杜 璨，耿增超

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)部 西北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，陜西 楊陵 712100)

云杉林(Piceaasperata)和紅樺林(Betulaalbosinensis)是秦嶺2種典型森林類型，分布面積大，主要分布秦嶺的中部，絕大部分屬于天然次生林[1-2]。云杉和紅樺具有對養(yǎng)分要求低、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、防病蟲害能力強(qiáng)和經(jīng)濟(jì)價值高等特點，在秦嶺森林生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與保護(hù)方面起著重要的作用[1-2]。

土壤微生物對森林土壤生態(tài)系統(tǒng)來說至關(guān)重要，其參與土壤養(yǎng)分循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換[3-4]，具有改善土壤質(zhì)量，促進(jìn)土壤穩(wěn)固，維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性的作用。土壤細(xì)菌作為微生物中最主要的群體，其數(shù)量大、分布廣，是地球生物化學(xué)循環(huán)的重要驅(qū)動者。有研究表明，土壤細(xì)菌群落的組成和多樣性與土壤有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化有關(guān)[5]，參與土壤有機(jī)質(zhì)分解等過程[6]。因此，研究森林生態(tài)系統(tǒng)土壤細(xì)菌群落對于深入探討森林生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能以及物質(zhì)循環(huán)具有非常重要的作用。

土壤細(xì)菌對土壤環(huán)境變化具有高度的敏感性，隨著季節(jié)的更替養(yǎng)分含量隨之改變，勢必會影響土壤細(xì)菌群落組成以及多樣性[7-8]。林分生長旺盛期和凋落高峰期會促使土壤養(yǎng)分改變，從而引起了土壤細(xì)菌群落組成的變化[9]。此外，季節(jié)性的溫、濕度變化也是影響細(xì)菌群落分布的重要因素[9]。C.A.Sierraetal[10]研究發(fā)現(xiàn)，在眾多因素當(dāng)中，土壤細(xì)菌群落組成及多樣性變化主要受土壤溫度的影響。也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，古生菌的數(shù)量會相對增加[11]。楊杰等[12]對南方紅壤中細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌多樣性和結(jié)構(gòu)受到土壤含水量的影響。但是，關(guān)于秦嶺云杉和紅樺林的研究主要集中在土壤酶活性、土壤養(yǎng)分等方面[13-14]，對云杉林和紅樺林土壤細(xì)菌群落組成季節(jié)性變化的研究鮮有報道。本研究選取辛家山云杉林和紅樺林土壤為對象，在4個季節(jié)采集表層土壤樣品，研究土壤細(xì)菌的多樣性及群落組成與土壤環(huán)境因子的關(guān)系，揭示土壤細(xì)菌的季節(jié)性分布和土壤細(xì)菌組成對不同季節(jié)土壤性質(zhì)的響應(yīng)，以期為更好地了解細(xì)菌群落在森林土壤生態(tài)系統(tǒng)中的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)辛家山隸屬陜西省寶雞市鳳縣，位于秦嶺山脈的西部南坡[13-14]，行政區(qū)域隸屬陜西省寶雞市鳳縣。秦嶺山脈是我國南北方地區(qū)分水嶺，由于地處秦嶺主梁南側(cè)的嘉陵江上游地區(qū)，辛家山地區(qū)屬暖溫帶半濕潤山地氣候，海拔最高處2 739 m，地勢最低處1 580 m，整體呈地勢西高東低，森林覆蓋率高，達(dá)96.8%，年均溫7.6℃，年平均降水量900 mm，7-9月的降雨尤為集中，年平均氣溫7.6℃[13-14]。在該區(qū)域內(nèi)，選取2種天然次生林：云杉和紅樺，樣地詳情見表1。

1.2 土壤樣品的采集與處理

2015年7月、2015年10月、2016年1月和2016年4月在云杉林和紅樺林中分別選取3個采樣樣方(20 m×20 m)。每個樣方中選取5個采樣點，每個采樣點中用五點法采集0～10 cm的土壤樣品。采集的鮮土樣除去石子和根系殘體等后，將同一樣方內(nèi)各采樣點的土樣混合均勻，裝入無菌自封袋中，冷藏運回實驗室。取其中一部分土壤樣品在-80℃條件下冷藏，以便提取細(xì)菌DNA，一部分貯藏于4℃的冰箱內(nèi)，用來測定DOC和MBC，剩一部分室內(nèi)風(fēng)干過篩，測定其他理化指標(biāo)。

1.3 土壤理化性質(zhì)分析

土壤樣品采集當(dāng)天，使用地溫計測定每個采樣點土壤5 cm處的溫度(ST)3個重復(fù)。土壤含水量采用烘干法(105±2)℃。土壤pH采用電位法(水∶土=2.5∶1)[15]。土壤有機(jī)碳(SOC)采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定[16]?？扇苄杂袡C(jī)碳(DOC)采用去離子水震蕩浸提[17]。土壤易氧化有機(jī)碳(EOC)采用K2MnO4氧化法[18]。土壤微生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法[19]。

