Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山茱萸葉總?cè)铺崛」に?/h1>
2021-01-26 05:44:48朱登輝張靖柯李孟石靜亞劉娟娟魏俊俊鄭曉珂馮衛(wèi)生
中國(guó)藥房 2021年1期 關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法提取工藝
朱登輝 張靖柯 李孟 石靜亞 劉娟娟 魏俊俊 鄭曉珂 馮衛(wèi)生
摘 要 目的：優(yōu)化山茱萸葉總?cè)铺崛」に?。方法：在山茱萸葉充分溶脹的基礎(chǔ)上，采用加熱回流法提取其總?cè)?。在單因素試?yàn)中考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)山茱萸葉總?cè)坪康挠绊?以齊墩果酸為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總?cè)坪俊Ｔ趩我蛩卦囼?yàn)的基礎(chǔ)上，固定提取次數(shù)為3次，以總?cè)坪繛轫憫?yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間為響應(yīng)因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山茱萸葉總?cè)频奶崛」に嚥⑦M(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：山茱萸葉總?cè)频淖罴烟崛」に嚍橐掖俭w積分?jǐn)?shù)73%、液料比38 ∶ 1（mL/g）、提取時(shí)間60 min。3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，山茱萸葉總?cè)频暮糠謩e為6.92%、6.91%、6.84%，平均含量為6.89%（RSD=0.63%），與預(yù)測(cè)值（7.28%）的相對(duì)誤差為5.36%。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可靠，可用于山茱萸葉總?cè)频奶崛 ?/p>
關(guān)鍵詞 山茱萸葉;總?cè)?Box-Behnken設(shè)計(jì);響應(yīng)面法;提取工藝
ABSTRACT ? OBJECTIVE： To optimize the extraction technology for total triterpenes from the leaves of Cornus officinalis. METHODS： Based on the full swelling of the leaves of C. officinalis， total triterpenes was extracted with heating reflux method. The effects of ethanol concentration， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times on the contents of total triterpenes from the leaves of C. officinalis were investigated by single factor test. Using oleanolic acid as control， the contents of total triterpenes were detected by UV spectrometry. On the basis of single factor test， fixing the times of extraction as 3 times， taking the contents of ?total triterpenes as response value， using ethanol volume fraction， solid-liquid ratio and extraction time as factors， Box-Behnken design-response methodology was used to optimize the extraction technology of total triterpenes from the leaves of C. officinalis， and the optimized extraction technology was validated. RESULTS： The optimal extraction technology of total triterpenes from the leaves of C. officinalis were as follows as ethanol concentration of 73%， liquid-to-material ratio of 38 ∶ 1 （mL/g）， extraction time of 60 min. Results of 3 validation tests showed that the contents of total triterpenes from the leaves of C. officinalis were 6.92%， 6.91%， 6.84%; the average content was 6.89% （RSD=0.63%）， relative error of which with the predicted value （7.28%） was 5.36%. CONCLUSIONS： The optimized technology is stable and reliable， and can be used for the extraction of total triterpenes from leaves of C. officinalis.
KEYWORDS ? Leaves of Cornus officinalis;Total triterpenes;Box-Behnken design; Response surface methodology; Extraction process
山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫的功效，可用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛等癥[1]。該藥主要分布于我國(guó)河南、浙江、湖南等地[2]。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)，山茱萸葉也有藥用價(jià)值，有文獻(xiàn)報(bào)道山茱萸葉具有細(xì)胞毒活性和抗氧化活性[3-5]。但是作為非傳統(tǒng)藥用部位的山茱萸葉在山茱萸果實(shí)采收過(guò)程中多作為廢棄物處理，造成了藥用資源的浪費(fèi)。
本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，山茱萸葉中含有大量三萜類化合物，而三萜類化合物已知的生物活性有保肝、抗菌、降血糖、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、利尿、抗病毒等[6-13]。鑒于此，為擴(kuò)大山茱萸的藥用資源并對(duì)山茱萸葉進(jìn)行開(kāi)發(fā)，本研究以干燥的山茱萸葉為原料，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)山茱萸葉總?cè)频奶崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)影響山茱萸葉總?cè)坪康闹饕蛩剡M(jìn)行分析，為該藥材資源的后續(xù)研究和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
1 材料
1.1 儀器
Evolution 300型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司];OSB-2200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA株式會(huì)社）;BT 25S型電子分析天平（d=0.01 mg，德國(guó)Sartorius公司）;XMTD-6000型三用電熱恒溫水箱（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）。
1.2 藥品與試劑
山茱萸全葉采自河南省南陽(yáng)市西峽縣山茱萸GAP種植基地，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為真品，曬干后于陰涼干燥處保存，備用;齊墩果酸對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-12041606，純度：≥98%）;95%醫(yī)用乙醇（衛(wèi)輝市眾誠(chéng)消毒制劑有限公司）;香草醛（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）;冰醋酸（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）;高氯酸（分析純，天津政成化學(xué)制品有限公司）;甲醇（色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）;乙酸乙酯（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）;水為蒸餾水。
