李思琦，蔣芳玲，周艷朝，劉 敏，吳 震

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

番茄(SolanumlycopersicumL.)為茄科番茄屬1a生草本植物，原產(chǎn)于南美洲，是重要的蔬菜作物之一。番茄喜溫暖環(huán)境，但對(duì)高溫敏感，其生長適宜溫度為15～33℃，高于35℃生長不良[1]。隨著全球氣候變暖，高溫對(duì)作物生產(chǎn)的影響日趨嚴(yán)重[2]。在中國南方地區(qū)，夏秋季節(jié)高溫是番茄栽培的主要限制因素。高溫會(huì)破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，影響體內(nèi)正常生理過程的進(jìn)行，抑制植株的生長，最終導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[3-5]。

生物刺激素(Biostimulant)是一類應(yīng)用于植物葉片或根部，通過刺激植物體內(nèi)自然的生理過程，進(jìn)而提高植物對(duì)營養(yǎng)的吸收和利用，增強(qiáng)對(duì)生物和非生物脅迫的耐受能力，并且功效與其營養(yǎng)成分相獨(dú)立的化學(xué)物質(zhì)或微生物。生物刺激素目前被劃分成8大類：腐植酸、復(fù)雜有機(jī)材料、有益化學(xué)元素(非營養(yǎng)元素)、無機(jī)鹽(包含亞磷酸鹽)、海藻提取物、甲殼素和殼聚糖衍生物、抗蒸騰劑、游離氨基酸和其他含氮物質(zhì)等[6]。近年來，生物刺激素已在小麥[7]、大豆[8]、玉米[9]、小白菜[10]等作物的抗逆研究中得到應(yīng)用。但前人多集中在其對(duì)生物脅迫以及干旱、鹽、重金屬等非生物脅迫的研究，在溫度脅迫尤其是高溫脅迫中研究較少，不同種類生物刺激素在緩解番茄高溫脅迫中的對(duì)比研究還未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以耐熱性不同的番茄幼苗為材料，利用人工模擬高溫環(huán)境，研究不同種類生物刺激素對(duì)高溫脅迫下番茄幼苗生長及生理特性的影響，旨在探討生物刺激素在緩解番茄高溫傷害中的作用及相關(guān)生理機(jī)制，為其在番茄生產(chǎn)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物材料分別為番茄耐熱品種 ‘LA2093’和熱敏感品種 ‘LA2683’，均引自美國加州大學(xué)番茄遺傳中心(Tomato Genetics Resource Center,TGRC)。中等耐熱品種‘硬粉8號(hào)’，由北京中研益農(nóng)種苗科技有限公司提供。

供試生物刺激素分別為海藻提取物(海藻 酸≥18%)、殼寡糖(分子量<1800，脫乙酰度≥90%)、礦源黃腐酸(黃腐酸≥50%、氧化鉀≥12%)，均由山東綠隴生物科技有限公司提供。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

本試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。挑選籽粒飽滿的番茄種子浸種催芽，出芽后播于裝有草炭、珍珠巖、蛭石(體積比為2∶1∶1)復(fù)合基質(zhì)的72孔穴盤中，置于晝夜溫度為 26 ℃/18 ℃，光周期為14 h/10 h，光合有效輻射為375±20 μmol/(m2·s)，相對(duì)濕度為75%的光照培養(yǎng)箱(RDN-560E-4，東南儀器，寧波，中國)中育苗。播種10 d后，選取整齊一致的幼苗移栽于32孔穴盤中，每隔2 d澆灌1次日本園式完全營養(yǎng)液。

試驗(yàn)以常溫(26 ℃/18 ℃)下正常生長且噴施清水的番茄幼苗為常溫對(duì)照(NT)，以噴施清水且進(jìn)行高溫處理(40 ℃/40 ℃)的番茄幼苗為高溫對(duì)照(HT)。根據(jù)前人研究結(jié)果[11-13]和3種生物刺激素產(chǎn)品的使用說明，將海藻提取物(H)、殼寡糖(T)和礦源黃腐酸(K)均設(shè)4個(gè)濃度處理，詳見表1。待幼苗生長至5葉1心時(shí)，選擇長勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行葉面噴施處理。噴后14 h開始進(jìn)行高溫處理，處理溫度為40 ℃/40 ℃，光周期為12 h/12 h，其他環(huán)境條件與育苗時(shí)保持一致。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)15株幼苗。高溫處理至第24 h，取樣測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)；高溫處理至第48 h，對(duì)各處理植株拍照，統(tǒng)計(jì)熱害指數(shù)并測(cè)定生物量等。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 熱害指數(shù)統(tǒng)計(jì) 參照前人[14]的方法并稍作修改，將高溫處理48 h后番茄幼苗的熱害程度分為6級(jí)：0級(jí)，幼苗生長正常，未出現(xiàn)葉片萎蔫、皺縮或變黃；1級(jí)，1片葉萎蔫、皺縮或變黃；2級(jí)，2～3片葉萎蔫、皺縮或變黃；3級(jí)，4～5片葉萎蔫、皺縮或變黃；4級(jí)，5片以上葉萎蔫、皺縮或變黃；5級(jí)，整株萎蔫或枯死。熱害指數(shù) = ∑(各級(jí)株數(shù)×級(jí)數(shù)) /(最高級(jí)數(shù)×總株數(shù)) × 100，每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)6株幼苗。

