張香香,滕炎桐,陳濤

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081

在自然界中，植物的每個生長發(fā)育階段都面臨著多種非生物脅迫，例如鹽脅迫、干旱脅迫、冷脅迫、熱脅迫、營養(yǎng)元素缺失脅迫等。這些逆境脅迫對植物的生長發(fā)育造成了很多不良影響，導致了糧食作物產(chǎn)量下降。據(jù)估計，世界上的主要糧食作物由于逆境脅迫造成的減產(chǎn)約50%，甚至更多[1]。

一直以來，鹽脅迫都是影響植物最重要的非生物脅迫之一，造成了糧食作物的嚴重減產(chǎn)，對植物的各個發(fā)育階段如萌發(fā)、營養(yǎng)生長、開花等產(chǎn)生不良影響[2]。大約20%的灌溉農(nóng)田受到鹽漬化的嚴重影響。鹽脅迫是通過影響植物的生理途徑，進而影響植物生長，其中對植物的主要影響有兩個：一是減弱植物的光合作用，二是產(chǎn)生離子毒害和滲透毒害。當鹽脅迫發(fā)生時，植物葉肉細胞上的氣孔關閉，降低了CO2的有效利用率，進而減弱了植物的光合作用，降低了光合效率，同時也減弱了蒸騰作用，可蒸發(fā)水分的減少伴隨著葉片溫度的升高，在萌發(fā)期抑制了幼芽的伸長，降低了出芽率[3]。而植物光合作用的降低也會引起葉片發(fā)黃早衰，降低作物產(chǎn)量[2]。

植物的離子毒害主要是鹽離子(多是鈉離子)積累過多引起的。由于土壤中鹽離子濃度過高，植物根部會吸收過多的鹽離子，運輸?shù)街参矬w的各個部位，致使植物體內(nèi)的鹽離子積累過多。過多的鹽離子會使植物形成生理上的干旱脅迫，同時也會破壞植物體內(nèi)的離子平衡[4]。植物體內(nèi)的pH也會隨之改變，破環(huán)膜結構，影響酶活性，抑制細胞分裂和生長，對植物體造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[2,5]。當然，非生物脅迫也會觸發(fā)植物體內(nèi)響應脅迫的分子機制，增加其抗逆性。

為研究植物鹽脅迫應答機制，對擬南芥施加鹽脅迫，發(fā)現(xiàn)了1個在鹽脅迫下表達量顯著改變的基因AtEXD(At2g25910)。AtEXD是一個具有3’-5’外切酶結構域和KH結構域的蛋白，在進化關系上具有較高的保守性，但目前對擬南芥中AtEXD的功能研究還是未知的。本研究通過酵母雙雜交實驗篩選與AtEXD相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，并分析這些轉(zhuǎn)錄因子參與植物體內(nèi)的脅迫應答機制，以期探究AtEXD基因參與擬南芥鹽脅迫的應答機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1實驗材料 植物材料擬南芥哥倫比亞生態(tài)型col、突變體exd-1(SALK_016153)、exd-2(SALK_080472)為本實驗室保存的植物材料,突變體exd-1(SALK_016153)、exd-2(SALK_080472)為T-DNA插入突變體，T-DNA插入突變體是將一段T-DNA插入該基因內(nèi)，使得該基因在植物體內(nèi)失去作用，不再表達。將成熟的擬南芥種子，用75%的乙醇滅菌10 min，之后用無菌水清洗5～6次，最后一次留水，4 ℃放置春化2～3 d，點種于1/2 MS培養(yǎng)基上，之后放在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為20～24 ℃，長日照光周期為16 h/8 h，相對濕度為70%左右，光照強度為100～120 μmol·m-2·s-1。

1.1.2實驗試劑 超純RNA提取試劑盒購自康為世紀公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Abm公司；KOD高保真酶購自ToYoBo公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自AxyGen公司；pENTR-D-TOPO載體、LR酶購自Invitrogen公司；Taq酶購自Genstar公司；內(nèi)切酶、T4連接酶購自NEB公司；蛋白膠顯影液購自Bio-Rad公司；酵母缺陷型培養(yǎng)基、核酸染色液購自Solarbio公司；抗生素、瓊脂糖購自ThermoFisher公司；感受態(tài)細胞、PCR Maker北京博邁德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1AtEXD蛋白序列分析 將AtEXD蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行模式生物和其他植物的同源性比對，將所有模式生物和其他植物的同源序列分別下載后，利用MEGA軟件分別構建AtEXD與其他模式生物和其他植物的系統(tǒng)進化樹。

