梁明星,馬夢琪,程盈盈,王媛,陳華波

湖北文理學院醫(yī)學院, 湖北 襄陽 441053

基因定點突變是常用的分子生物學研究方法。通過突變基因特定位點的堿基序列，改變其編碼蛋白質對應的氨基酸序列，從而影響目標蛋白質的酶活性[1]、受修飾位點或與其他蛋白質的結合能力[2]，藉此研究蛋白質的結構、功能、上下游調控關系、亞細胞定位等特征。

基因定點突變的方法主要有重疊延伸PCR(overlap extension PCR, OE-PCR)[3-4]、滾環(huán)擴增法[5-6]、大引物PCR法[7-8]等，每種方法各有優(yōu)劣。其中，OE-PCR法雖步驟繁瑣，但適當改進后可解決基因定點突變中的諸多難題。如采用平行模板可有效減少原始質粒對突變產(chǎn)物的干擾[9]；采用多片段重疊延伸可一次性制作基因多位點突變[10]。因此，OE-PCR定點突變法仍然受到大量科研工作者的青睞。而OE-PCR法也有一定缺陷。其一，OE-PCR第二輪擴增成功與否受上、下游片段長度和使用比例、重疊區(qū)域長度及序列特征等諸多因素影響。一般隨著上、下游片段長度增加，擴增成功率逐漸降低[11]。經(jīng)常遇到第二輪PCR無法擴增出目標產(chǎn)物，卻難以找到關鍵制約因素，只能反復調整反應條件的情況。其二，與其他基因定點突變方法一樣，基于體外擴增DNA的定點突變都存在隨機突變風險，且隨目標基因長度增加而增加。因此，縮短OE-PCR過程中待擴增DNA長度，可有效提高基因定點突變效率。

周期蛋白E(cyclin E)是周期蛋白家族的重要成員，通過激活周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2, CDK2)在G1/S轉換中發(fā)揮作用[12]。cyclinE有2個重要截短基因(truncated gene 1 and 2, T1 and T2)，稱為低分子量cyclin E(low molecular weight cyclin E, LMW cyclin E)[13-14]。研究顯示，LWM cyclin E在多種腫瘤細胞中表達，激活CDK2能力更強，在促進腫瘤細胞轉化和誘導血管生成等方面發(fā)揮著一定的作用[14-16]。本實驗室在前期研究中已克隆了cyclinE基因及其2個截短基因T1、T2，并通過EcoR Ⅰ/SalⅠ雙酶切插入pEGFP_C2載體(未發(fā)表數(shù)據(jù))。為了降低克隆cyclinE及其截短基因的激酶活性缺失(kinase-deficient, KD)突變體[17]過程中重復擴增帶來的隨機突變風險，本研究利用OE-PCR擴增C2-cyclinE、C2-cyclinE_T1和C2-cyclinE_T2這3個原始質粒中含突變位點的一小段共有序列，再采用雙片段連接法置換原始質粒中的對應序列以構建完整突變基因，以期對常規(guī)OE-PCR作適當改進，提供一種克隆系列基因定點突變的優(yōu)化方案。

1 材料與方法

1.1 菌種與質粒

DH5α感受態(tài)大腸桿菌(18263012)購自美國Thermo Fisher公司；pEGFP_C2質粒(6083-1)購自美國Clontech公司；C2-cyclinE、C2-cyclinE_T1和C2-cyclinE_T2質粒由本實驗室構建并保存。

1.2 試劑

2×EasyTaqPCR SuperMix (AS111-11)購自北京全式金生物技術有限公司；Pyrobest DNA Polymerase (R005A)、DNA Ligation Kit Ver.2.1 (6002)購自日本TaKaRa公司；內切酶EcoRⅠ(R0101V)、AgeⅠ(R0552V)、SalⅠ(R0138V)購自美國NEB公司；DNA回收試劑盒(BSC02M1/BSC03M1)、質粒小量抽提試劑盒(BSC01M1)購自杭州博日科技有限公司。

1.3 引物設計與合成

通用引物pEGFP-C5′/3′參考Invitrogen中國測序通用引物序列，其他引物采用Primer Premier 5. 0軟件設計，由北京天潤奧科生物科技有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。引物序列見表1。