2 方法與結(jié)果
2.1 總?cè)坪繙y(cè)定方法的確定
根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中三萜含量測(cè)定的方法與對(duì)照品的選擇[1]，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14]，確定本研究以齊墩果酸為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定山茱萸葉中總?cè)频暮俊?/p>
2.2 溶液的制備
2.2.1 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品20.00 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為800.00 μg/mL的齊墩果酸對(duì)照品貯備液。
2.2.2 供試品溶液的制備 取山茱萸葉，粉碎，稱取粗粉5.00 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇200 mL，靜置10 min使其充分溶脹。待溶脹完全后，將圓底燒瓶置于500 mL加熱套中，加熱至沸騰，加熱回流提取30 min。提取完畢后將提取液靜置、冷卻、過(guò)濾除雜。濾液以水浴濃縮干燥并用70%乙醇分散后轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，定容，得到供試品溶液。
2.3 方法學(xué)考察
2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取齊墩果酸對(duì)照品貯備液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL至25 mL量瓶中，以空氣泵吹干，放冷;精密加入5.0%香草醛-冰醋酸溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）0.80 mL、高氯酸3.20 mL，搖勻，70 ℃水浴加熱15 min后再于冰水浴中靜置5 min;取出，精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為4.00、8.00、12.00、16.00、20.00、24.00 μg/mL的系列齊墩果酸對(duì)照品溶液。以相應(yīng)試劑為空白，照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0401紫外-可見(jiàn)分光光度法[15]，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各對(duì)照品溶液的吸光度。以齊墩果酸的質(zhì)量濃度（y，μg/mL）為縱坐標(biāo)、吸光度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.020 3x+0.000 1（R2=0.999 7）。結(jié)果表明，齊墩果酸的質(zhì)量濃度在4.00～24.00 μg/mL內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品貯備液0.50 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，在546 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD=0.08%（n=6），表明儀器精密度良好。
2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液0.10 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法“以空氣泵吹干……精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻”步驟操作，室溫條件下分別于顯色后0、30、60、90、120、150 min時(shí)，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD=0.96%（n=6），表明供試品溶液在制備后室溫放置150 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取山茱萸葉粗粉5.0 g，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法“以空氣泵吹干……精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻”步驟操作，顯色后立即在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算總?cè)坪?。結(jié)果，含量的RSD=0.66%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取“2.3.4”項(xiàng)下制備的供試品溶液（總?cè)瀑|(zhì)量濃度分別為1 407.34、1 412.72、 ? ?1 414.64、1 420.88、1 422.34、1 427.76 μg/mL）各0.10 mL，分置于6個(gè)25 mL量瓶中，分別加入對(duì)照品貯備液各0.20 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為98.8%，RSD=0.69%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。
2.4 山茱萸葉總?cè)坪康臏y(cè)定
精密吸取供試品溶液0.20 mL至25 mL量瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法“以空氣泵吹干……精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻”步驟操作，作為待測(cè)樣品溶液。以相應(yīng)試劑為空白，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定待測(cè)樣品溶液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算山茱萸葉總?cè)频暮俊?/p>
2.5 單因素試驗(yàn)初步篩選總?cè)铺崛」に?/p>
結(jié)合文獻(xiàn)方法[16-18]初步篩選影響總?cè)坪康囊蛩?，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等4個(gè)因素對(duì)總?cè)坪坑绊戄^大，故以總?cè)坪繛橹笜?biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、90%）、液料比[10 ∶ 1、20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1（mL/g）]、提取時(shí)間（30、60、90、120 min）、提取次數(shù)（1、2、3、4次）為因素，在固定其余3個(gè)因素的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定各因素的優(yōu)化區(qū)間，詳見(jiàn)圖1。
2.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 從圖1A可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，山茱萸葉總?cè)坪肯壬仙笙陆?，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，山茱萸葉總?cè)坪窟_(dá)到最高。筆者推測(cè)這是因?yàn)橛坞x三萜類化合物極性小，可溶于乙醇;而三萜皂苷類化合物極性較大，易溶于熱水、乙醇等。因此，當(dāng)提取溶劑中含水量較大時(shí)，總?cè)圃谔崛∪軇┲械娜芙舛仁芟薅荒鼙怀浞痔崛?，?dǎo)致其含量降低;當(dāng)提取溶劑中含水量較小時(shí)，雖因乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而使總?cè)频娜芙舛扔兴黾樱掖俭w積分?jǐn)?shù)過(guò)大又可能會(huì)導(dǎo)致山茱萸葉的溶脹度降低，反而使總?cè)坪拷档蚚19]。
2.5.2 液料比的影響 從圖1B可以看出，隨著液料比的增加，山茱萸葉總?cè)坪恳恢背尸F(xiàn)上升趨勢(shì)，但當(dāng)液料比達(dá)到30 ∶ 1（mL/g）時(shí)這一上升趨勢(shì)趨于平緩。筆者推測(cè)這是因?yàn)殡S著提取溶劑用量的增加，山茱萸葉的溶脹度也會(huì)隨之增大，其中的總?cè)茣?huì)越來(lái)越多地進(jìn)入提取溶劑，最終達(dá)到平衡;另外在總?cè)迫芙舛炔蛔兊那闆r下，提取溶劑用量的增加也會(huì)使總?cè)频奶崛】偭坑兴黾?，但是?dāng)總?cè)坪窟_(dá)到一定程度后，藥材中的總?cè)埔鸦咎崛⊥耆?，再增加液料比也難以使其含量有較大的改變。
