倪文昌 金 泉 王麗艷 查運(yùn)紅

(武漢市第三醫(yī)院兒科，武漢 430000)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童常見顱外實(shí)體瘤之一，占兒童癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的15%[1]。其臨床表現(xiàn)廣泛，部分良性腫瘤不經(jīng)化療可自行消退，其他轉(zhuǎn)移性疾病甚至對高強(qiáng)度治療耐藥，即使接受強(qiáng)化治療，最具侵襲性的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者存活率仍低于40%[2]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)展的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)被定義為長度超過200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，與包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的癌癥進(jìn)展密切相關(guān)[3]。研究表明，lncRNA MIR4435-2HG可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[4]。上調(diào)MIR4435-2HG可提高胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及小鼠的致瘤性[5]。對DNA甲基化和基因表達(dá)譜的綜合分析發(fā)現(xiàn)，MIR4435-2HG是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤進(jìn)展的致癌lncRNA[6]。miR-873-5p可作為結(jié)直腸癌的腫瘤抑制因子抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長、增殖、遷移和侵襲，影響細(xì)胞周期，并促進(jìn)其凋亡[7]。但MIR4435-2HG和miR-873-5p對神經(jīng)母細(xì)胞瘤生物學(xué)功能的影響尚未闡明。研究顯示，lncRNA有多個miRNA響應(yīng)元件，如MIR4435-2HG靶向miRNA-487a促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[8，9]。本文探討神經(jīng)母細(xì)胞瘤中MIR4435-2HG和miR-873-5p的靶向調(diào)控作用，考察MIR4435-2HG在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及其相應(yīng)組織正常脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)，及其對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并結(jié)合miR-873-5p闡明潛在的作用機(jī)制[10]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與主要試劑 神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，MEM培養(yǎng)基、F12K培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000購自美國invitrogen公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；RT-qPCR相關(guān)檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；si-MIR4435-2HG、pcDNA-MIR4435-2HG、miR-873-5p、anti-miR-873-5p、熒光素酶報告載體購自上海GenePharma公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；細(xì)胞核相關(guān)抗原(nuclear associated antigen Ki67，Ki-67)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)、活化的多聚ADP-核糖聚合酶(Cleaved poly ADP-ribose polymerase，Cleaved PARP)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋公司。

1.1.2組織標(biāo)本來源 34例組織標(biāo)本來源于武漢市第三醫(yī)院2015年6月～2019年6月因神經(jīng)母細(xì)胞瘤接受手術(shù)治療的患者，新鮮標(biāo)本取材后立即置于液氮中凍存用于qPCR檢測。所有患者經(jīng)病理學(xué)確診為神經(jīng)母細(xì)胞瘤，患者或家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC加入含有10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基，SK-N-SH細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2孵育，每周換液2～3次，1∶3進(jìn)行細(xì)胞傳代。選取對數(shù)生長期SK-N-SH細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長至70%融合時，利用Lipofectamine 2000試劑將si-MIR4435-2HG、pcDNA-MIR4435-2HG、miR-873-5p、anti-miR-873-5p及其陰性對照轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞檢測。

1.2.2qPCR檢測lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p表達(dá) 按照說明書進(jìn)行，采用TRIzol試劑提取組織或細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，引物序列：lncRNA MIR4435-2HG F：5′-TGATAAAGGGCTCTGAAAGC-3′，R：5′-CACGATGCCTTCACCAGTGT-3′；miR-873-5p F：5′-TGTGCATTTGCAGGAACTTGT-3′，R：5′-GGGAACTCATCAGTCT-CCTGTTC-3′；U6 F：5′-ACACCAAGCAGTCCGAAG-AG-3′，R：5′-ACAAAATTTCTCACGCCGGT-3′。2-ΔΔCt法計算lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p表達(dá)。

1.2.3MTT檢測SK-N-SH細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后的SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，1×104個/ml接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液100 μl，培養(yǎng)4 h，加入DMSO 200 μl劇烈反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處SK-N-SH細(xì)胞吸光度(OD)，計算細(xì)胞存活率(%)=(OD對照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對照組×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測SK-N-SH細(xì)胞凋亡 離心后收集SK-N-SH細(xì)胞1×105個，根據(jù)Annexin V-FITC 凋亡試劑盒說明書操作，加入500 μl緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡。

1.2.5Western blot檢測Ki-67、CDK2、Cleaved Cas-pase-3、Cleaved PARP、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液提取SK-N-SH細(xì)胞總蛋白，吸取20 μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Ki-67、CDK2、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、MMP-2、MMP-9一抗，4℃孵育過夜，次日采用TBST充分漂洗，加入二抗孵育2 h，TBST充分漂洗，ECL顯影，以β-actin為內(nèi)參計算蛋白表達(dá)。

