喻青青 樊 旭 朱 敏 郗雪艷 杜伯雨

(湖北醫(yī)藥學院，十堰 442000)

肝癌的發(fā)病率不斷增加，腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSCs)理論為肝癌的治療提供了新的思路[1]。CSCs有腫瘤樣特征，能夠維持其自我更新和分化的能力[2]。肝癌中也存在肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSCs)[3]。因此，CSCs的特異性靶向治療對根除腫瘤和預防肝癌發(fā)生具有重要意義。

目前從中草藥中尋找天然抗腫瘤活性成分是抗癌藥物研究的一個重要途徑和研究熱點[4]。重樓現(xiàn)有藥理研究表明，重樓具有抗腫瘤活性作用[5]。本文應用重樓有效成分重樓皂苷Ⅰ，通過體外細胞實驗，觀察其對肝癌細胞Huh7和HepG2的抑制作用，初步探究其是否具有抑制肝癌干細胞的作用。

1 材料與方法

1.1材料 HepG2細胞 和Huh7細胞購自中國醫(yī)學科研學院基礎醫(yī)學研究所。重樓皂苷Ⅰ(純度98%)購自上海源葉生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自 Gibco公司。

1.2方法

1.2.1細胞及藥物處理 人肝癌細胞Huh7和HepG2分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合為90%時進行傳代培養(yǎng)，不同濃度重樓皂苷Ⅰ處理肝癌細胞Huh7和HepG2。處理方法如下：①重樓皂苷Ⅰ(3.12 、6.25、12.50 μmol/L)處理肝癌細胞Huh7；②重樓皂苷Ⅰ(6.25、12.50、25 μmol/L)處理肝癌細胞HepG2，處理時間為24 h。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 選取80%～90%生長密度且狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的肝癌細胞Huh7和HepG2制成1×104個/ml的細胞懸液，向96孔板中接種100 μl上述細胞懸液，對照孔用添加DMSO的培養(yǎng)液制成的細胞懸液，每個濃度接種6個孔。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度重樓皂苷Ⅰ(1.56、3.12、6.25、12.50、25、50 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。移除培養(yǎng)液，向孔板中加入100 μl 0.5%MTT溶液，孵育4 h后棄上清，加入150 μl DMSO 振蕩6 min，溶解結晶物后570 nm處檢測吸光值，計算抑制率。抑制率%= (1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3Transwell實驗檢測細胞遷移能力 取對數(shù)期肝癌細胞Huh7和HepG2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，以無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整濃度為1×106個/ml。向Transwell小室上部培養(yǎng)室內(nèi)加入200 μl細胞懸液，向底部培養(yǎng)室加入650 μl含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基，每組設3個復孔，在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h。然后，對照組不加藥，實驗組給予不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理肝癌細胞Huh7(3.12、6.25、12.50 μmol/L)，HepG2(6.25、12.50、25 μmol/L)，處理時間24 h。吸去嵌室內(nèi)液體，用棉棒擦去嵌室底部內(nèi)表面的細胞，以多聚甲醛固定，結晶紫染色，PBS漂洗，于光鏡下觀察并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的肝癌細胞Huh7和HepG2，將計數(shù)好的細胞懸液加入6 cm培養(yǎng)皿中，使每皿細胞數(shù)為2×105個，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。然后，對照組不加藥，實驗組給予不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理肝癌細胞Huh7(3.12、6.25、12.50 μmol/L)，HepG2(6.25、12.50、25 μmol/L)，處理24 h。收集細胞，用不含EDTA的胰酶消化細胞，用4℃預冷的PBS清洗細胞2次，并用1×結合緩沖液將各組待測細胞制成 1×106個/ml的單細胞懸液，用異硫氰酸熒光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate,FITC)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)對細胞進行染色，室溫避光孵育15 min，利用流式細胞儀對染色細胞進行檢測，實驗重復3次。

1.2.5磁珠分選(MACS)分選CD133+/CD133-Huh7和CD133+/CD133-HepG2細胞 取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的肝癌細胞Huh7和HepG2，胰酶消化后加入適量的DMEM液終止消化，收集細胞并計數(shù)，使細胞總量達到約1×107個。每1×107個細胞加入80 μl緩沖液重懸，再加入20 μl CD133+微珠，4℃避光孵育30 min后離心去上清液。每1×108個細胞用緩沖液重懸細胞后過柱，分別收集CD133+/CD133--Huh7和CD133+/CD133--HepG2細胞。