2.5.3 提取時(shí)間的影響 從圖1C可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，山茱萸葉總?cè)坪恳恢背尸F(xiàn)上升趨勢(shì)，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到90 min時(shí)這一上升趨勢(shì)趨于平緩。筆者推測(cè)這是因?yàn)閯傞_(kāi)始提取時(shí)，山茱萸葉可能未能夠充分地溶脹，總?cè)频娜艹龆容^低;隨著提取時(shí)間的增加，山茱萸葉的溶脹度逐漸增大，總?cè)拼罅咳艹?但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到90 min左右時(shí)，藥材中的總?cè)埔鸦咎崛⊥耆?，其含量增加趨于平緩?/p>
2.5.4 提取次數(shù)的影響 從圖1D可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，山茱萸葉總?cè)坪砍尸F(xiàn)上升趨勢(shì)，但當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3次時(shí)這一上升趨勢(shì)趨于平緩。筆者推測(cè)這是因?yàn)閯傞_(kāi)始提取時(shí)，提取溶劑能夠和山茱萸葉充分地接觸，故總?cè)坪恐饾u升高;但當(dāng)提取次數(shù)增加到一定程度時(shí)，藥材中的總?cè)埔鸦咎崛⊥耆?，再增加提取次?shù)也難以使總?cè)坪坑休^大改變。
2.6 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化總?cè)铺崛」に?/p>
由單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，山茱萸葉總?cè)坪侩S提取次數(shù)的增加而增加，但是當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次時(shí)，總?cè)坪侩S提取次數(shù)上升的幅度明顯減小，此時(shí)再增加提取次數(shù)對(duì)總?cè)坪康挠绊戄^小。同時(shí)，綜合考慮山茱萸葉總?cè)铺崛〕杀镜葘?shí)際生產(chǎn)問(wèn)題，將提取次數(shù)固定為3次，并以總?cè)坪浚╕）為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）等3個(gè)影響因素為響應(yīng)因素，利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)以優(yōu)化山茱萸葉總?cè)频淖罴烟崛」に?。因素與水平見(jiàn)表1;Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2;方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。
利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，得到山茱萸葉總?cè)坪浚╕）對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）的三元二次回歸方程：Y=7.01+0.55A+0.16B+1.250×10-3C-0.037AB+0.13AC-0.043BC-1.45A2-0.13B2+ 0.16C2。從表3可以看出，失擬項(xiàng)P=0.105 1，說(shuō)明殘差主要由隨機(jī)誤差組成，對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著;交互項(xiàng)AB、AC、BC的P值均大于0.05，說(shuō)明其交互作用較弱;A和A2的P值均小于0.01，說(shuō)明A因素對(duì)總?cè)坪康挠绊懞茱@著;B的P<0.05，說(shuō)明B因素對(duì)總?cè)坪康挠绊戯@著;C的P>0.1，說(shuō)明C因素對(duì)總?cè)坪康挠绊懖伙@著，對(duì)于響應(yīng)值Y的波動(dòng)起次要作用。因此，因素A、B、C對(duì)山茱萸葉總?cè)坪康挠绊懼鞔雾樞驗(yàn)椋篈>B>C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>液料比>提取時(shí)間。
在其他因素不變的情況下，選取2個(gè)交互因素對(duì)山茱萸葉總?cè)坪窟M(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖（詳見(jiàn)圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用顯著，即這2個(gè)因素的交互作用對(duì)山茱萸葉總?cè)坪康挠绊戯@著;此外，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的交互作用較顯著，液料比與提取時(shí)間的交互作用不顯著。
由圖2A可知，固定液料比時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總?cè)坪肯壬吆蠼档?，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%～74%時(shí)其含量達(dá)到最大值;固定乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，隨液料比的增大，總?cè)坪孔兓幻黠@。同時(shí)，等高線沿B軸變化相對(duì)密集，明顯密于A軸方向，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)響應(yīng)值峰值的影響比液料比大。由圖2B可知，液料比與提取次數(shù)的交互作用不顯著。固定液料比時(shí)，隨提取時(shí)間的變化，總?cè)坪繘](méi)有明顯改變;固定提取時(shí)間時(shí)，隨液料比的增加，總?cè)坪恳矝](méi)有發(fā)生明顯的變化。從圖2C可知，固定提取時(shí)間時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總?cè)坪肯壬吆蠼档停⒃谝掖俭w積分?jǐn)?shù)達(dá)到66%～74%時(shí)其含量達(dá)到最大值;固定乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，隨提取時(shí)間的增加，總?cè)坪坎⑽窗l(fā)生明顯改變。
綜合圖2結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總?cè)坪康挠绊戄^為顯著，提取次數(shù)和液料比對(duì)總?cè)坪康挠绊懖伙@著。這與單因素試驗(yàn)結(jié)論不符。究其原因，這可能與一開(kāi)始將提取次數(shù)定為3次有關(guān)。當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到一定程度時(shí)，山茱萸葉中的總?cè)苹救艹鐾戤?，這時(shí)無(wú)論是增大液料比或者是延長(zhǎng)提取時(shí)間，所能夠提取出的總?cè)苹疽堰_(dá)到峰值，所以才導(dǎo)致液料比與提取時(shí)間的交互作用不顯著;而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山茱萸葉溶脹度的影響較大，可在一定程度上消減提取次數(shù)帶來(lái)的負(fù)面影響，使得乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總?cè)坪咳杂休^為顯著的影響。
2.7 最優(yōu)提取工藝的確定與驗(yàn)證
利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行計(jì)算，得出山茱萸葉總?cè)频淖罴烟崛」に嚍椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)72.67%，液料比38.04 ∶ 1（mL/g），提取時(shí)間60 min;預(yù)測(cè)總?cè)坪繛?.28%。
結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，將該工藝簡(jiǎn)化為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，液料比38 ∶ 1（mL/g），提取時(shí)間60 min。取5.00 g山茱萸葉粗粉，按照該工藝條件進(jìn)行提取，平行操作3次。結(jié)果，總?cè)坪糠謩e為6.92%、6.91%、6.84%，平均含量為6.89%（RSD=0.63%），與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為5.36%。
3 討論
近年來(lái)，一直有學(xué)者進(jìn)行中藥非傳統(tǒng)入藥部位的開(kāi)發(fā)及藥用部位的擴(kuò)大研究，如杜仲葉可以在某些方面代替杜仲（樹(shù)皮）進(jìn)行使用[20]。山茱萸葉作為山茱萸的非傳統(tǒng)藥用部位，雖然表現(xiàn)出了一定的生物活性，但是少有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究，對(duì)山茱萸葉總?cè)频难芯扛酋r見(jiàn)。因此，筆者選用果實(shí)成熟期的山茱萸葉進(jìn)行研究，旨在擴(kuò)大山茱萸的入藥部位，為后續(xù)山茱萸的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ);同時(shí)，選取果實(shí)成熟期的山茱萸葉進(jìn)行研究，可以與山茱萸干燥成熟果實(shí)中的總?cè)坪孔鞅容^，為后續(xù)研究提供參考。