1.2.2酵母雙雜篩選轉(zhuǎn)錄因子 將克隆到的基因AtEXD連接到酵母載體pDEST32上獲得重組載體，將其轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞AH109，獲得酵母轉(zhuǎn)化子AtEXD-AD。酵母自激活實驗即將轉(zhuǎn)化子AtEXD-AD與正負對照涂于SD/-leu/+X-α-gal固體培養(yǎng)基上，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。若正對照顯藍，負對照和轉(zhuǎn)化子AtEXD-AD不顯藍，則沒有自激活活性；若正對照和轉(zhuǎn)化子AtEXD-AD顯藍，負對照不顯藍，則有自激活活性。之后將經(jīng)驗證沒有自激活活性的酵母轉(zhuǎn)化子AtEXD-AD與活化好的轉(zhuǎn)錄因子庫菌進行點對點雜交培養(yǎng)，將雜交菌涂于酵母缺陷型培養(yǎng)基(SD/-leu/-trp/+X-α-gal，SD/-leu/-trp/-his，SD/-leu/-trp/-his/-ade)上，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。若某一轉(zhuǎn)錄因子在SD/-leu/-trp/+X-α-gal篩選板上顯藍，在SD/-leu/-trp/-his和SD/-leu/-trp/-his/-ade篩選板上正常生長，則說明該轉(zhuǎn)錄因子與AtEXD相互作用。

1.2.3RT-PCR和Western blot RT-PCR：使用超純RNA提取試劑盒提取擬南芥總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈，在KOD高保真酶的作用下擴增目的基因片段，使用0.8%～1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分離，對電泳條帶進行分析。Western blot：使用蛋白提取液[0.1 mol·L-1EDTA(pH 8.0)，0.12 mol·L-1Tris-HCl(pH 6.8)，4% SDS(pH 7.4)，10% β-巰基乙醇，5%甘油，0.005% 溴酚藍BPB]提取植物蛋白，配制SDS-PAGE膠，上蛋白樣后電泳至溴酚蘭剛出膠停止，轉(zhuǎn)膜后封閉，孵育雙抗后使用蛋白顯影液顯影，拍照。

1.2.4萌發(fā)率統(tǒng)計實驗 選擇鹽處理的濃度梯度，即0、60、90、120、150 mmol·L-1。配制含有各個鹽濃度梯度的1/2 MS培養(yǎng)基(Agar濃度為0.65%)，高溫滅菌后倒板(直徑90 mm)備用。對種子進行消毒滅菌操作，4 ℃春化3 d。將配制好培養(yǎng)基的平板劃分區(qū)域并標記，將種子點種在各自的區(qū)域內(nèi)，每種種子點種25粒。從第2天開始統(tǒng)計并記錄種子的萌發(fā)率，連續(xù)統(tǒng)計10 d以上，利用Microsoft Excel軟件生成萌發(fā)率折線圖。

2 結果與分析

2.1 AtEXD蛋白基本特性分析

對AtEXD進行基本特性分析發(fā)現(xiàn)，AtEXD位于擬南芥2號染色體上，編碼342個氨基酸，蛋白分子量為38.48 kD，具有2個結構域：3’-5’外切酶結構域和KH結構域。利用構建系統(tǒng)進化樹的方法觀察了AtEXD與其他生物中同源蛋白的親緣進化關系。在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索并下載了其他模式生物(大腸桿菌、酵母、線蟲、果蠅、水稻、玉米、小麥、斑馬魚、蛙、大鼠、小鼠、猴、人)中的同源蛋白，發(fā)現(xiàn)除了玉米中有2個同源蛋白外，其他均只有一個同源蛋白，小麥中沒有同源蛋白，這表明AtEXD的同源蛋白在各個模式生物中較為單一。然后利用MEGA軟件構建了AtEXD與其他模式生物的系統(tǒng)進化樹，如圖1A所示，發(fā)現(xiàn)這些同源蛋白有從簡單生物到復雜生物進化的趨勢。AtEXD與其他植物同源蛋白的系統(tǒng)進化樹如圖1B所示，發(fā)現(xiàn)擬南芥AtEXD與同屬同科類的植物進化關系較為相近。以上分析說明AtEXD具有較高的序列保守性，且在進化關系中較為保守。