1.4 土壤細(xì)菌DNA提取、測序和處理

使用美國OMEGA公司Fast DNA SPIN Kit(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)試劑盒并按照說明提取基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總DNA質(zhì)檢。選擇16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物為341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，反向引物是806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。使用KAPA Hi Fi Hotstart Ready Mix PCR kit高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。使用Illumina MiSeq PE300進(jìn)行上機(jī)測序。

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控之后，用軟件QIIME進(jìn)行過濾、拼接、去除嵌合體，通過97%相似度的標(biāo)準(zhǔn)聚類，得到聚類成操作分類單元(OTUs)，每個OTUs被認(rèn)為可代表1個物種[[20]，在16S數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對[21]。根據(jù)OTUs列表中的各樣品物種豐富度情況，應(yīng)用軟件mothur(http://www.mothur.org/)中的summary.single命令[22]，計算豐富度Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，公式如下：

表1 樣地基本概況Table 1 Basic status of sampling plot

(1)

式中，Schao1為估計的豐富度；Sobs為觀測得到的總物種數(shù)；n1為只含有1條序列的OTUs數(shù)目；n2為只含有2條序列的OTUs數(shù)目。

(2)

式中，Hshannon為估計的多樣性；Sobs為觀測得到的OTUs；ni為第i個OTUs中個體的數(shù)目；N為群落中物種總數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Pearson相關(guān)系數(shù)法和Canoco 5.0軟件的冗余分析(RDA)進(jìn)行土壤性質(zhì)和細(xì)菌群落的分析。采用統(tǒng)計分析軟件(SPSS 20.0)的單因素方差分析功能分析季節(jié)對土壤性質(zhì)、土壤細(xì)菌多樣性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 季節(jié)對土壤性質(zhì)的影響

由表2可知，2種林分土壤均呈酸性，相同季節(jié)紅樺林土壤pH大于云杉林。與云杉林相比，紅樺林具有較高的SOC、EOC、DOC、MBC。季節(jié)對ST、SWC、SOC、EOC、DOC、DOC有顯著影響(P<0.05)。夏季最高溫在13℃左右，冬季最低溫在-1℃左右。土壤有機(jī)質(zhì)和易氧化有機(jī)碳含量在秋季最大，冬季最低，春季、秋季居中，可溶性有機(jī)碳微生物生物量碳含量表現(xiàn)為：夏季>秋季>冬季>春季，微生物生物量碳含量呈現(xiàn)出夏季>秋季>春季>冬季的特征。

表2 云杉林和紅樺林的土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Soil basic properties in P.asperata and B.albosinensis forests

2.2 季節(jié)對土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的影響

由表3可知，春季和秋季云杉林Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)高于紅樺林夏季具有較高的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)最高，除紅樺林Shannon指數(shù)外，Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均在冬季最低。在云杉林中，夏季土壤Chao1指數(shù)分別是秋季、冬季和春季的1.71、2.98和1.48倍；Shannon指數(shù)分別是秋季、冬季和春季的1.07、1.16和1.11倍。在紅樺林中，夏季土壤Chao1指數(shù)分別是秋季、冬季和春季的1.27、2.43和51.66倍；夏季Shannon指數(shù)分別是秋季、冬季和春季的1.14、1.06和1.16倍。

2.3 季節(jié)對2種林分土壤細(xì)菌群落組成的影響

高通量測序檢測到云杉林和紅樺林表層土(0～10 cm)中的細(xì)菌有32門，62綱，70目，155科，344屬；其中門(phylum)和屬(genus)水平的細(xì)菌群落組成見圖1、圖2。2種林分土壤中檢測到的主要細(xì)菌門有：酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和Latescibacteria等。酸桿菌門、變形菌門和擬桿菌門是2種林分土壤中占主導(dǎo)地位的細(xì)菌門，所占比例總和達(dá)到70%以上。在云杉林中，酸桿菌門的相對豐度在秋季達(dá)到最大值70.51%，較春、夏和冬季分別增加17.47%、24.86%和133.99%。而變擬桿菌門與酸桿菌門相反，在冬季達(dá)到最大值27.22%，分別是春、夏和冬季的3.77、7.81和13.27倍，變形菌門的相對豐度在夏季高于其他季節(jié)。在紅樺林中，酸桿菌門的相對豐度在秋季達(dá)到最大值60.71%，較其他3個季節(jié)增加16.46%～280.73%。變形菌門在夏季達(dá)到最大值，分別是春，秋和冬季1.14、1.58、1.83倍，而擬桿菌門的相對豐度在冬季最大，較春，夏和秋季分別提高了770.04%、509.26%、1496.18%。放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門和Latescibacteria在4個季節(jié)的變化范圍為4.40%～9.24%，0.18%～15.39%，1.02%～5.14%，1.60%～7.03%。