響應(yīng)面法是一種綜合設(shè)計(jì)試驗(yàn)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測(cè)值精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于中藥工藝領(lǐng)域[21-22]。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山茱萸葉總?cè)频奶崛」に?，以期得到一種高效的提取方法。研究結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山茱萸葉總?cè)坪烤哂酗@著影響，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%左右時(shí)，山茱萸葉總?cè)坪窟_(dá)到最大值。這一方面是因?yàn)樗梢栽黾由杰镙侨~的溶脹度，另一方面是因?yàn)橐掖紝?duì)已溶脹的山茱萸葉中的游離三萜和三萜皂苷均有良好的溶解性，但是醇類溶劑又會(huì)降低山茱萸葉的溶脹度。綜合可得，70%的含水乙醇可最大程度地將山茱萸葉總?cè)铺崛〕鰜?lái)。
本研究也有不足之處，如將提取次數(shù)固定為3次雖然能夠最大程度地提取出山茱萸葉中的總?cè)?，但這也使得在改變液料比或提取時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，提取液中的總?cè)坪慷驾^為接近山茱萸葉所含總?cè)瓶偭?，從而?dǎo)致液料比或提取時(shí)間對(duì)總?cè)坪康挠绊懢伙@著。而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山茱萸葉溶脹度的影響較大，因而其對(duì)總?cè)坪咳杂休^為顯著的影響。
綜上所述，本研究選用加熱回流提取法，在研究不同單因素條件對(duì)山茱萸葉總?cè)坪坑绊懙幕A(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)，得到乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間與山茱萸葉總?cè)坪康幕貧w模型，并對(duì)不同因素的交互作用與山茱萸葉總?cè)坪康年P(guān)系進(jìn)行了響應(yīng)面分析，得到各影響因素對(duì)山茱萸葉總?cè)坪康挠绊懘笮椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)>液料比>提取時(shí)間;所建立的回歸模型較為合理，能夠用于預(yù)測(cè)山茱萸葉總?cè)频暮?驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在一個(gè)相對(duì)合理的范圍，說(shuō)明該優(yōu)化工藝較為穩(wěn)定、可靠，可用于山茱萸葉總?cè)频奶崛 ?/p>
參考文獻(xiàn)
[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：29、196.
[ 2 ] 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，1990：84.
[ 3 ] LI YC，JING Y，WU XG，et al. Three new iridoids from leaves of Cornus officinalis[J]. J Asian Nat Prod Res，2015，17（8）：788-792.
[ 4 ] 李玥彤，隋怡，郝曉偉，等.山茱萸葉多糖的理化性質(zhì)和抗氧化活性[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，47（8）：109-116、143.
[ 5 ] 孫建瑞，趙君峰，原江鋒，等.響應(yīng)面法優(yōu)化豫西山茱萸葉黃酮的提取及其抑菌和抗氧化活性[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2020，32（4）：672-680.
[ 6 ] CHIU HF，F(xiàn)U HY，LU YY，et al. Triterpenoids and polysaccharide peptides-enriched Ganoderma lucidum：a randomized，double-blind placebo-controlled crossover study of its antioxidation and hepatoprotect efficacy in healthy volunteers[J]. Pharm Biol，2017，55（1）：1041-1046.
[ 7 ] 常霞，景炳年，范毅，等.金銀花總?cè)铺崛」に嚰捌淇咕寡趸钚訹J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（16）：198-202.
[ 8 ] 王婧茹，趙晶晶，葉春玲，等.番石榴葉總?cè)茖?duì)2型糖尿病大鼠的降血糖和血脂作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2012，28（6）：1109-1113.
[ 9 ] 王亞紅，劉芮含，周明，等.瓦松總?cè)瞥煞殖曁崛」に噧?yōu)化及抗氧化活性分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（9）：3988-3995.
[10] 李小妹，賀君宇，李爽，等.木瓜總?cè)茖?duì)非甾體抗炎藥誘導(dǎo)大鼠小腸損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2018，34（5）：55-60.
[11] 崔仙紅，張鵬，朱笛.茯苓三萜類化合物藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2019，14（12）：123-125.
[12] ZHANG X，LI XY，LIN N，et al. Diuretic activity of compatible triterpene components of Alismatis rhizoma[J]. Molecules，2017. DOI：10.3390/molecules22091459.
[13] 劉美紅，李帥嵐，張蓮，等.女貞屬植物的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].中草藥，2020，51（12）：3337-3348.
[14] 洪赫彤，楚東海，孫洋洋，等.響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞子中總?cè)祁惓煞趾繙y(cè)定的方法研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2019，46（4）：799-802.
[15] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：39-40.
[16] 魏磊，李曉，王學(xué)方，等.紫蘇葉總?cè)瞥曁崛」に噧?yōu)化及對(duì)10種常見(jiàn)致病菌的抑菌作用研究[J].中國(guó)藥房，2018，29（16）：2193-2197.
[17] 段麗萍，孫煒煒，苗麗坤，等.艾葉總?cè)频奶崛」に噧?yōu)化及其抑菌活性[J].現(xiàn)代食品科技，2020，36（5）：88-95.
[18] 檀琪，阮文輝，楊官娥，等.響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌總?cè)苹亓魈崛」に嘯J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，51（1）：99-104.
[19] 李曉斌，陳振斌，楊旸，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化槐葉中黃酮類化合物的提取工藝[J].中國(guó)藥房，2015，26（7）：960- 964.
[20] 郭姝，劉杰，李娜，等.指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)杜仲葉代替杜仲皮的可行性[J/OL].中藥材，2020. DOI：10. 13863/j.issn1001-4454.2020.04.022.
[21] 李莉，張賽，何強(qiáng)，等.響應(yīng)面法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2015，34（8）：41-45.
[22] 萬(wàn)丹娜，饒倩如，俞夢(mèng)瑩，等. Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山楂的醇沉工藝[J].中國(guó)藥房，2018，29（15）：2078-2081.
