梅 源，金小朵，段冰冰，王 新，蘇周晨星，任一曌，劉 旭,2,3*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程研究中心，陜西 楊陵 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 合陽葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 合陽 715300)

葡萄酒是以葡萄漿果為原料釀造獲得的，果實(shí)采收時(shí)漿果的成熟度是影響所釀酒質(zhì)量的重要因素之一。目前，生產(chǎn)上主要利用技術(shù)成熟度即測定果汁中糖、酸的含量及其比值來判斷釀酒葡萄的成熟度，從而決定采收期。但是技術(shù)成熟度僅考慮了果肉中糖和酸的含量，忽略了果皮和種子中的花色苷、單寧等酚類物質(zhì)。這些酚類物質(zhì)既是葡萄植株體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)，可以緩解葡萄遭受紫外線、病菌和干旱等生物和非生物脅迫的危害，具有抗氧化的功能[1,2]，同時(shí)又與葡萄酒的色澤、收斂性、香氣等密切相關(guān)，是葡萄酒的重要品質(zhì)因子[3,4]。因此，近年來越來越多的葡萄酒企業(yè)在確定果實(shí)采收期時(shí)，除了測定糖酸的含量外還要綜合考慮果皮中酚類物質(zhì)的成熟度[5-7]。但是，目前酚成熟度的檢測具有前處理復(fù)雜、檢測設(shè)備昂貴、檢測時(shí)間長等問題，如何實(shí)現(xiàn)酚成熟度的快速、高效檢測是一個(gè)亟待解決的問題。

紅色釀酒葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色后果皮中花色苷含量逐漸增加，單寧含量不變或略有降低[8]。同時(shí)，果皮的質(zhì)地特性也發(fā)生著相應(yīng)的變化[9]。這些變化主要與果實(shí)成熟期間果皮細(xì)胞壁組分、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織膨壓的變化[10]以及由果膠酶主導(dǎo)的果皮細(xì)胞壁降解等有關(guān)[11-13]。葡萄浸漬發(fā)酵期間果皮中花色苷和單寧的釋放能力與果皮質(zhì)地特性密切相關(guān)[14,15]。因此，可利用釀酒葡萄果皮的質(zhì)地特性檢測預(yù)測果實(shí)酚類物質(zhì)含量。該方法不需要前處理，測定時(shí)間短，并且可以實(shí)現(xiàn)大量樣本的連續(xù)檢測，從而提高檢測的代表性和可靠性[16]。目前國內(nèi)外的相關(guān)研究主要集中于利用釀酒葡萄果皮質(zhì)地特性預(yù)測果皮中花色苷的可提取率等[17]，而基于果皮質(zhì)地特性檢測釀酒葡萄果實(shí)酚成熟度的研究較少。因此，本試驗(yàn)以紅色釀酒葡萄赤霞珠為材料，研究了采自不同產(chǎn)區(qū)、不同時(shí)期的果實(shí)其酚成熟度與果皮質(zhì)地特性之間的關(guān)系，旨在研究釀酒葡萄果實(shí)酚成熟度與果皮質(zhì)地特性之間的回歸模型，從而為釀酒葡萄酚成熟度的快速檢測提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試葡萄品種為歐亞種釀酒葡萄赤霞珠(Vitisviniferacv)，2016年和2017年分別在果實(shí)成熟期間的E-L35(30%葡萄轉(zhuǎn)色)、E-L36(成熟中期)和E-L38(商業(yè)采收期)3個(gè)時(shí)期進(jìn)行采樣，2 a的采樣地均為陜西涇陽、山西夏縣、寧夏銀川和甘肅武威的釀酒葡萄園(表1)，田間生物學(xué)重復(fù)3次。

表1 葡萄園基本信息Table 1 Basic information of vineyards

主要試劑：三氯化鐵、硫代硫酸鈉、牛血清蛋白、偏亞硫酸鉀、偏重亞硫酸鈉，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；兒茶素、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XTplus型物性分析儀，英國Stable Micro System公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司等。