2.2 與AtEXD進行相互作用的轉(zhuǎn)錄因子及其功能分析

目前沒有任何有關AtEXD功能的研究報道，由于AtEXD有一個KH結構域，而KH結構域可結合DNA并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。為進一步解析AtEXD的功能，利用酵母雙雜實驗篩選了與AtEXD進行相互作用的轉(zhuǎn)錄因子TFs，該轉(zhuǎn)錄因子TFs庫共有1 580個已知的轉(zhuǎn)錄因子TF位點。首先我們進行了AtEXD的自激活實驗，自激活實驗結果顯示酵母轉(zhuǎn)化子AtEXD-AD在SD/-leu/+X-α-gal平板上正常生長并顯藍，說明AtEXD沒有自激活活性(圖2A)。之后將AtEXD-AD與轉(zhuǎn)錄因子TFs庫雜交培養(yǎng)，涂板觀察生長狀況。實驗結果顯示共有10個雜交菌斑能在SD/-leu/-trp/-his/-ade平板上正常生長(圖2B)，表明AtEXD與這10個TFs進行相互作用。之后進一步對這10個TFs進行功能分析發(fā)現(xiàn)(表1)，其中5個TFs(AT5G06960 OBF5/TGA5、AT1G21910 DREB26、AT5G22570 WRKY38、AT4G18170 WRKY28、AT2G16770 bZIP23)參與植物體內(nèi)的脅迫響應機制，例如SA、NaCl、熱等，那么AtEXD也可能參與植物體內(nèi)的脅迫響應機制，這與先前發(fā)現(xiàn)AtEXD在鹽脅迫下表達量顯著改變相一致；3個TFs(AT2G36960 TKI1、AT5G23280 TCP7、AT2G33880 STIMPY/WOX9)參與細胞增殖生長；2個TFs(AT5G27050 AGL101、AT4G11250 AGL52)功能未知。

2.3 獲得AtEXD的遺傳學材料

為了研究AtEXD參與植物體內(nèi)鹽脅迫應答的機制，本研究創(chuàng)建了一些AtEXD的遺傳學材料。本實驗室保存的突變體exd-1(Salk_016153)和exd-2(Salk_080472)是在擬南芥col背景下的T-DNA插入突變體，T-DNA插入位點在AtEXD基因內(nèi)，其中exd-2為外顯子T-DNA插入突變，exd-1為內(nèi)含子T-DNA插入突變(圖3A)。通過在T-DNA插入位點兩側設計引物，進行RT-PCR實驗，結果顯示exd-2無AtEXD表達，而exd-1有少量表達(圖3B)，故exd-2為純和突變體，exd-1則為突變不徹底。為獲得AtEXD的過表達體，將AtEXD連接到pCD3-688(N-FLAG)載體上，利用轉(zhuǎn)基因技術獲得AtEXD的過表達體colAtEXD-FLAG(約40 kD)，Westhern blot實驗進一步驗證了colAtEXD-FLAG為AtEXD的過表達體(圖3C)。

2.4 AtEXD參與擬南芥中的鹽脅迫應答

為獲得AtEXD遺傳學材料的鹽脅迫表型，我們統(tǒng)計了AtEXD突變體和過表達材料在鹽脅迫下的種子萌發(fā)率(圖4、5)。如圖4所示，在0 mmol·L-1NaCl條件下，exd-1、exd-2和col的種子萌發(fā)趨勢一致，且萌發(fā)率在第10天時約為100%。在60 mmol·L-1NaCl條件下，與col相比，exd-1和exd-2在前3 d萌發(fā)較慢。在90 mmol·L-1NaCl條件下，與col相比，exd-1和exd-2萌發(fā)較慢且萌發(fā)率較低。在120 mmol·L-1NaCl條件下，與col相比，exd-1和exd-2的萌發(fā)率較低，約為20%，小于col的萌發(fā)率。這些結果表明，在種子萌發(fā)階段，突變體exd-1和exd-2對鹽脅迫較為敏感。

