or miR-145 mimic NC,RT-PCR analysis of miR-145 expression after 24 h,**.P<0.01.

2.3miR-145可抑制Th9細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)分化72 h， 檢測(cè)各組細(xì)胞標(biāo)記物CD4+

IL-9+，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD4+IL-9+細(xì)胞的比例為：miR-145 mimic組(3.24±1.66)%、miR-145 NC組 (7.84±1.92)%、對(duì)照組(8.58±2.36)%。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-145 mimic組的細(xì)胞CD4+IL-9+表達(dá)較轉(zhuǎn)染miR-145 mimic NC組和對(duì)照組均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)的Th9細(xì)胞Fig.3 Flow cytometry analysis of Th9 cells after transfectionNote:Naive CD4+T cells were transfected with miR-145 mimic or miR-145 mimic NC,and then polarised under Th9 conditions 3 d,analysed by flow cytometry,*.P<0.05.

2.4miR-145可抑制CD4+T細(xì)胞NFATc1的mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后分別檢測(cè)miR-145 mimic組、miR-145 mimic NC組細(xì)胞NFATc1 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-145 mimic NC的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-145 mimic細(xì)胞的NFATc1 mRNA表達(dá)水平降低(t=-4.932,P<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4A。

圖4 miR-145對(duì)Th9細(xì)胞分泌IL-9及IL-9 mRNA和Smad3 mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of miR-145 on expression of IL-9,IL-9 mRNA and Smad3 mRNA in Th9Note:A.RT-PCR analysis of NFATc1 mRNA expression after transfection,**.P<0.01;B.The supernatant was collected and the IL-9 secretion was detected with ELISA,**.P<0.01;C.RT-PCR analysis of IL-9 mRNA and Smad3 mRNA expression,ns.P>0.05,*.P<0.05,**.P<0.01.

2.5miR-145可抑制Th9細(xì)胞IL-9的分泌 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，刺激誘導(dǎo)分化為Th9細(xì)胞，3 d后收集細(xì)胞上清分別檢測(cè)各組細(xì)胞IL-9泌水平，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-145 mimic組(107.1±9.6)pg/ml，轉(zhuǎn)染miR-145 mimic NC組(173.8±9.9)pg/ml，對(duì)照組(185.0±5.1)pg/ml。結(jié)果顯示組間整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.2,P<0.01)，多重比較顯示：轉(zhuǎn)染miR-145 mimic組的細(xì)胞IL-9表達(dá)水平比轉(zhuǎn)染miR-145 mimic NC組和對(duì)照組均顯著減少(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4B。

2.6miR-145可抑制Th9細(xì)胞IL-9的mRNA表達(dá) 各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞刺激誘導(dǎo)72 h，分別檢測(cè)IL-9、Smad3的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，組間整體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-9:F=11.428,P<0.01；Smad3:F=6.033,P<0.05)。與轉(zhuǎn)染miR-145 mimic NC組和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-145 mimic組的IL-9的mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-145 mimic組的Smad3的mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與轉(zhuǎn)染miR-145 mimic NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-145 mimic組細(xì)胞的Smad3的mRNA 表達(dá)降低(P>0.05),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)上調(diào)miR-145可抑制Th9的IL-9的mRNA表達(dá)，見圖4C。

3 討論

Th9細(xì)胞是新近被發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的CD4+細(xì)胞的一個(gè)亞群，其可由Th2細(xì)胞在TGF-β刺激下獲得，也可在體外由小鼠初始CD4+T細(xì)胞在TGF-β和IL-4共同刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生，主要分泌IL-9效應(yīng)因子，能夠激發(fā)炎癥反應(yīng)，參與多種免疫性疾病的病理生理過(guò)程[3,13]。在本研究中，從小鼠脾臟細(xì)胞分選初始CD4+T細(xì)胞后經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，CD4+IL-9+細(xì)胞比例較未誘導(dǎo)細(xì)胞明顯增高，與Wang等[14]結(jié)果基本一致。

Th9細(xì)胞分化涉及多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，編碼細(xì)胞因子IL-9 的基因是Il9，調(diào)控Il9 基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子包括PU.1、IRF1、IRF4、STAT5、STAT6、NFAT、GATA-1、GATA3、Smads、Etv5、Notch 以及NF-κB、AP-1等[15]。Jash等[16]研究顯示T 細(xì)胞受體活化激活了核因子NFAT 和NF-κB,促進(jìn)其核定位和Il9 基因的表達(dá),協(xié)同促進(jìn)Th9 細(xì)胞分化。NFATc1是NFAT家族的一員，Peng等[17]研究發(fā)現(xiàn)NFATc1調(diào)控T和B細(xì)胞的活化與分化，NFATc1缺失則導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖受損，淋巴細(xì)胞的分化也受到抑制。此外，在Th9調(diào)控中，Smad3是TGF-β受體的下游信號(hào)，TGF-β/Smad信號(hào)途徑可以激活I(lǐng)L-9的表達(dá)，Smad2、3 和4 缺失時(shí)，明顯抑制Th9 細(xì)胞分化[18]。這些結(jié)果都提示NFATc1、Smad3在Th9細(xì)胞的分化機(jī)制中起重要作用。

MicroRNAs是一種內(nèi)源性的小型(18～25個(gè)核苷酸)非編碼RNA，通過(guò)抑制翻譯或降低mRNA的穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miR-145在多種癌癥中普遍下調(diào)，通過(guò)靶向多種癌基因調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡和侵襲等多種細(xì)胞過(guò)程[7]。Wang等[10]證實(shí)了過(guò)表達(dá)的miR-145可降低CD4+T細(xì)胞中NFATc1蛋白表達(dá)水平，從而影響Th17細(xì)胞表達(dá)。本研究同樣觀察到過(guò)表達(dá)miR-145可抑制CD4+T細(xì)胞中NFATc1的mRNA水平，同時(shí)Th9細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子分泌也受到了抑制，因此推測(cè)miR-145通過(guò)抑制CD4+T細(xì)胞的NFATc1從而影響Th9細(xì)胞分化。同時(shí)，本研究觀察到過(guò)表達(dá)miR-145可影響Th9細(xì)胞Smad3的mRNA表達(dá)。Megiorni等[19]結(jié)果表明Smad3是 miR-145的潛在靶基因，miR-145可負(fù)調(diào)控Smad3的表達(dá)。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)在HK-2 細(xì)胞中miR-145 可抑制TGF-β依賴的Smad 信號(hào)通路活性。因此，miR-145是否通過(guò)影響TGF-β/Smad信號(hào)通路而影響Th9細(xì)胞分化尚不清楚，今后將進(jìn)一步研究miR-145影響 Th9分化的具體機(jī)制。

綜上所述，本研究顯示上調(diào)miR-145可抑制Th9細(xì)胞分化和IL-9分泌水平。