孫亞偉，加依娜古麗·吐爾遜拜，張永鵬，閆向民，李宏波，王金泉，姚 剛，張 楊

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院 畜牧研究所，烏魯木齊 830011)

新疆褐牛是中國利用優(yōu)秀遺傳資源結(jié)合特殊的自然地理條件，以瑞士褐牛和含有瑞士褐牛血統(tǒng)的阿拉塔烏牛與新疆本地哈薩克牛進(jìn)行長期雜交選育的肉乳兼用型牛，其群體具備適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、生長發(fā)育速度快和產(chǎn)肉性能高等優(yōu)良特性。目前，這一品種及其雜種牛的數(shù)量已占全疆牛數(shù)的70%左右。與其他品種或其雜種后代相比，它更適宜于在新疆山區(qū)、牧區(qū)、半牧區(qū)和農(nóng)區(qū)養(yǎng)殖。但這些地方品種牛的肉品質(zhì)與優(yōu)質(zhì)高檔牛肉相比還存在一定差距，研究其肉品質(zhì)相關(guān)經(jīng)濟(jì)性狀，挖掘地方品種潛在的遺傳資源優(yōu)勢，對改良地方肉牛品種、促進(jìn)地區(qū)肉牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1950年Ingalls等[1]研究發(fā)現(xiàn)瘦素基因(Leptin)。瘦素是由Leptin基因編碼的蛋白質(zhì)激素，主要由脂肪細(xì)胞合成和分泌，作用于動物體中樞和外周組織，具有調(diào)節(jié)動物采食、調(diào)控機(jī)體能量代謝和脂肪代謝的作用[2]。牛的Leptin基因定位于4號染色體上[3]，包括2個內(nèi)含子和3個外顯子，但只有第2、3外顯子編碼氨基酸，成熟的瘦素蛋白由146個氨基酸組成[4]。國內(nèi)外有關(guān)牛Leptin基因的研究報道大多集中在血液瘦素水平[5-7]，以及Leptin基因與體脂含量[8-9]、采食量、產(chǎn)奶量[10-11]和繁殖性狀[12-13]的相關(guān)性等方面。近幾年，大量研究已經(jīng)證實Leptin基因會對肌肉脂肪含量和嫩度等肉質(zhì)性狀產(chǎn)生影響。Fitzsimmons等[14]以海福特、安格斯、夏洛來和西門塔爾牛為對象，發(fā)現(xiàn)Leptin基因3′端存在SNPs，且與牛肉脂肪沉積存在相關(guān)關(guān)系；Buchanan等[15]發(fā)現(xiàn)Leptin基因C73T位點(diǎn)突變與成牛胴體脂肪沉積有關(guān)；Schenkel等[16]研究雜交肉牛Leptin基因的結(jié)果表明，第2外顯子E2JW和E2FB位點(diǎn)與脂肪和瘦肉含量有關(guān)，且在肌肉嫩度性狀上存在互作效應(yīng)；目前關(guān)于新疆褐牛生長性狀研究較多，關(guān)于Leptin基因與肉品質(zhì)研究較少，且群體數(shù)量較少，未見報道。本研究將Leptin基因作為研究牛肉品質(zhì)等性狀的候選基因，以新疆褐牛群體為研究對象，利用PCR-RFLP方法檢測新疆褐牛群體中Leptin基因第2外顯子序列的多態(tài)性，并分析其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)關(guān)系，為進(jìn)一步生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高檔牛肉提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及基因組DNA提取

樣品采自新疆伊犁西天山農(nóng)牧發(fā)展有限責(zé)任公司，選取268頭18月齡左右、健康且體況相近的褐牛，在相同的營養(yǎng)水平和管理條件下育肥。其中30頭用于脂肪及脂肪酸、氨基酸、肌苷酸、羥脯胺酸的含量測定。屠宰后在第12～13肋骨間采集背最長肌500 g左右，冷凍保存。每頭牛頸靜脈采血6～8 mL，加入1 mL ACD抗凝， -20 ℃保存。采用常規(guī)酚/氯仿提取法提取血液基因組DNA。