1.4 cyclin E及其截短基因的激酶活性缺失突變體的構建

本實驗室在前期研究中已經(jīng)克隆了cyclinE基因及其2個截短基因T1、T2，并通過EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切插入pEGFP_C2載體。若構建此系列基因的激酶活性缺失突變體，需將cyclinE基因編碼區(qū)562～576位(或T1、T2對應序列)“TTACAGCTTATTGGG”突變?yōu)椤癎CAGCGGC-AGCAGCA”[18]。限制性酶切分析發(fā)現(xiàn)cyclinE基因序列中含有1個AgeⅠ位點將其分為F1、F2兩段，目標突變位點KD位于F2段。對于cyclinE及其截短基因，F(xiàn)2段是完全一致的(圖1)。故可以僅對F2段作定點突變，再將其置換原始質粒的相應序列，即可得到3個系列突變體。

表1 本研究所用引物Table 1 Primer used in this study

注：右向箭頭表示正向引物，左向箭頭表示反向引物，各箭頭所在位置指示引物在質粒上的匹配位點。圖1 pEGFP_C2-cyclin E/T1/T2質粒圖譜及引物匹配位點Fig.1 Plasmid maps of pEGFP_C2-cyclin E/T1/T2 and primer matching sites

1.4.1利用OE-PCR擴增含突變位點的F2片段

首先，第一輪PCR以pEGFP_C2-cyclinE原始質粒為模板，相應的以E_S、T1_S、T2_S為上游引物搭配KD_A為下游引物擴增系列基因上游片段，以KD_S/pEGFP_C3′為上、下游引物擴增基因下游片段。PCR反應體系為：10×buffer 3 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各0.3 μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.3 μL，質粒DNA 0.1 μL，補水至30 μL。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收至20 μL ddH2O中。

然后，第二輪PCR分別以E/T1/T2組的上、下游片段回收物為模板，相應的以E_S、T1_S、T2_S為上游引物搭配pEGFP-C3′為下游引物進行擴增。PCR反應體系為：10×buffer 5 μL，dNTP 7 μL，上、下游引物各0.5 μL，Pyrobest DNA Polymerase 0.5 μL，上、下游片段回收物各2.5 μL，補水至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收至20 μL ddH2O中。

1.4.2利用雙片段同時連接法構建突變體重組質粒 除F2片段上有AgeⅠ位點外，pEGFP_C2-cyclinE/T1/T2質粒上游還有另1個AgeⅠ位點。為避免雙AgeⅠ位點對常規(guī)酶切-連接的限制，采用雙片段同時連接法，即以EcoRⅠ/AgeⅠ雙酶切原始質粒獲得F1片段，以AgeⅠ/SalⅠ雙酶切OE-PCR產(chǎn)物T2獲得F2片段，兩片段一起連接EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切的質粒載體，從而得到完整突變體質粒。具體操作為：取OE-PCR終產(chǎn)物17 μL，pEGFP_C2-cyclinE/T1/T2質粒2 μg或pEGFP_C2質粒1 μg稀釋到17 μL ddH2O中，分別加2 μL 10×buffer、相應的2種酶各0.5 μL，37 ℃孵育4 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收目標片段至20 μL ddH2O中。

采用DNA Ligation Kit Ver.2.1連接片段與載體，具體操作為：取載體0.5 μL，兩片段各3.5 μL，solutionⅠ7.5 μL；16 ℃孵育30 min。連接產(chǎn)物直接轉化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，涂布于卡那霉素-LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。CyclinE截短基因系列突變體克隆過程見圖2。

1.5 目標克隆的篩選與序列測定

從過夜平板上隨機挑取數(shù)個菌落，置于5 mL卡那霉素-LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8 h。采用2×EasyTaqPCR SuperMix，直接以菌液為模板、以匹配pEGFP_C2載體多克隆位點上游的pEGFP-C5′引物與KD_A引物組合進行PCR檢測。反應體系為：2×SuperMix 5 μL，上、下游引物各0.1 μL，菌液0.8 μL，補水至10 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共25個循環(huán)。為驗證PCR檢測結果，對部分克隆取2.5 mL菌液小量提取質粒進行酶切檢測。具體操作為：2 μL 10×buffer，0.5 μLAgeⅠ，7.5 μL質粒DNA，補水至20 μL，37 ℃孵育4 h。再利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。為確認突變體序列，取部分陽性質粒進行序列測定，質粒測序由北京天潤奧科生物科技有限公司完成，利用DNAMAN 4.0軟件進行序列比對分析。

