玄琦月,韓雪,付英梅,2*

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室, 黑龍江省感染與免疫重點實驗室, 哈爾濱 150081;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)伍連德研究所, 哈爾濱 150081

肺外結(jié)核病(extrapulmonary tuberculosis, EPTB)是指由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染所引起的發(fā)生在肺部以外器官和部位的結(jié)核病，可累及人體的任何部位，胸膜、淋巴結(jié)和骨是EPTB最常見的病變部位，其次可見于腸道、腹膜、腎、生殖系統(tǒng)、腦膜等。EPTB目前沒有統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)對EPTB診斷的一般標(biāo)準(zhǔn)為：標(biāo)本MTB培養(yǎng)陽性；或組織學(xué)檢測MTB陽性；或與活動性EPTB一致的典型臨床證據(jù)[1]。

根據(jù)WHO 2020年公布的全球結(jié)核病報告，2019年，全球新發(fā)結(jié)核病約7 100萬例，其中16%為EPTB，東亞和南亞地區(qū)EPTB的比率較高，為19%[2]。我國是全球22個結(jié)核病高負擔(dān)國家之一，EPTB的發(fā)病率也較高。天津市2015—2017年登記報告的新發(fā)EPTB共1 190例，占全部結(jié)核的10.4%，三年間，EPTB的總發(fā)病率從2.05/10萬上升到3.24/10萬[3]；最新公布的一項研究顯示，近十年間，北京胸科醫(yī)院的住院結(jié)核患者中，EPTB占33.4%[4]。

早期診斷的EPTB患者，經(jīng)正規(guī)抗結(jié)核治療多可治愈，但未得到早期有效治療的EPTB患者，可導(dǎo)致多種嚴(yán)重后果，例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核有較高的死亡率，患者可在發(fā)病后的8～11周死亡[5-6]；骨關(guān)節(jié)結(jié)核可并發(fā)畸形、截癱、甚至死亡[7]；泌尿系統(tǒng)結(jié)核可并發(fā)膀胱攣縮、腎功衰竭等[8]。以前認(rèn)為EPTB的傳染性不強，但新近研究發(fā)現(xiàn)，EPTB也具有一定傳染性[9]。因此，及早對EPTB做出有效診斷，有助于提高疾病治愈率、降低死亡率。目前，EPTB診斷的主要依據(jù)為臨床表現(xiàn)和病原學(xué)檢查，而多數(shù)EPTB患者的癥狀不典型，臨床和影像學(xué)表現(xiàn)可與多種其他疾病相似，因此，微生物學(xué)檢測方法對EPTB的診斷至關(guān)重要。近年來，EPTB的病原學(xué)檢測方法得到了快速的發(fā)展，除了傳統(tǒng)的細菌學(xué)檢查方法，標(biāo)本中MTB抗原和核酸的檢測對EPTB的早期和快速診斷提供了豐富的參考證據(jù)。本文總結(jié)了近年來EPTB細菌學(xué)檢查方法、MTB抗原檢測與分子生物學(xué)檢測等微生物學(xué)診斷方法的概況及近年來的應(yīng)用進展，并對這些檢測方法的特點、優(yōu)劣勢和適用范圍等進行了分析、比較，以期為今后EPTB病原學(xué)診斷的研究提供相關(guān)信息。

1 細菌學(xué)檢查方法

細菌學(xué)檢查方法雖然總體陽性率不高，但仍是目前診斷結(jié)核病的主要方法，主要包括改良的涂片鏡檢法和MTB培養(yǎng)法。

1.1 涂片鏡檢法

涂片鏡檢法是國內(nèi)外普遍應(yīng)用的EPTB實驗室檢查方法，但因EPTB患者的體液樣本中細菌數(shù)量少，傳統(tǒng)的染色涂片法檢出率較低，多使用改良抗酸染色法與液體快速培養(yǎng)法以提高MTB檢出率。改良抗酸染色法是先將樣品置于Cytospin4型細胞離心涂片機中離心濃集菌，然后再使用抗酸染色劑染色[10]。在腦脊液樣本的檢測中，Cytospin制片染色法不僅提高了細胞外MTB的檢出率，還可檢出白細胞內(nèi)的細菌[10]。但Cytospin制片染色法要求腦脊液中有足夠的MTB細菌數(shù)量，通常要求在5 000～50 000個·mL-1[11]，而臨床上很多情況下，腦脊液含菌量平均僅10個·mL-1左右[12]，所以，該法對結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中細菌的總檢出率僅在10.0%～20.0%[13]。此外，熒光染色技術(shù)也被應(yīng)用于EPTB的檢查中，其是將抗酸染色法的復(fù)紅改為金胺類，借助熒光顯微鏡觀察，可將結(jié)核性腦膜炎細菌的檢出率提高至79.2%，特異度也顯著高于Cytospin制片染色法[14]。