1.3 方法

1.3.1 果實(shí)基本理化指標(biāo)測定 每個(gè)重復(fù)隨機(jī)采取100粒漿果，測定粒重。然后從中隨機(jī)取出20粒，測定縱徑(L)和橫徑(l)，并按如下公式計(jì)算果粒體積和表面積[18]。然后人工破碎所有果實(shí)，擠出果汁，紗布過濾后測定可溶性固形物含量(°Brix)、還原糖含量、可滴定酸含量和pH值。

體積/mm3=4πabc/3

(1)

表面積/mm2=4π[(ap×bp+ap×cp+bp×cp)/3]1/p

(2)

式中，a=b=l/2；c=L/2；p=1.607 5。

1.3.2 果實(shí)酚成熟度指標(biāo)測定 參考E.Cagnassoetal[19]的試驗(yàn)方法，略有修改。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取50粒漿果，勻漿并稱重。將果漿平均分到2個(gè)離心管中，在1個(gè)離心管中加入20 mL 0.3 mol·L-1(pH1.0)的草酸溶液；另一個(gè)離心管中加入20 mL 0.3 mol·L-1(pH3.2)的磷酸溶液，避光浸漬4 h。離心3 min(8 000 r·min-1)后分別移取上清液。采用二氧化硫脫色法測定總花色苷含量(A1.0)和可提取花色苷含量(A3.2)。用pH3.2磷酸溶液浸提后的上清液稀釋100倍后在280 nm下測定吸光值A(chǔ)280?？偡又笖?shù)(total phenols index，TPI)、細(xì)胞成熟指數(shù)(cellular maturity index，CMI)和種子成熟指數(shù)(seed maturity index，SMI)按如下公式進(jìn)行計(jì)算：

TPI=A280×100

人體感應(yīng)模塊，全稱為熱釋電紅外的傳感器模塊，它是一種可以檢測人或動(dòng)物發(fā)射的紅外線而輸出電信號的傳感器，只要設(shè)置STM32對應(yīng)的GPIO引腳為輸入模式，當(dāng)有人靠近過時(shí)就會(huì)檢測到高電平，達(dá)到報(bào)警的功能。引腳圖如圖5所示。

(3)

CMI/%=(A1.0-A3.2)/A1.0×100%

(4)

SMI/%= [1- (A3.2×0.04)/(A280×100)]×100%

(5)

式中，A1.0和A3.2分別為漿果中總花色苷和可提取花色苷含量/mg·L-1。

1.3.3 果皮中酚類物質(zhì)含量測定 每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取20粒漿果，稱重后撕下果皮，蒸餾水沖洗3次。吸水紙吸干后稱重。在玻璃試管中加入20 mL丙酮水溶液(丙酮/水=2∶1，V∶V)，加入果皮樣品。常溫下避光輕微振蕩浸提24 h，布氏漏斗抽濾得到提取液。

提取液總酚含量測定采用Adams-Harbertson方法[20]，提取液總單寧含量分別采用蛋白質(zhì)沉淀法(adams-harbertson，A-H)[20]和甲基纖維素法(methyl cellulose precipitation，MCP)[21]測定。

1.3.4 果實(shí)質(zhì)地特性測定 每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取30粒大小相近的漿果，測定果粒赤道線處果皮的硬度。表征果皮硬度的參數(shù)為：果皮穿刺力(skin break force，F(xiàn)sk)、穿刺能量(skin break energy，Wsk)、楊氏模量(Young’s modulus，Esk)。每粒漿果測定果皮硬度后，于赤道線處小心撕下約0.25 cm2的果皮測定果皮厚度，測試條件見表2。

表2 質(zhì)地特性測試條件Table 2 Operative conditions for textural property analysis

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS(22.0)軟件進(jìn)行方差分析、多重比較(Duncan分析法，P≤0.05)、Pearson相關(guān)性分析、主成分分析(PCA)和多元回歸分析(MLR)(表3)。圖表采用SPSS 22.0和Origin 2018軟件繪制。