1.3.2 生物量測(cè)定 將高溫處理48 h后的番茄幼苗洗凈擦干，從子葉節(jié)部位剪斷，分為地上部分和地下部分(根系)，分別稱其鮮質(zhì)量。將地上和地下部分分別裝入牛皮紙袋中并封口，置于 120 ℃下殺青20 min，再80 ℃烘干至恒量。稱其干質(zhì)量并計(jì)算根冠比(R/S)，R/S = 地下干質(zhì)量/地上干質(zhì)量。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)6株幼苗。

1.3.3 生理指標(biāo)測(cè)定 高溫處理至第24 h時(shí)，取樣測(cè)定以下生理指標(biāo)。取幼苗生長點(diǎn)向下第3片完全展開葉，使用電導(dǎo)率儀(上海雷磁儀器廠DDSJ-308A，上海，中國)測(cè)定并計(jì)算電解質(zhì)滲透率[15]；使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光值并計(jì)算丙二醛(MDA)含量[16]。取幼苗生長點(diǎn)向下第2片完全展開葉，使用酸性茚三酮比色法[17]測(cè)定脯氨酸(Pro)含量；使用考馬斯亮藍(lán)G-250法[17]測(cè)定可溶性蛋白含量。每個(gè)指標(biāo)均重復(fù)3次，每次重復(fù)3株幼苗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用 Duncan’s檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性(P<0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施生物刺激素對(duì)高溫脅迫下不同耐熱性番茄幼苗生長的影響

2.1.1 對(duì)幼苗生長狀態(tài)和熱害指數(shù)的影響 由圖1可以看出，與常溫對(duì)照(NT)相比，經(jīng)48 h高溫處理后，各品種高溫對(duì)照(HT)幼苗的葉片出現(xiàn)不同程度的失綠、皺縮和萎蔫，并有聚攏現(xiàn)象，甚至整株萎蔫或死亡。與HT相比，葉面噴施生物刺激素可以有效地緩解高溫對(duì)番茄幼苗造成的生長抑制。由圖2可知， ‘LA2093’ ‘硬粉8號(hào)’和 ‘LA2683’的HT幼苗熱害指數(shù)分別為28.89、56.67和73.78，這說明3個(gè)品種所受熱害程度為 LA2683>硬粉8號(hào)>LA2093。經(jīng)生物刺激素處理后，幼苗的熱害指數(shù)降低。其中， ‘LA2683’的最優(yōu)處理為HT+200H，熱害指數(shù)較HT下降69.2%(圖2-A)；‘硬粉8號(hào)’和 ‘LA2093’均是以HT+100K的熱害指數(shù)最低，分別較HT下降55.3%和72.9%(圖2-B、圖 2-C)。

2.1.2 對(duì)幼苗生物量和根冠比的影響 由表 2～4可以看出，與NT相比，經(jīng)48 h高溫處理后，各品種HT幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量以及根冠比(R/S)均有不同程度的降低。與HT相比，葉面噴施生物刺激素可以減緩幼苗生物量的下降，但對(duì)R/S的影響較小。

對(duì) ‘LA2093’來說(表2)，殼寡糖(T)處理下的幼苗生物量指標(biāo)和R/S與HT差異不顯著。海藻提取物(H)和礦源黃腐酸(K)均有顯著的作用效果，其生物量指標(biāo)均隨處理濃度的增加先升后降。100和200 mg/L的H和K處理顯著提高了幼苗生物量。其中，HT+200H幼苗的地上部鮮質(zhì)量、根系鮮質(zhì)量、整株鮮質(zhì)量和整株干質(zhì)量均顯著高于HT，分別上升了44.0%、35.3%、 45.9%和53.3%。

表2 葉面噴施生物刺激素 ‘LA2093’幼苗在48 h高溫脅迫后的生物量和根冠比

對(duì)‘硬粉8號(hào)’來說(表3)，T和K處理對(duì)生物量的緩解效果優(yōu)于H。T的效果隨處理濃度的升高而增加，K的作用規(guī)律則與在 ‘LA2093’中相似。其中，HT+400T和HT+100K顯著提高了幼苗生物量，且HT+400T還顯著提高了幼苗根冠比，相比HT增加20.0%。H的效果雖不及T和K，但也表現(xiàn)出一定的濃度效應(yīng)，即隨著濃度增加呈現(xiàn)“低-高-低”的變化趨勢(shì)。