（收稿日期：2020-06-29 修回日期：2020-09-11）
（編輯：胡曉霖）
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朱登輝 張靖柯 李孟 石靜亞 劉娟娟 魏俊俊 鄭曉珂 馮衛(wèi)生
摘 要 目的：優(yōu)化山茱萸葉總?cè)铺崛」に?。方法：在山茱萸葉充分溶脹的基礎(chǔ)上，采用加熱回流法提取其總?cè)?。在單因素試?yàn)中考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)山茱萸葉總?cè)坪康挠绊?以齊墩果酸為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總?cè)坪俊Ｔ趩我蛩卦囼?yàn)的基礎(chǔ)上，固定提取次數(shù)為3次，以總?cè)坪繛轫憫?yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間為響應(yīng)因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山茱萸葉總?cè)频奶崛」に嚥⑦M(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：山茱萸葉總?cè)频淖罴烟崛」に嚍橐掖俭w積分?jǐn)?shù)73%、液料比38 ∶ 1（mL/g）、提取時(shí)間60 min。3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，山茱萸葉總?cè)频暮糠謩e為6.92%、6.91%、6.84%，平均含量為6.89%（RSD=0.63%），與預(yù)測(cè)值（7.28%）的相對(duì)誤差為5.36%。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可靠，可用于山茱萸葉總?cè)频奶崛 ?/p>
關(guān)鍵詞 山茱萸葉;總?cè)?Box-Behnken設(shè)計(jì);響應(yīng)面法;提取工藝
ABSTRACT ? OBJECTIVE： To optimize the extraction technology for total triterpenes from the leaves of Cornus officinalis. METHODS： Based on the full swelling of the leaves of C. officinalis， total triterpenes was extracted with heating reflux method. The effects of ethanol concentration， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times on the contents of total triterpenes from the leaves of C. officinalis were investigated by single factor test. Using oleanolic acid as control， the contents of total triterpenes were detected by UV spectrometry. On the basis of single factor test， fixing the times of extraction as 3 times， taking the contents of ?total triterpenes as response value， using ethanol volume fraction， solid-liquid ratio and extraction time as factors， Box-Behnken design-response methodology was used to optimize the extraction technology of total triterpenes from the leaves of C. officinalis， and the optimized extraction technology was validated. RESULTS： The optimal extraction technology of total triterpenes from the leaves of C. officinalis were as follows as ethanol concentration of 73%， liquid-to-material ratio of 38 ∶ 1 （mL/g）， extraction time of 60 min. Results of 3 validation tests showed that the contents of total triterpenes from the leaves of C. officinalis were 6.92%， 6.91%， 6.84%; the average content was 6.89% （RSD=0.63%）， relative error of which with the predicted value （7.28%） was 5.36%. CONCLUSIONS： The optimized technology is stable and reliable， and can be used for the extraction of total triterpenes from leaves of C. officinalis.
KEYWORDS ? Leaves of Cornus officinalis;Total triterpenes;Box-Behnken design; Response surface methodology; Extraction process
山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫的功效，可用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛等癥[1]。該藥主要分布于我國(guó)河南、浙江、湖南等地[2]。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)，山茱萸葉也有藥用價(jià)值，有文獻(xiàn)報(bào)道山茱萸葉具有細(xì)胞毒活性和抗氧化活性[3-5]。但是作為非傳統(tǒng)藥用部位的山茱萸葉在山茱萸果實(shí)采收過(guò)程中多作為廢棄物處理，造成了藥用資源的浪費(fèi)。
本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，山茱萸葉中含有大量三萜類化合物，而三萜類化合物已知的生物活性有保肝、抗菌、降血糖、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、利尿、抗病毒等[6-13]。鑒于此，為擴(kuò)大山茱萸的藥用資源并對(duì)山茱萸葉進(jìn)行開(kāi)發(fā)，本研究以干燥的山茱萸葉為原料，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)山茱萸葉總?cè)频奶崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)影響山茱萸葉總?cè)坪康闹饕蛩剡M(jìn)行分析，為該藥材資源的后續(xù)研究和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
1 材料
1.1 儀器
Evolution 300型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司];OSB-2200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA株式會(huì)社）;BT 25S型電子分析天平（d=0.01 mg，德國(guó)Sartorius公司）;XMTD-6000型三用電熱恒溫水箱（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）。
1.2 藥品與試劑
山茱萸全葉采自河南省南陽(yáng)市西峽縣山茱萸GAP種植基地，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為真品，曬干后于陰涼干燥處保存，備用;齊墩果酸對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-12041606，純度：≥98%）;95%醫(yī)用乙醇（衛(wèi)輝市眾誠(chéng)消毒制劑有限公司）;香草醛（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）;冰醋酸（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）;高氯酸（分析純，天津政成化學(xué)制品有限公司）;甲醇（色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）;乙酸乙酯（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）;水為蒸餾水。
2 方法與結(jié)果
2.1 總?cè)坪繙y(cè)定方法的確定