表3 用于統(tǒng)計(jì)分析的酚成熟度指標(biāo)和果皮質(zhì)地特性參數(shù)Table 3 Parameters of phenolic maturity and skin textural properties for statistical analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠葡萄果實(shí)基本理化指標(biāo)的描述性分析

赤霞珠葡萄果實(shí)各個(gè)基本理化指標(biāo)數(shù)據(jù)集的數(shù)值都具有較大的變幅(表4)。漿果粒重的變化范圍為0.54～1.56 g，平均值為1.10 g。每20粒葡萄漿果的表面積和體積變幅分別為280～655 cm2、442～1 577 cm3，平均值分別為474 cm2、980 cm3。果實(shí)可溶性固形物的變化范圍從10.10 °Brix到27.50 °Brix，而還原糖、可滴定酸以及pH值的變化范圍分別為64～251 g·L-1、4.14～27.31 g·L-1、2.44～4.80。另外，粒重較小的漿果其果粒表面積、體積、可溶性固形物和還原糖含量也較小，而粒重最大的漿果其體積和表面積值也最大，具有最高可溶性固形物的漿果其還原糖含量也最高(數(shù)據(jù)未列出)。

表4 赤霞珠葡萄樣品基本理化指標(biāo)(n=72)Table 4 Summary statistics of the basic physicochemical parameters for Cabernet Sauvignon grapes(n=72)

2.2 赤霞珠葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)含量和酚成熟度的描述性分析

赤霞珠葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)含量和酚成熟度的描述(表5)可見，果皮中總酚含量最大值與最小值相差1 461 g·L-1，平均值與最小值相差654 g·L-1，說明樣本內(nèi)總酚含量較大差異。樣本中果皮總單寧的含量及其變幅與采用的測定方法有關(guān)，MCP法測得的總單寧含量變化范圍大于A-H法，2個(gè)指標(biāo)在樣本集中的極差分別為1 743 g·L-1和1 135 g·L-1。MCP法測得總單寧的含量在所有樣品中的平均值是A-H法測得值的1.2倍，且根據(jù)Pearson相關(guān)性分析表明二者之間存在極顯著相關(guān)性(P<0.001，數(shù)據(jù)未列出)。樣本中漿果總花色苷和可提取花色苷含量與果實(shí)成熟度密切相關(guān)，均在轉(zhuǎn)色初期(E-L35)最低，商業(yè)采收期(E-L38)最高。

表5 赤霞珠葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)含量及酚成熟度(n=72)Table 5 Summary statistics of the phenolic compounds content and phenolic maturity for Cabernet Sauvignon grapes (n=72)

整個(gè)樣本中細(xì)胞成熟指數(shù)(CMI)變幅較大，為44.26%，說明赤霞珠葡萄果實(shí)中花色苷的可提取率與成熟狀況密切相關(guān)。種子成熟指數(shù)(SMI)變幅也較大，為93.5%，說明赤霞珠葡萄果實(shí)種子中單寧含量占果實(shí)單寧總量的比例也與果實(shí)成熟進(jìn)程密切相關(guān)。果實(shí)總酚指數(shù)(TPI)用來反映果實(shí)中總酚的水平，可見樣本中TPI的變幅相對較小，為29.68，說明赤霞珠葡萄果實(shí)成熟期間總酚水平的變化幅度相對較小。

2.3 赤霞珠葡萄果皮質(zhì)地特性的描述性分析

赤霞珠葡萄果皮質(zhì)地特性指標(biāo)包括果皮厚度(Spsk)和表征果皮硬度的3個(gè)指標(biāo)，由表6可見，樣本中果皮厚度的變幅較小，最大值與最小值的差值僅為0.24 mm。而樣本中果皮硬度指標(biāo)的極差均較大，最大的為果皮穿刺能量(Wsk)，為0.83 mJ?？梢姵嘞贾槠咸压麑?shí)成熟期間果皮厚度的變幅較小，而硬度的變化更加明顯。