1.2.6Transwell檢測SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲 在SK-N-SH細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/ml，吸取100 μl接種于Transwell小室上室，下室加入500 μl含血清培養(yǎng)基，37℃孵育24 h，無菌棉簽拭去多余細(xì)胞甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察、計數(shù)。在SK-N-SH細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，將Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基以1∶5 充分混合，吸取100 μl于小室上室，37℃靜置3～4 h。其余操作同上。

1.2.7雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)檢測lncRNA MIR4435-2HG與miR-873-5p靶向關(guān)系 采用starBase網(wǎng)站預(yù)測lncRNA MIR4435-2HG與miR-873-5p的靶向結(jié)合關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者含有互補(bǔ)核苷酸序列。分別建立含有miR-873-5p結(jié)合位點(diǎn)的MIR4435-2HG 3′UTR區(qū)野生型(WT-MIR4435-2HG)與突變型(MUT-MIR4435-2HG)報告基因的質(zhì)粒，利用Lipofectamine 2000試劑將其與miR-873-5p、miR-con共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后測定雙熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和正常脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常脊髓背根神經(jīng)節(jié)相比，神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織MIR4435-2HG表達(dá)顯著升高，miR-873-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05，表1)；與HUVEC細(xì)胞相比，SK-N-SH細(xì)胞MIR4435-2HG表達(dá)顯著升高，miR-873-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05，表2)。

表1 lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和正常脊髓背根神經(jīng)節(jié)的表達(dá)Tab.1 Expressions of lncRNA MIR4435-2HG and miR-873-5p in neuroblastoma tissues and normal spinal dorsal root

表2 lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p在HUVEC細(xì)胞和SK-N-SH細(xì)胞中的表達(dá)Tab.2 Expressions of lncRNA MIR4435-2HG and miR-873-5p in HUVEC and SK-N-SH

2.2沉默MIR4435-2HG抑制SK-N-SH細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡 MTT檢測結(jié)果顯示，與si-con組相比，沉默MIR4435-2HG明顯降低SK-N-SH細(xì)胞存活率(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于si-con組，沉默MIR4435-2HG顯著提高SK-N-SH細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，Western blot檢測結(jié)果表明，同si-con組相比，沉默MIR4435-2HG明顯降低細(xì)胞Ki-67、CDK2蛋白表達(dá)，并提高Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白水平(P<0.05)。見圖1、表3。

表3 沉默MIR4435-2HG對SK-N-SH細(xì)胞增殖和凋亡的影響Tab.3 Effect of silencing MIR4435-2HG on SK-N-SH cell proliferation and

圖1 沉默MIR4435-2HG對SK-N-SH細(xì)胞增殖凋亡、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of silencing MIR4435-2HG on SK-N-SH cell proliferation apoptosis and expressions of apoptosis-related proteins

2.3沉默MIR4435-2HG抑制SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲 Transwell檢測結(jié)果顯示，與si-con組相比，沉默MIR4435-2HG顯著降低SK-N-SH細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)降低減少(P<0.05，表4、圖2)。

圖2 Western blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot detection of MMP-2 and MMP-9 proteins expressionsNote:1.NC；2.si-con;3.si-MIR4435-2HG.

表4 沉默MIR4435-2HG對SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲的影響Tab.4 Effect of silencing MIR4435-2HG on SK-N-SH cell migration and

2.4MIR4435-2HG靶向調(diào)控miR-873-5p表達(dá) star-Base預(yù)測發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIR4435-2HG與miR-873-5p部分核苷酸序列可形成互補(bǔ)配對(圖3)。雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)表明，與miR-con組相比，miR-873-5p明顯降低WT-MIR4435-2HG熒光素酶相對活性(P<0.05)，而不影響MUT-MIR4435-2HG熒光素酶相對活性(表5)。與si-con組相比，si-MIR4435-2HG組miR-873-5p表達(dá)顯著上升，pcDNA-MIR4435-2HG組比pcDNA組顯著降低(P<0.05，表6)。

表5 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)Tab.5

表6 lncRNA MIR4435-2HG對miR-873-5p表達(dá)的影響Tab.6 Effect of lncRNA MIR4435-2HG on miR-873-5p

圖3 lncRNA MIR4435-2HG與miR-873-5p靶向關(guān)系預(yù)測Fig.3 Targeting relationship prediction of lncRNA MIR4435-2HG and miR-873-5p

2.5轉(zhuǎn)染miR-873-5p抑制SK-N-SH細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)其凋亡 與miR-con組相比，SK-N-SH細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-873-5p可明顯降低細(xì)胞存活率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)和Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，并顯著提高細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達(dá)(P<0.05，表7、圖4A)。

表7 轉(zhuǎn)染miR-873-5p對SK-N-SH細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Tab.7 Effect of transfection of miR-873-5p on SK-N-SH cell proliferation,migration,invasion and