圖1 云杉林和紅樺林土壤細(xì)菌門相對豐度Fig.1 Relative abundances of bacterial communities at phylum level in the soils of P.asperata and B.albosinensis forests

圖2 云杉林和紅樺林土壤細(xì)菌屬相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacterial communities at genus level in the soils of P.asperata forest and B.albosinensis forests

在云杉林和紅樺林土壤中，主要的優(yōu)勢菌屬為Gp4、Gp6、Gp16、擬桿菌屬(Bacteroides)、Latescibacteria_genera_incertae_sedis和Gp2。季節(jié)對優(yōu)勢菌屬有顯著的影響，2種林分冬季土壤中的Gp4、Gp6、Gp16和Latescibacteria_genera_incertae_sedis相對豐度要低于其他季節(jié)。而擬桿菌屬的相對豐度在冬季達(dá)到最大值，可達(dá)27%左右，夏季和秋季相對豐度接近為零。

2.4 土壤細(xì)菌α多樣性與土壤性質(zhì)的相關(guān)性分析

土壤細(xì)菌多樣性與土壤酶活性相關(guān)性分析見表4。在云杉林中，Chao1指數(shù)與SWC、SOC、DOC和MBC呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與ST呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。Shannon指數(shù)與SWC、SOC、DOC和MBC呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與ST呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。在紅樺林中，Chao1指數(shù)與pH、SWC、SOC、DOC和MBC呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與ST呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與EOC呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。Shannon指數(shù)與pH、SOC和DOC呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與ST呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與MBC呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

2.5 土壤細(xì)菌群落與土壤性質(zhì)的RDA分析

為探明影響細(xì)菌群落的主導(dǎo)因子，在門水平上對細(xì)菌群落進(jìn)行冗余分析(RDA)(圖3)。RDA的兩軸的累積貢獻(xiàn)率分別為43.6%和12.66%。土壤pH、SWC、ST 、SOC 、EOC、DOC和MBC共同解釋了69.2%的細(xì)菌群落組成變化。由表5可知，SWC是影響真菌群落組成的主要因素，解釋率為42%(F=15.9,P=0.001)，其次是EOC(F=4.4,P=0.005)和SOC(F=3.2,P=0.005)，解釋率分別為10.1%和6.6%(表5)。土壤因素的影響順序為：SWC>EOC>SOC>DOC>ST>MBC>pH。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

秦嶺云杉林和紅樺林表層(0～10 cm)土壤中，季節(jié)對土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)有顯著影響，與秋、冬、春季相比，夏季Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)較高。

2種林分的酸桿菌門和擬桿菌門呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性變化特征。夏季酸桿菌門相對豐度高于冬季，而擬桿菌門相對豐度則表現(xiàn)出冬季高于夏季的特征。

土壤養(yǎng)分含量、土壤溫度和濕度的季節(jié)性變化對細(xì)菌多樣性和群落組成有顯著影響。

3.2 討論

3.2.1 2種林分土壤性質(zhì)的季節(jié)變化特征 在森林生態(tài)系統(tǒng)中，秦嶺地區(qū)季節(jié)性的溫度變化會驅(qū)動土壤溫度的改變，因此土壤溫度呈現(xiàn)出夏季高、冬季低的特征。土壤含水量與降雨、降雪有關(guān)，雖然秦嶺降雨主要集中在7-9月，但是由于蒸發(fā)較快，因此夏、秋季節(jié)土壤含水低于冬、春季節(jié)，春季積雪消融增加了土壤中的水分含量。

注：Aci.acidobacteria；Bac.bacteroidetes；Pro.proteobacteria；Fir.firmicutes；Act.actinobacteria；Lat.latescibacteria；Chl.chloroflexi；Eur.euryarchaeota。圖3 土壤細(xì)菌群落和土壤環(huán)境因子的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of soil bacterial phyla and soil properties