1.2 引物設(shè)計與PCR反應(yīng)體系

根據(jù)EMBL(AY138588、AJ512638)[17]已經(jīng)發(fā)表的牛Leptin基因外顯子2 E2JW、E2FB位點(diǎn)序列，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計引物，并引入限制性內(nèi)切酶CIaI和Kpn2I酶切位點(diǎn)(下劃線為酶切位點(diǎn))，引物分別為上游：5′-CAGGGGAGTGCCTTTCATTA-3′，下游：5′-CTTGATGAG- GGTTTTGGTGTC-3′，上游：5′-CAGGGGAGTGCCTTTCATTA-3′，下游：5′-TGGTGTCAT- CCTGGACCTTCC-3′，擴(kuò)增片段長度分別為320和94 bp。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL：其中PremixTaq12.5 μL(1.25 U)，DNA模版1 μL(50 ng/μL)，上下游引物各0.5 μL(10 pmol/μL)，去離子水10.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 PCR產(chǎn)物檢測及PCR-RFLP檢測

PCR產(chǎn)物采用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。取5 μL PCR-RFLP產(chǎn)物，采用10%丙烯酰胺凝膠(Acr∶Scr=29∶1)進(jìn)行檢測，300 V預(yù)電泳10 min，160 V電泳2.5 h，結(jié)束后銀染，判定基因型。

1.4 脂肪酸、氨基酸、肌苷酸、羥脯胺酸的含量及剪切力測定

氨基酸測定按照GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的測定方法[18]；脂肪酸測定按照GB/T 22110-2008食品中脂肪及脂肪酸的測定方法[19]；肌苷酸測定參照Aliani等[20]的方法；羥脯氨酸測定按照GB/T 9695.23-2008肉與肉制品羥脯氨酸含量的測定方法[21]；剪切力測定按照NY/T 1180-2006的剪切力測定法[22]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件對Leptin基因多態(tài)性位點(diǎn)在新疆褐牛群體中的基因型分布進(jìn)行卡方檢驗，并對不同基因型與肉品質(zhì)性狀間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。采用固定模型：Yij=u+Gi+Eij式中，Yij為個體表型記錄，u為群體均值，Gi為標(biāo)記基因型效應(yīng)，Eij為隨機(jī)誤差；分析基因型效應(yīng)對肉品質(zhì)性狀的影響。利用Popgene 32和PIC_CALC version 0.6軟件，計算等位基因頻率、基因型頻率、哈達(dá)溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡檢驗χ2(HWE)、群體雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)[23-25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆褐牛Leptin基因外顯子2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和PCR-RFLP結(jié)果

新疆褐牛Leptin基因外顯子2 E2JW和E2FB位點(diǎn)PCR產(chǎn)物，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果見圖1和圖2，擴(kuò)增片段長度分別為320 bp和94 bp，擴(kuò)增條帶明亮清晰，可用于PCR-RFLP分析。

新疆褐牛Leptin基因外顯子 2 E2JW位點(diǎn)用ClaI內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，10%丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3，出現(xiàn)3種帶型，AA型320 bp、AT型為320/233/87 bp、TT型為233/87 bp。E2FB位點(diǎn)Kpn2Ⅰ酶切結(jié)果見圖4，出現(xiàn)2種帶型，即CT 型為94/75/19 bp、TT型為94 bp、缺乏CC基因型。

2.2 Leptin基因遺傳多態(tài)性分析

根據(jù)PCR-RFLP電泳圖譜進(jìn)行基因分型，并計算各基因型頻率和等位基因頻率(表1)。結(jié)果顯示：新疆褐牛Leptin基因第2 外顯子E2JW位點(diǎn)的AA基因型頻率為0.784，AT基因型頻率為0.187，TT基因型頻率為0.030，A等位基因頻率為0.877，T等位基因頻率為0.123，A基因為優(yōu)勢等位基因；E2FB位點(diǎn)的CC基因型頻率為0，CT基因型頻率為0.876，TT基因型頻率為 0.123，C等位基因頻率為0.438，T等位基因頻率為0.562，T基因為優(yōu)勢等位基因。經(jīng)χ2檢測表明，該群體的Leptin基因多態(tài)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)(P<0.05)。Leptin基因位點(diǎn)E2JW 的純合度高(0.880)、雜合度低 (0.187)；而E2FB位點(diǎn)則相反，其純合度低 (0.120)、雜合度高(0.880)。E2JW位點(diǎn)PIC為 0.305，為中度多態(tài)，E2FB位點(diǎn)PIC為0.195，為低度多態(tài)。