1.2 MTB培養(yǎng)法

MTB培養(yǎng)法包括羅氏培養(yǎng)法和液體快速培養(yǎng)法。目前廣泛使用的是液體快速培養(yǎng)法，BACREC MGIT 960液體快速培養(yǎng)法的敏感度和特異度分別達43.7%和93.0%[15]。聯(lián)合顯微鏡觀察藥物敏感度檢測技術(shù)(microscopic observation drug susceptibility assay, MODS)可同時檢測MTB的存在及其藥物敏感性，其主要原理是利用MTB在適宜的液體培養(yǎng)基中生長速度快于固體培養(yǎng)基、且可形成特征性索狀結(jié)構(gòu)的特性，采用添加抗結(jié)核藥物的液體培養(yǎng)基對標(biāo)本進行直接培養(yǎng)，通過顯微鏡觀察特征性索狀結(jié)構(gòu)，以判斷標(biāo)本中是否存在MTB[16]。

2 MTB抗原檢測

EPTB患者的體液標(biāo)本中含菌量較低，導(dǎo)致細菌學(xué)檢查方法敏感度低、特異度差，且培養(yǎng)法耗時較長，無法快速對EPTB患者進行診斷。而抗原檢測是檢測MTB特異性分泌蛋白或其細胞壁的特異性脂質(zhì)成分[17-18]，對標(biāo)本含菌量的要求不高，且早期即可診斷。目前在診斷研究中使用較多的抗原包括MPT64、抗原85B(antigen 85B, Ag85B)、脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan, LAM)、早期分泌性抗原靶-6(early secretory antigenic target-6, ESAT-6)等，研究者對單一抗原和多抗原聯(lián)合的診斷效能都進行了測試。

2.1 單一抗原檢測

2.1.1MPT64檢測 MPT64是發(fā)現(xiàn)最早的MTB特異性分泌蛋白，僅存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物(mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)中[17]。利用免疫細胞化學(xué)染色(immunocytochemistry, ICC)方法檢測MPT64抗原是一種簡單而直接的方法，可用于EPTB的早期診斷。Davidsen等[19]收集了67例結(jié)核性淋巴結(jié)炎患者的淋巴活檢標(biāo)本，利用ICC法檢測MPT64抗原，發(fā)現(xiàn)敏感度和特異度可達69.0%和95.0%。Purohit等[20]的研究結(jié)果也同樣顯示了MPT64抗原檢測的高敏感度(96.0%)與高特異度(96.0%)。最近挪威的一項研究發(fā)現(xiàn)，MPT64抗原的檢測還可用于福爾馬林固定的活檢標(biāo)本，敏感度為37%，盡管其敏感度不如培養(yǎng)法(50%)，但其診斷效能優(yōu)于細針穿刺和膿汁等液體樣本的檢查，為病理學(xué)實驗室的病原學(xué)診斷提供了快速、特異的診斷參考[17]。

2.1.2Ag85B檢測 Ag85B存在于MTB分泌蛋白中，可與人纖維結(jié)合蛋白結(jié)合，與MTB致病性密切相關(guān)[21]。Singh等[22]開發(fā)了一種新型的間接夾心免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(immuno-PCR，I-PCR)檢測法，該方法兼具PCR的指數(shù)擴增能力和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的靈活性，對105例EPTB患者的胸水、膿汁等液體樣本分別以I-PCR方法和傳統(tǒng)的ELISA法檢測Ag85B，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總體敏感度分別為68.6%和52.4%，特異度分別為92.0%和96.0%，但I-PCR檢測Ag85B可以更快速地獲得結(jié)果，且I-PCR檢測Ag85B的檢出限為1 fg·mL-1，能檢出比ELISA方法低106倍的抗原量，敏感度更高。