根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中三萜含量測(cè)定的方法與對(duì)照品的選擇[1]，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14]，確定本研究以齊墩果酸為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定山茱萸葉中總?cè)频暮俊?/p>
2.2 溶液的制備
2.2.1 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品20.00 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為800.00 μg/mL的齊墩果酸對(duì)照品貯備液。
2.2.2 供試品溶液的制備 取山茱萸葉，粉碎，稱取粗粉5.00 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇200 mL，靜置10 min使其充分溶脹。待溶脹完全后，將圓底燒瓶置于500 mL加熱套中，加熱至沸騰，加熱回流提取30 min。提取完畢后將提取液靜置、冷卻、過(guò)濾除雜。濾液以水浴濃縮干燥并用70%乙醇分散后轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，定容，得到供試品溶液。
2.3 方法學(xué)考察
2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取齊墩果酸對(duì)照品貯備液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL至25 mL量瓶中，以空氣泵吹干，放冷;精密加入5.0%香草醛-冰醋酸溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）0.80 mL、高氯酸3.20 mL，搖勻，70 ℃水浴加熱15 min后再于冰水浴中靜置5 min;取出，精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為4.00、8.00、12.00、16.00、20.00、24.00 μg/mL的系列齊墩果酸對(duì)照品溶液。以相應(yīng)試劑為空白，照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0401紫外-可見(jiàn)分光光度法[15]，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各對(duì)照品溶液的吸光度。以齊墩果酸的質(zhì)量濃度（y，μg/mL）為縱坐標(biāo)、吸光度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.020 3x+0.000 1（R2=0.999 7）。結(jié)果表明，齊墩果酸的質(zhì)量濃度在4.00～24.00 μg/mL內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品貯備液0.50 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，在546 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD=0.08%（n=6），表明儀器精密度良好。
2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液0.10 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法“以空氣泵吹干……精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻”步驟操作，室溫條件下分別于顯色后0、30、60、90、120、150 min時(shí)，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD=0.96%（n=6），表明供試品溶液在制備后室溫放置150 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取山茱萸葉粗粉5.0 g，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法“以空氣泵吹干……精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻”步驟操作，顯色后立即在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算總?cè)坪?。結(jié)果，含量的RSD=0.66%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取“2.3.4”項(xiàng)下制備的供試品溶液（總?cè)瀑|(zhì)量濃度分別為1 407.34、1 412.72、 ? ?1 414.64、1 420.88、1 422.34、1 427.76 μg/mL）各0.10 mL，分置于6個(gè)25 mL量瓶中，分別加入對(duì)照品貯備液各0.20 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為98.8%，RSD=0.69%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。
2.4 山茱萸葉總?cè)坪康臏y(cè)定
精密吸取供試品溶液0.20 mL至25 mL量瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法“以空氣泵吹干……精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻”步驟操作，作為待測(cè)樣品溶液。以相應(yīng)試劑為空白，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定待測(cè)樣品溶液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算山茱萸葉總?cè)频暮俊?/p>
2.5 單因素試驗(yàn)初步篩選總?cè)铺崛」に?/p>
結(jié)合文獻(xiàn)方法[16-18]初步篩選影響總?cè)坪康囊蛩?，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等4個(gè)因素對(duì)總?cè)坪坑绊戄^大，故以總?cè)坪繛橹笜?biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、90%）、液料比[10 ∶ 1、20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1（mL/g）]、提取時(shí)間（30、60、90、120 min）、提取次數(shù)（1、2、3、4次）為因素，在固定其余3個(gè)因素的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定各因素的優(yōu)化區(qū)間，詳見(jiàn)圖1。
2.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 從圖1A可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，山茱萸葉總?cè)坪肯壬仙笙陆?，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，山茱萸葉總?cè)坪窟_(dá)到最高。筆者推測(cè)這是因?yàn)橛坞x三萜類化合物極性小，可溶于乙醇;而三萜皂苷類化合物極性較大，易溶于熱水、乙醇等。因此，當(dāng)提取溶劑中含水量較大時(shí)，總?cè)圃谔崛∪軇┲械娜芙舛仁芟薅荒鼙怀浞痔崛?，?dǎo)致其含量降低;當(dāng)提取溶劑中含水量較小時(shí)，雖因乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而使總?cè)频娜芙舛扔兴黾樱掖俭w積分?jǐn)?shù)過(guò)大又可能會(huì)導(dǎo)致山茱萸葉的溶脹度降低，反而使總?cè)坪拷档蚚19]。
2.5.2 液料比的影響 從圖1B可以看出，隨著液料比的增加，山茱萸葉總?cè)坪恳恢背尸F(xiàn)上升趨勢(shì)，但當(dāng)液料比達(dá)到30 ∶ 1（mL/g）時(shí)這一上升趨勢(shì)趨于平緩。筆者推測(cè)這是因?yàn)殡S著提取溶劑用量的增加，山茱萸葉的溶脹度也會(huì)隨之增大，其中的總?cè)茣?huì)越來(lái)越多地進(jìn)入提取溶劑，最終達(dá)到平衡;另外在總?cè)迫芙舛炔蛔兊那闆r下，提取溶劑用量的增加也會(huì)使總?cè)频奶崛】偭坑兴黾?，但是?dāng)總?cè)坪窟_(dá)到一定程度后，藥材中的總?cè)埔鸦咎崛⊥耆?，再增加液料比也難以使其含量有較大的改變。