1.2.6CD133+及CD133-細胞體外成球?qū)嶒?將CD133+和CD133-細胞分別以2×103個/孔接種于6孔板中，均給予含生長因子的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(32 μl 25 ng/ml EGF+40 μl 20 ng/ml FGF+800 μl B27+40 ml DMEM/F12)，置于含5%CO2的37℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液，培養(yǎng)第10天時用倒置顯微鏡觀察陽性及陰性細胞各自生長成球情況。

2 結果

2.1重樓皂苷Ⅰ可抑制肝癌細胞系Huh7和HepG2的活力 MTT法檢測細胞存活率分析重樓皂苷Ⅰ對肝癌細胞活力的影響。結果如圖1A所示，對于Huh7細胞，當重樓皂苷Ⅰ的濃度大于1.56 μmol/L 時，Huh7細胞的存活率降低到80%以下并且隨濃度的增加而降低。圖1B顯示，對于HepG2細胞，當重樓皂苷Ⅰ的濃度大于3.12 μmol/L時，HepG2細胞的存活率降低到80%以下并且隨濃度的增加而降低。

2.2重樓皂苷Ⅰ可抑制Huh7和HepG2的遷移能力 Transwell實驗結果：圖2A和圖2B均顯示，重樓皂苷Ⅰ劑量組，隨著重樓皂苷Ⅰ濃度的增加，穿膜細胞數(shù)量逐漸下降并低于對照組。

2.3重樓皂苷Ⅰ可誘導肝癌細胞凋亡 圖3A顯示，與空白對照組比較，重樓皂苷Ⅰ干預Huh7細胞24 h后，隨著給藥劑量的增加，活細胞數(shù)量明顯降低，凋亡細胞數(shù)量明顯增多，凋亡率從(22.32±4.83)%增加到(46.86±4.53)%，表明重樓皂苷Ⅰ誘導Huh7細胞發(fā)生凋亡。圖3B顯示，重樓皂苷Ⅰ作用HepG2細胞24 h后，6.25 μmol/L組細胞凋亡率為(17.27±4.35)%，12.50 μmol/L組細胞凋亡率為(27.52±6.65) %，25 μmol/L細胞凋亡率為(43.76±6.77)%，均明顯高于對照組(0.67±0.07)%。說明重樓皂苷Ⅰ對肝癌細胞HepG2凋亡的誘導作用存在濃度依賴性。

圖1 重樓皂苷Ⅰ對Huh7和HepG2細胞活力的影響Fig.1 Effect of Polyphyllin Ⅰ on cell viability in Huh7 cells and HepG2 cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs control group.

圖2 Transwell小室細胞遷移實驗檢測重樓皂苷Ⅰ對Huh7細胞和HepG2細胞遷移能力的影響(×20)Fig.2 Influence of PolyphyllinⅠ on migration ability of Huh7 cells and HepG2 cells by Transwel1 cel1 migratioll assay(×20)

2.4重樓皂苷Ⅰ對肝癌干細胞的影響 細胞培養(yǎng)至第8天時，CD133+細胞組培養(yǎng)基中大量懸浮細胞逐漸聚集成團呈立體球狀，而CD133-細胞在相同條件下球狀相對較小。給予含CD133+、CD133-的Huh7細胞6.25μmol/L重樓皂苷Ⅰ處理24 h，給予含CD133+、CD133-的HepG2細胞12.5 μmol/L重樓皂苷Ⅰ處理24 h，發(fā)現(xiàn)含CD133+、CD133-的Huh7細胞和HepG2細胞的細胞團的形態(tài)都發(fā)生同樣的變化，細胞團溶解，逐漸變小，細胞形態(tài)發(fā)生皺縮。如圖4。

圖3 流式細胞術觀察重樓皂苷Ⅰ對Huh7細胞和HepG2細胞凋亡的影響Fig.3 Detection of apoptosis in Huh7 cells and HepG2 cells were tread with different concentrations of PolyphyllinⅠby flow cytometric analysisNote:*.P<0.05,**.P<0.01 vs control group.