表1 Leptin基因群體遺傳參數(shù)和頻率

2.3 基因型與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

2.3.1Leptin基因E2JW位點(diǎn)不同基因型肉質(zhì)性狀的比較 由表2可見，AA型和TT型背最長肌纖維直徑極顯著小于AT型(P<0.01)，而AA型背最長肌纖維直徑也顯著小于TT型(P<0.05)；而AA型和TT型背最長肌纖維視野面積/結(jié)締組織面積之比極顯著顯著小于AT型 (P<0.01)，但AA型背最長肌纖維視野面積/結(jié)締組織面積之比顯著大于TT型(P<0.05)；3 種基因型肌纖維的密度無差異。

由表3和表4可知，AA型背最長肌纖維羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于AT和TT型(P< 0.05)。3 種基因型之間剪切力和肌苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)指標(biāo)無顯著差異。且3 種基因型背最長肌纖維各種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差異。

表3 E2JW位點(diǎn)不同基因型的背最長肌肌苷酸、羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和嫩度

表4 E2JW位點(diǎn)不同基因型的背最長肌中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

從表5得知，AA型背最長肌中肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3 種基因型中均為最高，與AT和TT型差異極顯著(P<0.01)，而硬脂酸最低，與AT和TT型差異顯著(P<0.05)。AA型背最長肌中亞油酸和亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) 最低。

表5 E2JW位點(diǎn)不同基因型的背最長肌脂肪酸組成

2.3.2Leptin基因E2FB位點(diǎn)不同基因型肉質(zhì)性狀的比較 從表6可以看出，CT型背最長肌的肌纖維直徑極顯著小于TT型(P<0.01)，而CT和TT型間肌纖維密度和視野面積/結(jié)締組織面積之比無顯著差異(P>0.05)。

表6 E2FB位點(diǎn)不同基因型的背最長肌肌肉組織學(xué)性狀

由表7 可知，CT型小于TT型的剪切力、羥脯氨酸、肌苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，差異均不顯著(P>0.05)。

表7 E2FB位點(diǎn)不同基因型的背最長肌肌苷酸、羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和嫩度

由表8可知，CT型背最長肌中天冬氨酸、絲氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸和脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于TT型(P<0.05)，且CT型背最長肌中絲氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著低于TT型(P< 0.01)。其他氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在兩種基因型之間無顯著差異(P>0.05)。

表8 E2FB位點(diǎn)不同基因型的背最長肌氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表9 可知， CT型背最長肌中硬脂酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著小于TT型(P<0.01)，亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著小于TT型(P<0.05)，而亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著大于TT型(P<0.05)。

表9 E2FB位點(diǎn)不同基因型的背最長肌脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討 論

3.1 Leptin基因多態(tài)性及群體遺傳學(xué)分析

Lagonigro等[26]對荷斯坦×夏洛來雜交公牛Leptin基因第2外顯子的遺傳多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在E2JW(A252T)位點(diǎn)。而本試驗在新疆褐牛群體Leptin基因第2外顯子處并未發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)，這可能是由于肉牛品種不同所造成，試驗選擇的肉牛群體為經(jīng)過長期雜交改良形成，具備較高肉用性能的本地肉牛品種，研究表明此位點(diǎn)多態(tài)性對肌內(nèi)脂肪、皮下脂肪、背膘厚、大理石花紋等級等肉用性狀無顯著影響。但本研究在第2外顯子區(qū)域1 180 bp處檢測到一個C/T堿基突變，導(dǎo)致精氨酸變?yōu)榘腚装彼帷＿@與Buchanan等[15]對西門塔爾牛、加拿大牛及其雜交肉牛Leptin基因第2外顯子研究發(fā)現(xiàn)的E2FB(C305T)位點(diǎn)結(jié)果一致，表明本研究所檢測到的 1 180 bp處突變位點(diǎn)即為E2FB位點(diǎn)。遺傳多態(tài)性分析表明，在新疆褐牛群體中Leptin基因第2外顯子E2JW存在3種基因型，E2FB存在2種基因型；E2JW處于中度多態(tài)而E2FB處于低度多態(tài)。χ2適合性檢驗結(jié)果表明，該群體的Leptin基因多態(tài)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)。說明其基因型分布可能受到育種過程中自然或人工選擇的影響，導(dǎo)致群體出現(xiàn)偏離平衡的狀態(tài)。Leptin基因位點(diǎn)E2FB的雜合度最高為 0.880，雜合度越高群體的遺傳多樣性信息也越多，數(shù)值越大基因豐富度越高。而Leptin基因位點(diǎn)E2JW群體純合度最低為0.120，說明越接近純種。