2.5.3 提取時(shí)間的影響 從圖1C可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，山茱萸葉總?cè)坪恳恢背尸F(xiàn)上升趨勢(shì)，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到90 min時(shí)這一上升趨勢(shì)趨于平緩。筆者推測(cè)這是因?yàn)閯傞_(kāi)始提取時(shí)，山茱萸葉可能未能夠充分地溶脹，總?cè)频娜艹龆容^低;隨著提取時(shí)間的增加，山茱萸葉的溶脹度逐漸增大，總?cè)拼罅咳艹?但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到90 min左右時(shí)，藥材中的總?cè)埔鸦咎崛⊥耆?，其含量增加趨于平緩?/p>
2.5.4 提取次數(shù)的影響 從圖1D可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，山茱萸葉總?cè)坪砍尸F(xiàn)上升趨勢(shì)，但當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3次時(shí)這一上升趨勢(shì)趨于平緩。筆者推測(cè)這是因?yàn)閯傞_(kāi)始提取時(shí)，提取溶劑能夠和山茱萸葉充分地接觸，故總?cè)坪恐饾u升高;但當(dāng)提取次數(shù)增加到一定程度時(shí)，藥材中的總?cè)埔鸦咎崛⊥耆?，再增加提取次?shù)也難以使總?cè)坪坑休^大改變。
2.6 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化總?cè)铺崛」に?/p>
由單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，山茱萸葉總?cè)坪侩S提取次數(shù)的增加而增加，但是當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次時(shí)，總?cè)坪侩S提取次數(shù)上升的幅度明顯減小，此時(shí)再增加提取次數(shù)對(duì)總?cè)坪康挠绊戄^小。同時(shí)，綜合考慮山茱萸葉總?cè)铺崛〕杀镜葘?shí)際生產(chǎn)問(wèn)題，將提取次數(shù)固定為3次，并以總?cè)坪浚╕）為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）等3個(gè)影響因素為響應(yīng)因素，利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)以優(yōu)化山茱萸葉總?cè)频淖罴烟崛」に?。因素與水平見(jiàn)表1;Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2;方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。
利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，得到山茱萸葉總?cè)坪浚╕）對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）的三元二次回歸方程：Y=7.01+0.55A+0.16B+1.250×10-3C-0.037AB+0.13AC-0.043BC-1.45A2-0.13B2+ 0.16C2。從表3可以看出，失擬項(xiàng)P=0.105 1，說(shuō)明殘差主要由隨機(jī)誤差組成，對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著;交互項(xiàng)AB、AC、BC的P值均大于0.05，說(shuō)明其交互作用較弱;A和A2的P值均小于0.01，說(shuō)明A因素對(duì)總?cè)坪康挠绊懞茱@著;B的P<0.05，說(shuō)明B因素對(duì)總?cè)坪康挠绊戯@著;C的P>0.1，說(shuō)明C因素對(duì)總?cè)坪康挠绊懖伙@著，對(duì)于響應(yīng)值Y的波動(dòng)起次要作用。因此，因素A、B、C對(duì)山茱萸葉總?cè)坪康挠绊懼鞔雾樞驗(yàn)椋篈>B>C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>液料比>提取時(shí)間。
在其他因素不變的情況下，選取2個(gè)交互因素對(duì)山茱萸葉總?cè)坪窟M(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖（詳見(jiàn)圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用顯著，即這2個(gè)因素的交互作用對(duì)山茱萸葉總?cè)坪康挠绊戯@著;此外，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的交互作用較顯著，液料比與提取時(shí)間的交互作用不顯著。
由圖2A可知，固定液料比時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總?cè)坪肯壬吆蠼档?，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%～74%時(shí)其含量達(dá)到最大值;固定乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，隨液料比的增大，總?cè)坪孔兓幻黠@。同時(shí)，等高線沿B軸變化相對(duì)密集，明顯密于A軸方向，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)響應(yīng)值峰值的影響比液料比大。由圖2B可知，液料比與提取次數(shù)的交互作用不顯著。固定液料比時(shí)，隨提取時(shí)間的變化，總?cè)坪繘](méi)有明顯改變;固定提取時(shí)間時(shí)，隨液料比的增加，總?cè)坪恳矝](méi)有發(fā)生明顯的變化。從圖2C可知，固定提取時(shí)間時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總?cè)坪肯壬吆蠼档停⒃谝掖俭w積分?jǐn)?shù)達(dá)到66%～74%時(shí)其含量達(dá)到最大值;固定乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，隨提取時(shí)間的增加，總?cè)坪坎⑽窗l(fā)生明顯改變。
綜合圖2結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總?cè)坪康挠绊戄^為顯著，提取次數(shù)和液料比對(duì)總?cè)坪康挠绊懖伙@著。這與單因素試驗(yàn)結(jié)論不符。究其原因，這可能與一開(kāi)始將提取次數(shù)定為3次有關(guān)。當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到一定程度時(shí)，山茱萸葉中的總?cè)苹救艹鐾戤?，這時(shí)無(wú)論是增大液料比或者是延長(zhǎng)提取時(shí)間，所能夠提取出的總?cè)苹疽堰_(dá)到峰值，所以才導(dǎo)致液料比與提取時(shí)間的交互作用不顯著;而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山茱萸葉溶脹度的影響較大，可在一定程度上消減提取次數(shù)帶來(lái)的負(fù)面影響，使得乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總?cè)坪咳杂休^為顯著的影響。
2.7 最優(yōu)提取工藝的確定與驗(yàn)證
利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行計(jì)算，得出山茱萸葉總?cè)频淖罴烟崛」に嚍椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)72.67%，液料比38.04 ∶ 1（mL/g），提取時(shí)間60 min;預(yù)測(cè)總?cè)坪繛?.28%。
結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，將該工藝簡(jiǎn)化為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，液料比38 ∶ 1（mL/g），提取時(shí)間60 min。取5.00 g山茱萸葉粗粉，按照該工藝條件進(jìn)行提取，平行操作3次。結(jié)果，總?cè)坪糠謩e為6.92%、6.91%、6.84%，平均含量為6.89%（RSD=0.63%），與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為5.36%。
3 討論
近年來(lái)，一直有學(xué)者進(jìn)行中藥非傳統(tǒng)入藥部位的開(kāi)發(fā)及藥用部位的擴(kuò)大研究，如杜仲葉可以在某些方面代替杜仲（樹(shù)皮）進(jìn)行使用[20]。山茱萸葉作為山茱萸的非傳統(tǒng)藥用部位，雖然表現(xiàn)出了一定的生物活性，但是少有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究，對(duì)山茱萸葉總?cè)频难芯扛酋r見(jiàn)。因此，筆者選用果實(shí)成熟期的山茱萸葉進(jìn)行研究，旨在擴(kuò)大山茱萸的入藥部位，為后續(xù)山茱萸的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ);同時(shí)，選取果實(shí)成熟期的山茱萸葉進(jìn)行研究，可以與山茱萸干燥成熟果實(shí)中的總?cè)坪孔鞅容^，為后續(xù)研究提供參考。