表6 赤霞珠葡萄樣品質(zhì)地特性(n=72)Table 6 Summary statistics of skin textural properties for Cabernet Sauvignon grapes (n=72)

2.4 相關(guān)性分析

主成分分析各變量的載荷圖(圖1)可見，PC1和PC2 2個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為62.2%。酚類物質(zhì)含量指標(biāo)如總酚(TP)、總花色苷(TA)、可提取花色苷(EA)、總單寧含量(Tmcp、Tah)等均位于PC1的正向端，酚成熟度指標(biāo)CMI也位于PC1正向端，與位于PC1負(fù)向端的TPI、SMI和Wsk等指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。特別是TP、TA、EA以及總單寧含量(Tmcp)等幾個(gè)指標(biāo)與PC1呈正相關(guān)，而SMI與PC2呈負(fù)相關(guān)。除了Spsk、Wsk和CMI 3個(gè)指標(biāo)位于PC2負(fù)向端外，其余所有指標(biāo)均分布在PC2的正向端，且果皮質(zhì)地特性參數(shù)在4個(gè)象限均有分布。另外，果皮厚度(Spsk)在PC1和PC2上的特征向量值均很低，分別為-0.06和0.031，說明果皮厚度和PC1、PC2的相關(guān)性均不強(qiáng)，可能是一個(gè)單獨(dú)的主成分。

為了研究各個(gè)指標(biāo)之間相關(guān)關(guān)系的顯著性，對所有變量進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析，由表7可見，果皮厚度(Spsk)與酚類物質(zhì)含量和酚成熟度指標(biāo)間均無顯著相關(guān)性，果皮穿刺力(Fsk)與總酚指數(shù)(TPI)呈極顯著正相關(guān)，而與細(xì)胞成熟指數(shù)(CMI)呈顯著負(fù)相關(guān)，說明隨表征果皮硬度的果皮穿刺力的增大，果實(shí)細(xì)胞成熟指數(shù)(CMI)值變小。果皮穿刺能量(Wsk)與總酚含量(TP)、單寧含量(Tmcp)、總花色苷含量(TA)、可提取花色苷含量(EA)和細(xì)胞成熟指數(shù)(CMI)均呈現(xiàn)顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)，而與種子成熟指數(shù)(SMI)和總酚指數(shù)(TPI)呈顯著正相關(guān)，該結(jié)果與圖1中顯示的一致。表征果皮硬度的楊氏模量(Esk)與總單寧含量(Tah)呈極顯著正相關(guān)(r=0.348，P<0.001)。相關(guān)性分析表明，赤霞珠葡萄表征果皮硬度的參數(shù)與酚類物質(zhì)含量和果實(shí)酚成熟度之間存在良好的相關(guān)性。

表7 赤霞珠葡萄果皮質(zhì)地特性與酚類物質(zhì)含量及酚成熟度的相關(guān)性Table 7 Correlation between skin textural properties and phenolic maturity,phenolic compound content of Cabernet Sauvignon grapes

圖1 主成分分析載荷Fig.1 PCA loading plot

2.5 多元回歸分析

采用多元線性回歸分析(MLR)，選擇表征赤霞珠葡萄果皮質(zhì)地特性的4個(gè)指標(biāo)作為自變量，酚類物質(zhì)含量和酚成熟度指標(biāo)作為因變量進(jìn)行回歸擬合，最終只有3個(gè)因變量指標(biāo)(CMI、SMI、TA)具有較好的擬合效果(表8)。對因變量CMI和TA而言，赤霞珠果皮質(zhì)地特性相關(guān)的4個(gè)指標(biāo)均是有效的自變量，擬合模型的決定系數(shù)(R2)分別為0.831和0.759。而4個(gè)質(zhì)地特性指標(biāo)中僅有Fsk、Wsk和Esk為酚成熟度指標(biāo)SMI有效的自變量，R2值為0.770，P值均<0.001。3個(gè)擬合模型的決定系數(shù)分別為0.831、0.770和0.759，表示這3個(gè)自變量解釋了相應(yīng)因變量83.1%、77.0%和75.9%的變異性。進(jìn)一步分析的預(yù)測結(jié)果表明(圖2)，預(yù)測模型的預(yù)測值與實(shí)際值具有良好的線性相關(guān)性。