表3 葉面噴施生物刺激素‘硬粉8號(hào)’幼苗在48 h高溫脅迫后的生物量和根冠比

對(duì) ‘LA2683’來說(表4)，K處理對(duì)生物量的緩解效果優(yōu)于H和T。與其他2個(gè)品種類似，K也是以100 mg/L處理的效果最好。HT+100K顯著提高了幼苗地上部質(zhì)量、根系鮮質(zhì)量、整株鮮質(zhì)量以及整株干質(zhì)量，增幅分別為115.7%、 90.7%、110.7%和68.2%。H和T處理在此 品種上的效果雖不及K，但也起到一定的緩解 作用。

表4 葉面噴施生物刺激素 ‘LA2683’幼苗在48 h高溫脅迫后的生物量和根冠比

2.2 噴施生物刺激素對(duì)高溫脅迫下番茄幼苗葉片細(xì)胞質(zhì)膜傷害的影響

2.2.1 對(duì)電解質(zhì)滲透率的影響 如圖3所示，葉面噴施生物刺激素可以降低高溫脅迫下番茄幼苗的電解質(zhì)滲透率。對(duì) ‘LA2093’來說，隨著海藻提取物(H)、殼寡糖(T)和礦源黃腐酸(K)處理濃度的升高，高溫脅迫下的幼苗電解質(zhì)滲透率均先降后升，在所有處理中以HT+100K的電解質(zhì)滲透率最小，相比HT下降16.7%(圖3-A)。由圖3-B可知，K的各濃度處理均可以顯著降低‘硬粉8號(hào)’幼苗的電解質(zhì)滲透率，除HT+50H和 HT+200T外的H和K處理也均有顯著作用，處理間以HT+400T的降幅(26.8%)最大。由圖3-C可以看出，較低濃度的生物刺激素處理有利于 ‘LA2683’幼苗電解質(zhì)滲透率的降低，高濃度處理效果不顯著。處理間以HT+100K的電解質(zhì)滲透率最小，較HT降低18.8%。

2.2.2 對(duì)MDA含量的影響 由圖4可知，葉面噴施生物刺激素可以降低高溫脅迫下番茄幼苗葉片的丙二醛(MDA)含量。從圖4-A可以看出，H和K的各濃度處理均可以顯著降低 ‘LA2093’葉片中MDA含量，而T的作用效果則受濃度影響，其中HT+100K的降幅(45.7%)最大。如圖4-B所示，H處理下的‘硬粉8號(hào)’的MDA含量隨處理濃度的增加先降后升，T和K則是高濃度(400 mg/L)處理更有利于MDA含量的降低。處理間以HT+400T的作用最顯著，較HT降低 48.4%。對(duì) ‘LA2683’來說，T和K處理的作用優(yōu)于H，其中HT+100K的MDA含量較HT降低58.9%，效果最顯著(圖4-C)。

2.3 噴施生物刺激素對(duì)高溫脅迫下番茄幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.3.1 對(duì)脯氨酸含量的影響 從圖5可以看出，葉面噴施生物刺激素可以使高溫脅迫下番茄幼苗葉片中脯氨酸(Pro)含量升高。對(duì) ‘LA2093’來說，H和K作用下的Pro含量隨處理濃度的增加先升后降，T則是較低濃度(50、100 mg/L)的處理效果優(yōu)于較高濃度(200、400 mg/L)。在所有處理中，HT+100K的Pro含量增幅最大，為 46.1%(圖5-A)。如圖5-B和圖5-C所示，在H和T的各濃度處理中，僅 ‘LA2683’的HT+50H和HT+100T使Pro含量顯著升高。K處理則表現(xiàn)出較為顯著的促進(jìn)效果，濃度作用趨勢(shì)與 ‘LA2093’相似，并且在‘硬粉8號(hào)’和 ‘LA2683’中均以HT+100K效果最顯著，分別較HT升高52.5%和34.6%。

2.3.2 對(duì)可溶性蛋白含量的影響 從圖6可以看出，葉面噴施生物刺激素可以促進(jìn)高溫脅迫下番茄幼苗葉片中可溶性蛋白的積累。由圖6-A可知，僅HT+100T和HT+400K對(duì) ‘LA2093’幼苗的可溶性蛋白含量具有顯著促進(jìn)作用，分別較HT升高8.28%和8.50%。對(duì)‘硬粉8號(hào)’來說，T和K的效果優(yōu)于H，其中以HT+50T效果最佳，較HT提高16.9%(圖6-B)。如圖6-C所示，T和K的各濃度處理均能顯著提高 ‘LA2683’ 幼苗葉片中的可溶性蛋白含量，處理間以HT+200K增幅最大(19.0%)。而在H的各濃度處理中，僅200 mg/L處理表現(xiàn)出顯著的作用。