響應(yīng)面法是一種綜合設(shè)計(jì)試驗(yàn)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測(cè)值精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于中藥工藝領(lǐng)域[21-22]。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山茱萸葉總?cè)频奶崛」に?，以期得到一種高效的提取方法。研究結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山茱萸葉總?cè)坪烤哂酗@著影響，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%左右時(shí)，山茱萸葉總?cè)坪窟_(dá)到最大值。這一方面是因?yàn)樗梢栽黾由杰镙侨~的溶脹度，另一方面是因?yàn)橐掖紝?duì)已溶脹的山茱萸葉中的游離三萜和三萜皂苷均有良好的溶解性，但是醇類溶劑又會(huì)降低山茱萸葉的溶脹度。綜合可得，70%的含水乙醇可最大程度地將山茱萸葉總?cè)铺崛〕鰜?lái)。
本研究也有不足之處，如將提取次數(shù)固定為3次雖然能夠最大程度地提取出山茱萸葉中的總?cè)?，但這也使得在改變液料比或提取時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，提取液中的總?cè)坪慷驾^為接近山茱萸葉所含總?cè)瓶偭?，從而?dǎo)致液料比或提取時(shí)間對(duì)總?cè)坪康挠绊懢伙@著。而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山茱萸葉溶脹度的影響較大，因而其對(duì)總?cè)坪咳杂休^為顯著的影響。
綜上所述，本研究選用加熱回流提取法，在研究不同單因素條件對(duì)山茱萸葉總?cè)坪坑绊懙幕A(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)，得到乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間與山茱萸葉總?cè)坪康幕貧w模型，并對(duì)不同因素的交互作用與山茱萸葉總?cè)坪康年P(guān)系進(jìn)行了響應(yīng)面分析，得到各影響因素對(duì)山茱萸葉總?cè)坪康挠绊懘笮椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)>液料比>提取時(shí)間;所建立的回歸模型較為合理，能夠用于預(yù)測(cè)山茱萸葉總?cè)频暮?驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在一個(gè)相對(duì)合理的范圍，說(shuō)明該優(yōu)化工藝較為穩(wěn)定、可靠，可用于山茱萸葉總?cè)频奶崛 ?/p>
參考文獻(xiàn)
[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：29、196.
[ 2 ] 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，1990：84.
[ 3 ] LI YC，JING Y，WU XG，et al. Three new iridoids from leaves of Cornus officinalis[J]. J Asian Nat Prod Res，2015，17（8）：788-792.
[ 4 ] 李玥彤，隋怡，郝曉偉，等.山茱萸葉多糖的理化性質(zhì)和抗氧化活性[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，47（8）：109-116、143.
[ 5 ] 孫建瑞，趙君峰，原江鋒，等.響應(yīng)面法優(yōu)化豫西山茱萸葉黃酮的提取及其抑菌和抗氧化活性[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2020，32（4）：672-680.
[ 6 ] CHIU HF，F(xiàn)U HY，LU YY，et al. Triterpenoids and polysaccharide peptides-enriched Ganoderma lucidum：a randomized，double-blind placebo-controlled crossover study of its antioxidation and hepatoprotect efficacy in healthy volunteers[J]. Pharm Biol，2017，55（1）：1041-1046.
[ 7 ] 常霞，景炳年，范毅，等.金銀花總?cè)铺崛」に嚰捌淇咕寡趸钚訹J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（16）：198-202.
[ 8 ] 王婧茹，趙晶晶，葉春玲，等.番石榴葉總?cè)茖?duì)2型糖尿病大鼠的降血糖和血脂作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2012，28（6）：1109-1113.
[ 9 ] 王亞紅，劉芮含，周明，等.瓦松總?cè)瞥煞殖曁崛」に噧?yōu)化及抗氧化活性分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（9）：3988-3995.
[10] 李小妹，賀君宇，李爽，等.木瓜總?cè)茖?duì)非甾體抗炎藥誘導(dǎo)大鼠小腸損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2018，34（5）：55-60.
[11] 崔仙紅，張鵬，朱笛.茯苓三萜類化合物藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2019，14（12）：123-125.
[12] ZHANG X，LI XY，LIN N，et al. Diuretic activity of compatible triterpene components of Alismatis rhizoma[J]. Molecules，2017. DOI：10.3390/molecules22091459.
[13] 劉美紅，李帥嵐，張蓮，等.女貞屬植物的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].中草藥，2020，51（12）：3337-3348.
[14] 洪赫彤，楚東海，孫洋洋，等.響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞子中總?cè)祁惓煞趾繙y(cè)定的方法研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2019，46（4）：799-802.
[15] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：39-40.
[16] 魏磊，李曉，王學(xué)方，等.紫蘇葉總?cè)瞥曁崛」に噧?yōu)化及對(duì)10種常見(jiàn)致病菌的抑菌作用研究[J].中國(guó)藥房，2018，29（16）：2193-2197.
[17] 段麗萍，孫煒煒，苗麗坤，等.艾葉總?cè)频奶崛」に噧?yōu)化及其抑菌活性[J].現(xiàn)代食品科技，2020，36（5）：88-95.
[18] 檀琪，阮文輝，楊官娥，等.響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌總?cè)苹亓魈崛」に嘯J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，51（1）：99-104.
[19] 李曉斌，陳振斌，楊旸，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化槐葉中黃酮類化合物的提取工藝[J].中國(guó)藥房，2015，26（7）：960- 964.
[20] 郭姝，劉杰，李娜，等.指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)杜仲葉代替杜仲皮的可行性[J/OL].中藥材，2020. DOI：10. 13863/j.issn1001-4454.2020.04.022.
[21] 李莉，張賽，何強(qiáng)，等.響應(yīng)面法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2015，34（8）：41-45.
[22] 萬(wàn)丹娜，饒倩如，俞夢(mèng)瑩，等. Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山楂的醇沉工藝[J].中國(guó)藥房，2018，29（15）：2078-2081.
（收稿日期：2020-06-29 修回日期：2020-09-11）
（編輯：胡曉霖）
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