2.1.3LAM檢測 LAM是MTB細胞壁的一種脂多糖，尿脂阿拉伯甘露糖測定法(lateral flow urine lipoarabinomannan assay, LF-LAM)是一種新型的即時檢驗方法，可檢測活動性結(jié)核病患者尿中的LAM。研究表明，聯(lián)合使用LF-LAM與痰涂片鏡檢法檢測MTB的合并敏感度為59.0%，比單獨使用涂片法提高了19.0%，而特異度為92.0%，僅比單獨涂片法降低了6%，說明LF-LAM與痰涂片鏡檢聯(lián)合使用有助于結(jié)核病的診斷[18]。殷曉云等[23]使用蛋白芯片檢測了74例EPTB患者的血清LAM，結(jié)果顯示敏感度為56.8%，特異度為83.2%，提示LAM檢測對較難診斷的EPTB有重要意義。

2.1.4ESAT-6檢測 ESAT-6是由MTB短期培養(yǎng)濾液純化而來，屬早期特異性分泌蛋白[21]。Mehta等[24]通過I-PCR方法，單獨檢測42例EPTB患者胸水標(biāo)本中的ESAT-6，結(jié)果顯示敏感度為38.1%，特異度為93.3%。

2.2 多種抗原聯(lián)合檢測

2.2.1Ag85B、ESAT-6與索狀因子聯(lián)合檢測 索狀因子(6,6-雙分枝菌酸海藻糖)是存在于有毒力的MTB細胞壁中的脂質(zhì)成分[25]。利用I-PCR方法對40例EPTB患者血清中的Ag85B、ESAT-6與索狀因子進行聯(lián)合檢測，結(jié)果顯示敏感度和特異度分別為77.5%和92.0%[25]。在此研究的基礎(chǔ)上，同樣利用I-PCR方法，對40例EPTB患者的胸膜液標(biāo)本進行抗原聯(lián)合檢測，結(jié)果表明其敏感度和特異度為61.9%和92.0%，均低于單獨檢測Ag85B[24]。

2.2.2培養(yǎng)濾液蛋白10與ESAT-6聯(lián)合檢測

培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein-10, CFP-10)也是由MTB短期培養(yǎng)濾液純化而來的，可刺激機體產(chǎn)生特異性抗體[21]。CFP-10和ESAT-6的表達可以作為MTB感染后的早期檢測，對于診斷活動性結(jié)核也具有重要意義?；谘鍖W(xué)的方法對21例EPTB患者的血清標(biāo)本進行抗原聯(lián)合檢測，敏感度為85.7%，同時在健康人與高危人群中也表現(xiàn)出了高特異度(87.1%～100%)[26]。

2.2.3結(jié)核特異性抗原與植物凝集素比率的檢測 植物凝集素(phytohemagglutiinin, PHA)的值反映了免疫抑制的作用，可用于判斷不同免疫狀態(tài)的EPTB患者結(jié)核特異性抗原(tuberculosis-specific antigen，TBAg)檢測的可信度[27]。Wang等[28]選擇了CFP-10與ESAT-6聯(lián)合抗原作為TBAg，對734例EPTB血清標(biāo)本通過結(jié)核感染T細胞斑點試驗(tuberculous T cell enzyme-linked immuno-spot assay，T-SPOT.TB)的方法分析TBAg/PHA比率，以0.2作為閾值來區(qū)分EPTB與非EPTB，結(jié)果表明敏感度和特異度為70.8%和91.6%。此外，在抗結(jié)核治療期間，TBAg/PHA比率顯著降低，表明該值也可用于監(jiān)測治療效果[28]。

此外，還可根據(jù)結(jié)核感染時機體的免疫學(xué)反應(yīng)，通過γ干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay, IGRA)及血清中多種抗體的檢測，對肺外結(jié)核進行輔助診斷[23,27]。

3 結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢測

分子生物學(xué)檢測方法將結(jié)核病的診斷提高到了分子和基因的水平。通過直接檢測標(biāo)本中MTB的特異性靶基因，能夠更敏感、更快速地檢出標(biāo)本中MTB的核酸成分，大幅度提高診斷的敏感度與特異度。