3 討 論

3.1 生物刺激素具有緩解高溫脅迫對(duì)番茄幼苗傷害的作用

在逆境下，植物的形態(tài)學(xué)特征變化可以直接反映植物的受傷害狀況[18]。本研究中，高溫嚴(yán)重抑制番茄幼苗的生長，這與前人[19]的研究結(jié)果一致。生物刺激素是一種可以促進(jìn)植物生長的有益物質(zhì)，已有報(bào)道證明其可以緩解逆境對(duì)植株造成的傷害，增加生物量[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，適宜種類和濃度的生物刺激素處理可以緩解高溫脅迫對(duì)番茄幼苗造成的生長抑制，主要通過促進(jìn)植株鮮質(zhì)量尤其是地上部鮮質(zhì)量的增加，使得地上部生長勢(shì)增強(qiáng)，從而使植株耐熱性提高。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同生物刺激素的作用效果與番茄品種特性有關(guān)。海藻提取物(H)和殼寡糖(T)分別對(duì)耐熱和中等耐熱品種作用顯著，礦源黃腐酸(K)則對(duì)供試的3個(gè)品種均有顯著作用，且效果優(yōu)于H和T。有報(bào)道稱，生物刺激素在植物中的作用模式與植物激素類似[11,13]，這在本研究的H和K中得以證實(shí)，兩者的效果均是隨著濃度的提高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，以100和200 mg/L最佳。但本試驗(yàn)中T的作用效果隨處理濃度的升高持續(xù)上升，以400 mg/L最佳，這可能與脅迫條件有關(guān)。

3.2 生物刺激素緩解高溫脅迫對(duì)番茄幼苗傷害的生理機(jī)制

在高溫環(huán)境下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，過多的ROS會(huì)傷害細(xì)胞膜，引起膜脂過氧化，導(dǎo)致膜透性增加，使植物受到熱傷害[22-23]。本研究表明，高溫脅迫使番茄幼苗的細(xì)胞膜受到損傷，而經(jīng)適宜種類和濃度的生物刺激素處理后，電解質(zhì)滲透率和MDA含量均顯著下降，這與前人對(duì)甜椒[13]、大豆[24]、萵苣[25]等作物的研究結(jié)果一致，說明生物刺激素可以緩解高溫脅迫導(dǎo)致的膜損傷。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼寡糖(T)和礦源黃腐酸(K)處理對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的緩解作用優(yōu)于海藻提取物(H)，這可能是由于H主要作用細(xì)胞膜以外的器官或生理過程(如光合作用等)以緩解高溫傷害[8,26]。大量研究表明，植物在受到高溫脅迫時(shí)，會(huì)啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)以保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[18-19]。由此推測(cè)，在高溫脅迫下，生物刺激素可能是通過誘導(dǎo)植株啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)來清除體內(nèi)過多的ROS，以減輕細(xì)胞質(zhì)膜損傷，從而保護(hù)了細(xì)胞膜，其作用機(jī)理還需深入研究。

滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)逆境的一種自我調(diào)節(jié)生理機(jī)能，脯氨酸(Pro)是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在逆境中，Pro一方面可以保持原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡，防止水分散失，另一方面可以與蛋白質(zhì)相互作用增加蛋白質(zhì)的可溶性，保持細(xì)胞膜完整[27]。在高溫環(huán)境下，植物葉片中Pro與可溶性蛋白的積累量與耐熱性呈正相關(guān)[28-29]。本研究中，適宜種類和濃度的生物刺激素可以促進(jìn)高溫脅迫下番茄幼苗Pro和可溶性蛋白積累，說明生物刺激素緩解番茄幼苗高溫傷害的作用途徑之一是增加了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H和K對(duì)Pro積累的促進(jìn)作用優(yōu)于T，而T和K對(duì)可溶性蛋白積累的促進(jìn)作用優(yōu)于H?？梢?，不同種類的生物刺激素會(huì)作用于不同的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)?？傊~面噴施生物刺激素可以促進(jìn)高溫脅迫下番茄幼苗體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能以提高植株應(yīng)對(duì)高溫逆境的能力。

4 結(jié) 論

在高溫脅迫下，葉面噴施生物刺激素可以有效促進(jìn)番茄幼苗體內(nèi)Pro和可溶性蛋白的積累，增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能，降低電解質(zhì)滲透率和MDA含量，緩解膜脂過氧化傷害，從而緩解高溫對(duì)幼苗生長的抑制作用。不同生物刺激素的作用效果與番茄品種特性和處理濃度有關(guān)。根據(jù)本研究結(jié)果，建議在生產(chǎn)上葉面噴施100 mg/L礦源黃腐酸緩解番茄幼苗高溫傷害。