圖4 重樓皂苷Ⅰ對肝癌腫瘤干細胞的影響(×10)Fig.4 Effects of Polyphyllin I on stem cell balls of Huh7 cells and HepG2 cells(×10)

3 討論

幾乎所有的惡性腫瘤中都潛伏著極少的CSCs，是癌癥產(chǎn)生、復發(fā)、轉(zhuǎn)移乃至放化療抵抗以及治療失敗的根源[6]。肝癌已成為全球癌癥相關死亡的第二大原因，每年新增肝癌患者30萬～100萬例[7]。肝癌中也存在LCSCs，尋找LCSCs特異性靶點以及針對LCSCs的診斷及治療，將會為肝癌的預防、早期診斷、有效治療、預后監(jiān)測以及徹底治愈肝癌開辟一條嶄新的途徑[8]。

植物類抗腫瘤藥物是目前的研究熱點，重樓是其中之一[9-11]。重樓皂苷Ⅰ為重樓的主要有效成分，一些研究表明，重樓皂苷Ⅰ對卵巢癌、胃癌、骨髓瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌等具有抗腫瘤的作用[12-17]。目前重樓皂苷Ⅰ在LCSCs中的作用還不清楚，因此，本文選取了肝癌細胞株Huh7細胞和HepG2細胞為研究對象，旨在研究重樓皂苷Ⅰ在LCSCs中的作用[18-23]。

MTT結果顯示，重樓皂苷Ⅰ在體外對肝癌細胞株Huh7細胞和HepG2細胞的增殖有明顯的抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加，抑制作用愈加明顯。MTT實驗結果表明，重樓皂苷Ⅰ作用于Huh7細胞時，當濃度為6.25 μmol/L時，其抑制率為59%；重樓皂苷Ⅰ作用于HepG2細胞時，當濃度為12.50 μmol/L，其抑制率45%；因此選取了不同給藥濃度進行后續(xù)實驗。

目前治療腫瘤廣泛采用的策略主要是誘導腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖，是治療腫瘤藥物的重要作用機制之一[24-26]。通過Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞儀檢測可見重樓皂苷Ⅰ對肝癌細胞細胞株誘導凋亡作用。重樓皂苷Ⅰ作用Huh7細胞24 h，細胞凋亡率隨濃度增加而增加；重樓皂苷Ⅰ作用HepG2細胞24 h后，對細胞的凋亡誘導存在濃度依賴性。

腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移的過程中最為關鍵的步驟就是腫瘤細胞的遷移[27]，它是導致患者死亡的重要原因之一。通過Transwell實驗結果顯示：在Huh7細胞及HepG2細胞中重樓皂苷Ⅰ劑量與對照組比較，隨著濃度的增加，穿膜細胞數(shù)量逐漸下降，因此，重樓皂苷Ⅰ能抑制肝癌細胞株Huh7和HepG2細胞的遷移能力。

目前有多種表面標志物被用來區(qū)別LCSCs，例如CDl33[28]。目前CD133+己成為包括肝癌在內(nèi)的多種實體腫瘤CSCs的標志物[29]?？梢圆捎妹庖叽胖榉蛛x技術，以CD133為特征性表面標志物來得到LCSCs[30]。結果顯示，免疫磁珠分選得到的CD133+-Huh7細胞和CD133+-Huh7細胞對比CD133--HepG2細胞和CD133--HepG2具有更強的體外成球能力，進而采用中濃度的重樓皂苷Ⅰ處理腫瘤細胞球24 h，結果顯示CD133+及CD133-的腫瘤細胞球變小，細胞形態(tài)發(fā)生皺縮。

本研究表明，重樓皂苷Ⅰ抑制肝癌細胞株Huh7細胞和HepG2細胞的增殖，誘導兩種細胞的凋亡，降低其遷移能力。但是磁珠分選LCSCs后，通過無血清體外成球?qū)嶒灲Y果顯示，得出結論是重樓皂苷Ⅰ不具備明顯的殺傷LCSCs的能力，提示重樓皂苷Ⅰ可能不是通過作用于LCSCs發(fā)揮抗肝癌作用，有待進一步研究并探討重樓皂苷Ⅰ抗肝癌的作用機制，為臨床開發(fā)新的抗肝癌的藥物提供新的思路和基礎。