3.1 實時熒光定量PCR技術(shù)

實時熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)技術(shù)是在PCR指數(shù)擴增期間，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的變化，并與加入的已知定量標(biāo)準(zhǔn)品比較，來分析目的基因的拷貝數(shù)，實現(xiàn)對核酸的實時定量[29]。早期所用的FQ-PCR法檢測的靶標(biāo)是MTB基因的保守片段，可動態(tài)檢測標(biāo)本中MTB-DNA的含量，不受細菌表型和耐藥性影響[30]。FQ-PCR法用于結(jié)核病診斷，其敏感度和特異度明顯高于涂片法，且操作簡便、快速、便于推廣、無須特殊精密儀器，對于結(jié)核病尤其是EPTB的診斷具有較高的應(yīng)用價值。李艷紅等[31]對22例EPTB患者的體液標(biāo)本同步檢測，結(jié)果表明FQ-PCR法的陽性率、敏感度、特異度分別為86.4%、95.0%和100%，高于涂片法的59.0%、60.0%和50.0%。

目前，最常用的FQ-PCR法是Xpert Mtb/RIF [XpertMycobacteriumtuberculosis(MTB)/rifampicin (RIF) assay] 技術(shù)，該技術(shù)以ropB為靶基因，通過實時熒光PCR擴增，同時檢測MTB和利福平(rifampicin，RIF)耐藥[32]。2013年，WHO建議將Xpert MTB/RIF 用于諸如結(jié)核性淋巴結(jié)炎和結(jié)核性腦膜炎等EPTB的診斷[33]。選取238例EPTB患者的體液標(biāo)本進行Xpert Mtb/RIF檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總體敏感度為65.5%，特異度為100%，其中膿液標(biāo)本的敏感度最高，為88.5%，腦脊液標(biāo)本的敏感度較低，為33.3%[15]。Tadesse等[34]對572例EPTB患者的肺外標(biāo)本進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總體敏感度和特異度為75.0%和98.0%，其中敏感度最高的是淋巴結(jié)標(biāo)本，為89.8%，表明Xpert Mtb/RIF檢測可用于結(jié)核性淋巴結(jié)炎患者淋巴結(jié)標(biāo)本的初篩。

雖然Xpert Mtb/RIF檢測和結(jié)核診斷金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法有很高的陽性一致性，且特異度更高，但Xpert MTB/RIF技術(shù)在低細菌負荷下具有較差的敏感性，并且無法區(qū)分MTB的活菌和死菌[35-36]。對于骨關(guān)節(jié)和活檢標(biāo)本等需要研磨和均質(zhì)化的標(biāo)本，敏感性也較差[37]。為了克服這一局限，最近開發(fā)了新一代檢測技術(shù)Xpert MTB/ RIF Ultra(GX-Ultra)，這個方法是在Xpert MTB/ RIF的基礎(chǔ)上，添加了MTBC的2個新靶標(biāo)(IS1081和IS6119)，較大提高了在低細菌負荷下的靈敏度[38-39]。通過GX-Ultra檢測82例涂陰肺外標(biāo)本的敏感度可達75.9%[40]。使用208例胸膜結(jié)核患者的胸膜液標(biāo)本對Xpert Ultra和Xpert的性能進行分析，Xpert Ultra的敏感性為44.2%，高于Xpert的19.23%，二者特異性均為98.7%[41]。

3.2 DNA探針技術(shù)

探針技術(shù)主要包括核酸雜交探針、線性探針測定和核酸擴增測試(nucleic acid amplification testing, NAAT)等[42]，使用寡核苷酸探針鑒定DNA靶標(biāo)，這些方法不依賴于核酸擴增來為測試提供足夠數(shù)量的靶分子。已經(jīng)選擇的靶標(biāo)包括來自16S或23S rRNA基因的基因間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)、MPB64基因、插入序列986或6110等[43]。Wang等[42]基于插入序列6110開發(fā)IS4引物和探針，設(shè)計了一種新型實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的NAAT，并對130例臨床標(biāo)本進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺部標(biāo)本的臨床敏感度和特異度為92.0%和76.9%，肺外標(biāo)本的臨床敏感度和特異度為92.3%和86.8%。值得注意的是，IS4雖可以區(qū)分MTB和非結(jié)核分枝桿菌，但不能區(qū)分活菌和死菌，因此不適于治療監(jiān)測。