2.6干擾miR-873-5p表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA MIR4435-2HG對SK-N-SH細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與si-MIR4435-2HG和anti-miR-con共轉(zhuǎn)染組相比，si-MIR4435-2HG和anti-miR-873-5p共轉(zhuǎn)染可明顯提高SK-N-SH細(xì)胞存活率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、Ki-67、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，顯著降低細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達(dá)(P<0.05，表8、圖4B、C)。

圖4 Western blot檢測SK-N-SH細(xì)胞Ki-67、CDK2、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot detection of Ki-67,CDK2,Cleaved Caspase-3,Cleaved PARP,MMP-2 and MMP-9 proteins expressions in SK-N-SH cells

表8 干擾miR-873-5p和沉默lncRNA MIR4435-2HG對SK-N-SH細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響Tab.8 Effects of interference with miR-873-5p and silencing lncRNA MIR4435-2HG on proliferation,migration,invasion and apoptosis of SK-N-SH

3 討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種發(fā)生于交感神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎癌，是嬰兒出生后1年內(nèi)最常見惡性腫瘤。在15歲以下兒童中，神經(jīng)母細(xì)胞瘤約占所有惡性腫瘤的8%。盡管多種治療方法對神經(jīng)母細(xì)胞瘤有效，但患者5年存活率僅為70%，尤其是高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的治愈率仍低于40%[11]。且患者生活受到終身的嚴(yán)重影響，是家庭和公眾健康的巨大負(fù)擔(dān)和挑戰(zhàn)，但神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。

最近報道指出，lncRNA在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如XIST、RMRP、MAGI2-AS3等[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，MIR4435-2HG在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，已有研究表明，MIR4435-2HG在前列腺癌、肝癌、胃癌等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，已被證實(shí)為胃癌、肝癌等的致癌lncRNA，可促進(jìn)癌癥進(jìn)展[5，9]。MIR4435-2HG在肺癌組織中高表達(dá)，并與組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其下調(diào)可抑制肺癌細(xì)胞增殖和體內(nèi)外侵襲，高表達(dá)MIR4435-2HG可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖與侵襲[15]。本研究中，與正常脊髓背根神經(jīng)節(jié)相比，神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中MIR4435-2HG表達(dá)上調(diào)，MIR4435-2HG在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。提示MIR4435-2HG可能參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展。沉默MIR4435-2HG可明顯降低SK-N-SH細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)、Ki-67、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，顯著提高細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白水平，說明沉默其表達(dá)可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，MIR4435-2HG在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中可能充當(dāng)致癌基因，與既往研究結(jié)論一致[5,9,16]。

研究表明，miRNA失調(diào)影響包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的人類癌癥的生物學(xué)過程[16-19]。miR-873-5p是miRNA家族成員，已被證實(shí)在部分人類癌癥中具有抑癌作用[20]。Li等[21]學(xué)者檢測到結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-873-5p呈低表達(dá)，miR-873-5p過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。miR-873-5p是一種腫瘤抑制因子，可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、集落形成和侵襲，阻止結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移[22]。胃癌組織中miR-873-5p表達(dá)下降，過表達(dá)miR-873-5p可降低胃癌細(xì)胞活力，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[23]。本實(shí)驗(yàn)RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞中miR-873-5p表達(dá)下調(diào)。SK-N-SH細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-873-5p可明顯降低細(xì)胞存活率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)和Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，并顯著提高細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達(dá)，與既往研究結(jié)論相同。miR-873-5p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中同樣為抑癌基因，抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探索MIR4435-2HG影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤生物學(xué)功能的分子機(jī)制，本研究采用生物學(xué)信息工具預(yù)測MIR4435-2HG與miR-873-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，推測MIR4435-2HG可能通過靶向調(diào)控miR-873-5p發(fā)揮作用。雙熒光素酶報告和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-873-5p是MIR4435-2HG的功能性靶基因之一。另外，共轉(zhuǎn)染si-MIR4435-2HG和anti-miR-873-5p發(fā)現(xiàn)，干擾miR-873-5p可部分逆轉(zhuǎn)沉默MIR4435-2HG對SK-N-SH細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。沉默MIR4435-2HG通過功能實(shí)驗(yàn)研究MIR4435-2HG對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)功能的影響，靶向調(diào)控miR-873-5p表達(dá)是研究MIR4435-2HG在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制，后者在前者的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索，共同解釋了MIR4435-2HG的功能和意義。說明MIR4435-2HG通過直接靶向miR-873-5p調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲。

綜上所述，MIR4435-2HG在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，沉默MIR4435-2HG表達(dá)可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-873-5p表達(dá)密切相關(guān)，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床診治提供有價值的生物學(xué)標(biāo)志物和靶點(diǎn)。