不同樹種可通過影響林地微環(huán)境、凋落物量與分解速率，以及根系的周轉(zhuǎn)等過程，進(jìn)而對土壤pH、碳等產(chǎn)生影響[23-24]。林分類型對土壤性質(zhì)有顯著影響，紅樺林中SOC、EOC、DOC和MBC高于云杉林，主要是因為落葉闊葉林外源碳輸入量較高，且易分解，促進(jìn)了土壤養(yǎng)分的積累。本研究中，秋季土壤EOC含量高于其他季節(jié)，冬季最低。主要與植被的生長季和凋落期有關(guān)[25]，秋季是凋落物增加的時期，促進(jìn)了土壤有機(jī)碳的輸入，使土壤EOC含量升高[26]，在夏季植被生長進(jìn)入旺盛期，需要從土壤中獲取更多養(yǎng)分，因此加速了土壤SOC的礦化[27]，使EOC含量有所降低。DOC含量表現(xiàn)出夏季高、春季低的特征，主要是因為DOC含量會受到降水影響而淋失的影響[28]。秦嶺地區(qū)，降雨主要集中在7、8、9月，4月溫度回升積雪開始融化引發(fā)較強(qiáng)的淋失作用，因此這2個時期DOC含量降低。本研究中MBC含量在夏季最大，冬季最低，這一結(jié)果與P.K.Jiangetal[29]對雷竹林土壤微生物的研究相反，這與季節(jié)性的土壤溫、濕度變化相關(guān)，因為7-9月適宜的溫、濕度條件有利于微生物的生長繁殖，而冬季氣溫低不利于微生物生長[30]。

3.2.2 2種林分土壤細(xì)菌多樣性的季節(jié)變化特征 在同一氣候條件下，植被類型是影響土壤微生物群落的重要因素。不同植被具有不同的凋落物、根系分泌物，從而會對土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生影響[31]。崔芳芳等[32]的研究表明,與針葉林相比闊葉林地具有較高的土壤微生物的數(shù)量。本研究中春季夏季紅樺林多樣性指數(shù)較高，因為春夏季紅樺林養(yǎng)分含量高，有利于細(xì)菌生長繁殖，而秋冬季節(jié)，紅樺林凋落物大量積累，覆蓋于土壤表面使得空氣不流通，不利于細(xì)菌生長；相反，云杉林為常綠針葉林，凋落物量較少。在同一植被不同季節(jié)條件下，土壤細(xì)菌群落多樣性在夏、秋季顯著高于冬、春季，表明土壤微生物在夏、秋季節(jié)最活躍的，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因有2個：一方面，夏季植物進(jìn)入光合旺季，光合產(chǎn)物通過根系進(jìn)入土壤促進(jìn)了微生物的生長繁殖[9]，秋季凋落物達(dá)到鼎盛，為微生物的生長提供了充足的碳源，這也表明土壤有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)元素在細(xì)菌群落形成過程中發(fā)揮著重要的作用[33]。另一方面，季節(jié)性的土壤溫、濕度變化也會影響土壤細(xì)菌多樣性。有研究表明，隨著溫度的升高，微生物活性和物種豐富性也會升高[10]。溫度降低，特別是低于0℃以下，細(xì)菌內(nèi)液會發(fā)生冰凍現(xiàn)象、造成細(xì)胞破裂死亡[34]，降低了細(xì)菌數(shù)量。因此，本研究結(jié)果證明環(huán)境因子也是驅(qū)動群落多樣性季節(jié)性差異的重要因素。

3.2.3 2種林分土壤細(xì)菌群落組成的季節(jié)變化特征 2種林分土壤中酸桿菌門、變形菌門和擬桿菌門均是土壤中占主導(dǎo)地位的細(xì)菌門，這一結(jié)果與楊立賓等[35]的研究結(jié)果一致，在湯旺河國家公園森林土壤中，Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes為優(yōu)勢菌門。C.L.Lauberetal[36]的研究發(fā)現(xiàn),在酸性土壤中酸桿菌門和變形菌門等是主要細(xì)菌類群。季節(jié)對細(xì)菌群落豐度的影響明顯高于群落組成。夏季具有較高的酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度，冬季具有較高的擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度。本研究經(jīng)RDA分析可以看出，擬桿菌門與土壤SOC、EOC、DOC和MBC等呈負(fù)相關(guān)，酸桿菌門與土壤SOC、EOC、DOC和MBC等呈正相關(guān)，這與前人的研究結(jié)果不同。已有的研究證明酸桿菌門(Acidobacteria)對養(yǎng)分要求不高][37]，而擬桿菌門(Bacteroidetes)在營養(yǎng)豐富的土壤中更占優(yōu)勢[38-39]。這主要是因為除了土壤養(yǎng)分外，森林生態(tài)系統(tǒng)在不同的季節(jié)溫濕度會存在顯著差異，也會對細(xì)菌群落豐度產(chǎn)生影響。已有的研究證明，土壤微生物的季節(jié)性變化與土壤溫度和濕度的季節(jié)性變化有關(guān)[9]。但在本研究中土壤溫度對土壤細(xì)菌的影響小于土壤含水量，這與南方紅壤丘陵區(qū)土壤細(xì)菌群落與溫、濕度相關(guān)性一致[12]。由RDA分析可知，土壤水分是影響細(xì)菌群落季節(jié)性變化的主要因素，土壤水分對細(xì)菌群落影響的機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。由此可以看出，在秦嶺地區(qū)細(xì)菌群落組成的季節(jié)性變化是由土壤養(yǎng)分和溫、濕度共同作用的結(jié)果。