3.3 實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(simultaneous amplification and testing, SAT)是近年研發(fā)的一項技術(shù)，以MTB特異的16S rRNA為檢測靶標(biāo)，在同一溫度(42 ℃)以RNA為起始模板，通過莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(moloney murine leukemia virus，MMLV-RT)產(chǎn)生1個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶(T7 RNA polymerase，T7RNP)從該拷貝產(chǎn)生100～1 000個RNA拷貝，通過恒溫RNA擴增技術(shù)擴增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號，對熒光信號進行實時檢測，從而快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有MTB存在[44]。對433例EPTB樣本進行檢測，結(jié)果表明，培養(yǎng)法的敏感度和特異度為29.3%和98.0%，而SAT檢測的敏感度和特異度為83.6%和79.4%[45]。由于RNA只存在于活菌中，在疾病活動性、藥物療效檢測方面有較高的臨床價值，且RNA極易降解，可有效避免污染。

3.4 液滴數(shù)字PCR技術(shù)

液滴數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR, ddPCR)是最近開發(fā)的一種高靈敏PCR方法，可以成功量化結(jié)核病患者血液樣本中的CFP-10和結(jié)核分歧桿菌Rv1768基因DNA微量拷貝數(shù)，且比FQ-PCR更敏感，ddPCR對CFP-10檢測限為1.2拷貝·μL-1，而FQ-PCR為15.8拷貝·μL-1[46]。通過ddPCR對28名肺結(jié)核患者及28名EPTB患者的血液標(biāo)本進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核和EPTB標(biāo)本的敏感度均為100%[47]。ddPCR可在感染3周后檢測到低水平的MTB-DNA，適合用于疫苗開發(fā)、體內(nèi)細菌負荷評估和早期結(jié)核病的診斷[46]。

4 不同檢測方法對于診斷EPTB的效能比較

目前，EPTB的微生物學(xué)診斷方法主要包括細菌學(xué)檢查方法、MTB抗原檢測和MTB核酸檢測，不同檢測方法的優(yōu)缺點、適用范圍存在差異(表1)。細菌學(xué)檢查方法是國內(nèi)外普遍應(yīng)用的實

表1 EPTB常用微生物學(xué)檢測方法的比較Table 1 Comparison of microbiological detection methods for extapulmonary tuberculosis

驗室檢查方法，但臨床中的標(biāo)本含菌量較低，難以達到涂片法要求的細菌數(shù)量，而培養(yǎng)法耗時較長，不適用于EPTB的快速診斷?？乖瓩z測可使用血清標(biāo)本、活檢標(biāo)本或福爾馬林固定的活檢標(biāo)本，相較于細菌學(xué)檢查方法對標(biāo)本的含菌量要求不高，且適用于EPTB的早期診斷，但不同的抗原敏感度和特異性仍存在一定差異。核酸檢測能夠更敏感、更快速地檢出標(biāo)本中MTB的核酸成分，適用于EPTB的早期快速診斷。

5 展望

隨著免疫缺陷和免疫受損人群的增多，MTB的感染率增加，肺外組織和器官的感染也在增加。同肺內(nèi)結(jié)核病相比，EPTB患者缺乏特異性的臨床表現(xiàn)， EPTB的早期診斷是臨床上的一大難題。由于EPTB不同感染部位的限制，在很大一部分病人中不易獲得適于實驗室檢查的標(biāo)本，因此，探索不受標(biāo)本類型限制的早期、快速、敏感、特異的新診斷方法，是今后研發(fā)新型標(biāo)志物的方向。另一方面，目前正在研究和應(yīng)用的診斷技術(shù)，對EPTB的診斷效能很大程度上受標(biāo)本類型、結(jié)核病地區(qū)負荷的影響，在今后的研究中，應(yīng)進一步評估影響這些技術(shù)診斷效能的因素。在此基礎(chǔ)上，兼顧診斷方法的經(jīng)濟適用性和使用廣泛性，以提高EPTB實驗室診斷效能，早期、有效地對EPTB進行防控和治療。