圖2 Cyclin E截短基因系列突變體克隆過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of cloning cyclin E truncated gene mutants

2 結果與分析

2.1 含突變位點基因片段的擴增

通過OE-PCR擴增含突變位點的F2片段，先以pEGFP_C2-cyclinE原始質粒為模板，以ddH2O為負對照，分別以E_S、T1_S、T2_S搭配KD_A為引物擴增系列基因上游片段，以KD_S/pEGFP_C3′為引物擴增基因下游片段，得到4個預期的目標產(chǎn)物(圖3A)。在第二輪PCR時，E/T1/T2組上游引物分別為E_S、T1_S與T2_S，下游引物皆為pEGFP-C3′；模板分別為第一輪PCR產(chǎn)物1&4、2&4與3&4，以pEGFP_C2-cyclinE質粒作正對照。發(fā)現(xiàn)上游片段1或2與下游片段4組合未能擴增出完整基因，只有上游片段3與下游片段4組合擴增出完整cyclinE_T2(圖3B)。以上結果與OE-PCR擴增長基因成功率較低的經(jīng)驗相符。

A：第一輪PCR電泳結果；“-”—以ddH2O為負對照，1～3—上游引物分別為E_S、T1_S與T2_S，下游引物為KD_A的PCR產(chǎn)物；4—引物為KD_S/pEGFP-C3′的PCR產(chǎn)物；M—DNA marker。B：第二輪PCR結果；“+”—以pEGFP_C2-cyclin E質粒為正對照；E/T1/T2—上游引物分別為E_S、T1_S與T2_S，下游引物皆為pEGFP-C3′，模板分別為第一輪PCR產(chǎn)物1&4、2&4與3&4的PCR產(chǎn)物；M—DNA Marker。圖3 擴增含突變位點的基因片段Fig.3 Amplification of gene fragments with mutation site

2.2 載體及基因片段的酶切

理論上，將上述OE-PCR產(chǎn)物T2以AgeⅠ/SalⅠ雙酶切即可得到F2片段，再通過酶切-連接置換原質粒的對應序列即可得到相應突變體。然而，質粒上游還有另1個AgeⅠ位點(圖2)，因此F2片段無法簡單置換質粒中的對應序列。雙片段連接法可突破雙AgeⅠ位點對常規(guī)酶切-連接的限制。即以EcoRⅠ/AgeⅠ雙酶切原始質粒獲得F1片段，以AgeⅠ/SalⅠ雙酶切OE-PCR產(chǎn)物T2獲得F2片段，兩片段一起連接EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切的質粒載體，從而得到完整突變體質粒。

將pEGFP_C2-cyclin E/T1/T2質粒以EcoR Ⅰ/AgeⅠ雙酶切得到3個片段：4 672、763 bp以及1個分別為526/409/334 bp，其中最小的片段即所需的F1，它與763 bp片段有一定距離，容易分離回收。OE-PCR產(chǎn)物T2以AgeⅠ/SalⅠ雙酶切得到3個片段：710、339及60 bp，其中60 bp片段較小不易顯現(xiàn)，710 bp片段即為F2。pEGFP_C2質粒雙酶切簡單易行(圖4)。

2.3 目標克隆的篩選與檢測

雙片段連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)大腸桿菌后經(jīng)卡那霉素選擇平板篩選，發(fā)現(xiàn)3個平板上皆形成一定數(shù)量菌落(圖5A～C)，但少于本實驗室單片段連接經(jīng)驗值[19]，提示雙片段連接效率略低。分別從3個平板上挑取數(shù)個菌落，先進行PCR檢測。選用匹配pEGFP_C2載體多克隆位點上游的pEGFP-C5′引物與KD_A引物組合，陽性結果表示該克隆含pEGFP_C2質粒載體，且含有目標基因序列；由于系列基因在5′端的差異，3種目標克隆的預期產(chǎn)物大小略有不同，可相互佐證。檢測結果顯示#12、#13、#17、#23、#31及#32為陽性克隆(圖5D～F)。目標質粒上含有2個AgeⅠ位點，可用酶切驗證PCR結果。從每組克隆中各選3個進行單酶切檢測，其結果與PCR檢測結果一致(圖5G)。