圖2 MLR建模下赤霞珠葡萄果實(shí)酚成熟度和酚類物質(zhì)含量預(yù)測值與實(shí)際值的比較Fig.2 Predicted vs observed values of phenolic maturity and phenolic compound content of Cabernet Sauvignon grapes using MLR modeling

表8 多元回歸分析結(jié)果Table 8 Results of the MLR analysis

3 結(jié)論與討論

釀酒葡萄果實(shí)中的酚類物質(zhì)種類繁多，含量豐富?？偡雍吭谝欢ǔ潭壬峡梢匀妗⒕C合地反映釀酒葡萄原料質(zhì)量的優(yōu)劣及其營養(yǎng)價(jià)值的高低，花色苷和單寧含量也與釀酒葡萄的質(zhì)量密切相關(guān)[22]。本試驗(yàn)采用了2種方法測定葡萄果皮中總單寧的含量，其中采用MCP法測定的單寧含量均高于A-H法，這與張振文等[23]在葡萄酒上的研究結(jié)果一致。2種測定方法造成的差異可能是由于甲基纖維素和蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)結(jié)合能力的不同引起的。目前釀酒葡萄果實(shí)酚成熟度的測定主要是基于各種酚類物質(zhì)的提取率，如CMI、SMI[24]和TPI等[19]。葡萄果實(shí)中花色苷主要位于漿果表皮下3～4層細(xì)胞的液泡里，因此花色苷的提取率與果皮顯微結(jié)構(gòu)、質(zhì)地特性密切相關(guān)。而細(xì)胞成熟指數(shù)(CMI)是漿果中難以提取部分花色苷與總花色苷含量的比值，以衡量葡萄漿果中花色苷的可提取性。前人研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果皮越厚，花色苷越不容易被浸提出來，即CMI值越大；表征果皮硬度的Esk越大，花色苷越容易被浸提出來，即CMI值越小，而本試驗(yàn)的樣本集中2016年和2017年所有葡萄樣品均呈現(xiàn)出與之類似的規(guī)律，與前人研究結(jié)果一致[25,26]。另外，本試驗(yàn)中各產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄的細(xì)胞成熟指數(shù)(CMI)隨著果實(shí)的成熟逐漸增加，與E.Cagnassoetal[19]的研究一致。而總酚指數(shù)(TPI)和種子成熟指數(shù)(SMI)逐漸下降。SMI值在赤霞珠葡萄果實(shí)成熟過程中逐漸降低，說明來自于種子的苦味單寧占的比例越低，葡萄的成熟度也越好[27]。