3.2 不同基因型與胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀的相 關(guān)性

Schenkel等[16]報道了E2FB和E2JW位點(diǎn)SNP的互作效應(yīng)對背最長肌嫩度的影響，僅提到了E2JW位點(diǎn)T等位基因與A等位基因間剪切力值顯著不同，卻沒有詳細(xì)描述。在E2JW背最長肌中，AA型的肌纖維直徑、視野面積/結(jié)締組織面積比值均顯著小于AT型和TT型(P< 0.05)；AT和TT型剪切力均小于AA型(P< 0.05)、AA型背最長肌中的肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸含量在3種基因型中均為最高，與AT和TT型均差異顯著(P<0.05)，而硬脂酸最低，與AT和TT型差異顯著(P<0.05)。背最長肌中亞油酸和亞麻酸含量為AA型最低。

Lagonigro等[26]和Kononoff等[27]利用SSCP技術(shù)研究E2FB(C305T)位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC、TT、CT 3種基因型，且CC型個體屠宰質(zhì)量大于TT型，但CC型和CT型個體之間屠宰質(zhì)量差異不顯著；劉洪瑜[28]研究也表明該位點(diǎn)在秦川牛群體內(nèi)存在CC、TT和CT 3種基因型，CC和CT型個體的宰前活質(zhì)量、背膘厚極顯著高于TT型個體。在本試驗肉牛群體中僅發(fā)現(xiàn)AA和AB兩種基因型，AA型為優(yōu)勢基因型，且該基因座位上AA型個體的宰前活質(zhì)量和胴體質(zhì)量顯著高于AB型個體，這與Kononoff等[29]和Lagonigro等[26]報道牛Leptin基因外顯子2 E2JW位點(diǎn)多態(tài)性與采食量有顯著關(guān)系，但是與脂肪有關(guān)的胴體性狀卻沒有顯著相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)E2FB位點(diǎn)CT型背最長肌肌纖維直徑極顯著小于TT型(P<0.01)，而視野面積/結(jié)締組織面積之比、肌纖維密度上CT與TT型無顯著差異(P>0.05)；背最長肌中天冬氨酸、絲氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸和脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) CT型均顯著小于 TT型(P<0.05)，Yukio等[30]通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)日本黑牛Leptin基因外顯子 2 的Y7F位點(diǎn)顯著影響胴體質(zhì)量，R25C 位點(diǎn)顯著影響C18∶0和C14∶1， A80V位點(diǎn)也顯著影響C16∶0、C16∶1、C18∶1的含量。背最長肌CT型硬脂酸含量極顯著小于TT型(P< 0.01)，亞油酸含量顯著小于TT型，而背最長肌中亞麻酸含量CT型大于TT型。Schenkel等[16]、Buchanan等[15]、Nkrumah等[31]、Crews等[32]對牛Leptin基因外顯子2 E2FB位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性對脂肪級別和平均脂含量有顯著影響，但與大理石紋的相關(guān)性不顯著，還與胴體級別及性狀和瘦肉率有關(guān)。Larissa等[33]、Silva等[34]報道了Nellore cattle 的Leptin基因與生長、胴體性狀的相關(guān)性，分析發(fā)現(xiàn) SNP A59V 與膘厚度、屠宰后肉色相關(guān)，微衛(wèi)星位點(diǎn)BM1500與屠宰后皮下脂肪厚度相關(guān)，這兩個位點(diǎn)有可能作為選擇標(biāo)記。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明Leptin基因外顯子2 E2JW和E2FB位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量不同。兩位點(diǎn)不同基因型與背最長肌纖維直徑、視野面積/結(jié)締組織面積比值及部分脂肪酸和氨基酸含量指標(biāo)差異性均顯著相關(guān)。