注：M—DNA Marker；1～3—pEGFP_C2-cyclin E/T1/T2質粒雙酶切結果；4—OE-PCR產(chǎn)物T2雙酶切結果；5—pEGFP_C2質粒雙酶切結果；箭頭指示需回收的DNA片段。圖4 載體與cyclin E系列截短基因片段的酶切Fig.4 Restriction enzyme digestion of DNA fragments and vectors

A-C：目標突變體(cyclin E/T1/T2)KD對應過夜平板；D-F：A-C平板菌落的PCR檢測結果；G：部分克隆小量提取質粒酶切檢測結果；H：3個陽性質粒的序列比對結果；11～38—菌落編號；M—DNA Marker。圖5 目標克隆的篩選與檢測Fig.5 Screening and detection of target clones

為進一步確認目標克隆，對經(jīng)酶切檢測驗證的5個陽性質粒作序列測定。序列比對結果顯示其中#12、#23、#31質粒序列完全準確(圖5H)。說明成功克隆了cyclinE基因及其2個截短基因T1/T2的激酶活性缺失突變體。

3 討論

許多基因存在截短型表達模式[20-22]，針對系列截短基因的定點突變，逐一克隆則避免不了反復擴增而增加隨機突變風險。采用共有序列替換思路，僅對包含目標位點在內的一段共有DNA序列進行定點突變，再置換各自對應序列構建完整質粒，一則可以提高OE-PCR成功率，二則可以降低隨機突變的風險。

除了OE-PCR法，目前市場上突變試劑盒更多以滾環(huán)擴增法為基本原理[23-25]。滾環(huán)擴增法需對質粒全長進行擴增，因此只能對系列基因逐一突變。此外，滾環(huán)擴增法強烈依賴DpnⅠ酶對原始模板質粒的徹底消化。隨著試劑盒使用和存儲時間增加，不可避免的酶活性降低會導致大量的“假陽性”克隆。這些“假陽性”克隆無法通過PCR或酶切檢測區(qū)分，只能依賴于全基因測序加以鑒定。

含目標突變序列的共有片段既可來自于OE-PCR，也可取自系列基因中某一已經(jīng)鑒定的突變體。如果得到了cyclinEKD突變體，再克隆LMW-cyclinEKD突變體時則無需重新OE-PCR擴增，只需將共有序列F2以AgeⅠ/SalⅠ酶切分離出來即可(圖1)。此時F2片段來自于細胞內質粒DNA復制，序列忠實度較高，目標突變體一般無需序列測定。雙片段連接法還可拓寬常規(guī)酶切-連接構建重組質粒的使用范圍，對于序列長度大、干擾酶切位點較多的基因克隆有所幫助，如某些長基因、融合基因的克隆等[11]。盡管如此，相對常規(guī)單片段連接法，雙片段連接時得到的轉化克隆數(shù)較少，且陽性率略低；調整連接體系中兩片段及載體的比例可適當增加轉化克隆數(shù)。檢測時可適當增加挑選的待檢克隆數(shù)，以盡量保證篩選到陽性克隆。

序列替換法克隆系列基因突變體依賴于合適的酶切位點。最理想的情況是目標位點兩側附近各有一個單一常見酶切位點，此時按常規(guī)雙酶切-連接即可重構完整質粒。然而也可能遇到另外一種情況，即目標位點兩側雖有常見酶切位點，但它們在質粒上并不單一。如本例中目標位點上游附近雖有1個AgeⅠ位點，但載體序列本身還有另一AgeⅠ位點。此時雙片段連接法可避開雙AgeⅠ位點對質粒重構的限制。如果目標位點兩側找不到合適酶切位點，則只能按常規(guī)逐一克隆。根據(jù)經(jīng)驗，我們認為可供選擇的Ⅱ型限制性內切酶眾多，針對具體基因可結合實驗室條件靈活選擇實驗方案。

綜上所述，本研究提出了一種克隆系列截短基因突變體的優(yōu)化方案，即通過部分擴增減少隨機突變，輔以雙片段連接法進行靈活的基因重組，極大地提高了基因定點突變效率，可作為其他系列相關基因定點突變的優(yōu)化方案。