釀酒葡萄果皮質(zhì)地特性包括果皮厚度和硬度，是表征葡萄果皮物理特性的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中Spsk隨著葡萄果實(shí)的成熟逐漸增加，Wsk的變化趨勢與果皮厚度相反。而Fsk和Esk的最小值、最大值均為同一時(shí)期不同產(chǎn)區(qū)的樣品，說明同時(shí)期不同產(chǎn)區(qū)的Fsk和Esk差異較大。另外，不同產(chǎn)區(qū)同一生長期、同一產(chǎn)區(qū)不同生長期的赤霞珠葡萄樣品其果皮厚度均存在一定的差異性，但是差異相對較小。F.Torchioetal[28]研究發(fā)現(xiàn),不同小產(chǎn)地間Barbera葡萄果皮厚度無顯著性差異，這可能與該試驗(yàn)中葡萄園地間的氣候條件差異較小有關(guān)，也可能與Barbera葡萄品種的果皮發(fā)育特征有關(guān)。硬度表征的是固體物質(zhì)抵抗永久形變的阻力，反映了組織的表面質(zhì)地特性[29]。表征葡萄果皮硬度的3個(gè)參數(shù)：Fsk定義為探針穿透果皮所需要的力，Wsk定義為探針穿透果皮所做的功，為穿刺力和穿刺距離的乘積，說明Wsk除了與果皮穿刺力有關(guān)外，還與果皮的厚度密切相關(guān)；Esk則表征果皮形變的大小，可定義為果皮的剛性，其數(shù)值越大說明果皮越不容易發(fā)生永久形變，即果皮越硬[30]。因?yàn)镋sk與果皮細(xì)胞的密度有關(guān)，不同地區(qū)、不同時(shí)期釀酒葡萄果皮Esk的差異應(yīng)就果皮組織化學(xué)特性進(jìn)行進(jìn)一步研究。

葡萄果皮細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和物理特性很大程度上決定了果皮釋放花色苷的能力[31]。因此，與葡萄果皮細(xì)胞壁組成、結(jié)構(gòu)和組織膨壓等相關(guān)的質(zhì)地分析可以用來評估果皮中花色苷的提取率，從而間接評估果實(shí)中花色苷的含量[10,32]。S.S.Ríoetal[33]也發(fā)現(xiàn)葡萄成熟期間果皮中花色苷的提取率和果皮穿刺力、果皮厚度間呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。本試驗(yàn)的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)sk與CMI呈負(fù)相關(guān)，這與S.R.Segadeetal[18]在Mencía葡萄上的研究結(jié)果一致，說明果皮越硬，花色苷越不容易被提取出來。而果皮中花色苷可提取能力的差異，可能與果皮細(xì)胞壁中的多糖(半乳糖和阿拉伯糖)、纖維素含量以及果膠甲基化程度有關(guān)[12]。本試驗(yàn)中楊氏模量(Esk)與A-H法測得的總單寧含量呈極顯著正相關(guān)(r=0.348，P<0.01)，Wsk與MCP法測定單寧含量之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.511，P<0.01)，說明果皮硬度可以作為預(yù)測果皮單寧含量的指標(biāo)。E.I.Garcíaetal[34]發(fā)現(xiàn)，利用漿果硬度可以預(yù)測丹魄葡萄果皮黃烷醇的含量。由此可見，果皮質(zhì)地特性也可以用于預(yù)測釀酒葡萄果皮中酚類物質(zhì)的含量。

本試驗(yàn)的MLR分析表明，表征赤霞珠果皮厚度的參數(shù)Spsk和表征果皮硬度的3個(gè)參數(shù)Fsk、Wsk、Esk與CMI、SMI和TA等酚成熟度指標(biāo)之間存在顯著的線性回歸關(guān)系，說明4個(gè)質(zhì)地參數(shù)可用于預(yù)測釀酒葡萄赤霞珠果實(shí)的酚成熟度。但是，為了提高預(yù)測準(zhǔn)確性，應(yīng)進(jìn)一步針對不同的葡萄品種、不同產(chǎn)區(qū)建立相應(yīng)的回歸關(guān)系，并篩選更廣泛的果皮質(zhì)地參數(shù)。綜上，本試驗(yàn)研究了釀酒葡萄果皮質(zhì)地特性和酚成熟度的相關(guān)性，建立了酚成熟度與質(zhì)地特性之間的回歸模型，其中預(yù)測效果最好的指標(biāo)是細(xì)胞成熟指數(shù)CMI(R2=0.831)、種子成熟指數(shù)SMI(R2=0.770)和總花色苷含量TA(R2=0.75)，試驗(yàn)結(jié)果為釀酒葡萄果實(shí)酚成熟度快速檢測方法的建立提供了一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。