A：AtEXD與其他模式生物的同源蛋白進化樹分析；B：AtEXD與其他植物的同源蛋白進化樹分析。圖1 AtEXD的蛋白結構及序列分析Fig.1 Protein structure and sequence analysis of AtEXD

A：AtEXD自激活實驗；B：與AtEXD相互作用的轉(zhuǎn)錄因子酵母雙雜篩選結果。圖2 與AtEXD進行相互作用的轉(zhuǎn)錄因子Fig.2 Transcription factors interacting with AtEXD

表1 與AtEXD進行相互作用的轉(zhuǎn)錄因子列表Table 1 List of transcription factors interacting with AtEXD

A：AtEXD突變體T-DNA插入位點原理圖；B：RT-PCR對AtEXD的純合單突變體進行鑒定；C：Westhern blot鑒定AtEXD的過表達體。圖3 遺傳學材料的鑒定結果Fig.3 Identification results of genetic materials

圖4 不同濃度鹽脅迫條件下col、exd-1和exd-2的萌發(fā)率統(tǒng)計Fig.4 Germination rates of col, exd-1 and exd-2 seeds under salt stress with different cocentration

當AtEXD過表達時，過表達材料colAtEXD-FLAG的種子萌發(fā)率統(tǒng)計結果如圖5所示。在0 mmol·L-1NaCl條件下，colAtEXD-FLAG和col的種子萌發(fā)趨勢一致,且萌發(fā)率在第10天時約為100%。在90 mmol·L-1NaCl條件下，與col相比，colAtEXD-FLAG在前4 d萌發(fā)較慢(圖5B)。在120和150 mmol·L-1NaCl條件下，colAtEXD-FLAG的種子萌發(fā)率大于col。由此可以看出，在種子萌發(fā)階段，過表達材料colAtEXD-FLAG的耐鹽性明顯增強。綜上，突變體的鹽敏感性和過表達材料的耐鹽性進一步說明AtEXD參與了擬南芥中鹽脅迫應答。

圖5 鹽脅迫條件下col和col AtEXD-FLAG的萌發(fā)率統(tǒng)計Fig.5 Germination rates of col and col AtEXD-FLAG seeds under salt stress

3 討論

人口持續(xù)增長，保證糧食安全一直是國家的重中之重，然而植物在生長過程中會遭受各種各樣的逆境脅迫。由于逆境脅迫對植物的生長發(fā)育、新陳代謝等產(chǎn)生了極大的不良影響，尤其是造成了一些農(nóng)作物的嚴重減產(chǎn)，科研工作者一直沒有停止對植物應答逆境脅迫的研究。其中鹽脅迫作為對植物影響最大的非生物脅迫之一，一直是科研的熱點領域，解析植物應答鹽脅迫的作用機理具有重大的理論與實踐意義。本研究初步明確了AtEXD基因參與擬南芥中鹽脅迫應答機制。在對AtEXD的遺傳學材料的研究中我們發(fā)現(xiàn)，在種子萌發(fā)階段，突變體exd-1和exd-2具有明顯的鹽脅迫敏感表現(xiàn)型；而當AtEXD過表達時，擬南芥表現(xiàn)出較高的耐鹽性。這表明AtEXD很可能正調(diào)控擬南芥的耐鹽性。

我們利用酵母雙雜交實驗篩選到了一些與AtEXD相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，其中有一半的轉(zhuǎn)錄因子參與擬南芥中逆境脅迫應答機制。例如轉(zhuǎn)錄因子DREB26(AT1G21910)參與植物體的防御系統(tǒng)，響應鹽脅迫、干旱脅迫、滲透脅迫等[9-10]。轉(zhuǎn)錄因子WRKY38參與植物體的生物脅迫和非生物脅迫(冷脅迫、干旱脅迫等)應答，以及水楊酸SA信號通路[11-13]。這些結果為研究AtEXD調(diào)控植物體的耐鹽性提供依據(jù)，同時也為我們提供了新的研究方向——AtEXD是否也在植物體內(nèi)響應其他的逆境脅迫。

在對AtEXD的基本特性分析中發(fā)現(xiàn)AtEXD具有2個結構域：3’-5’外切酶結構域和KH結構域。3’-5’外切酶在植物體內(nèi)的主要功能是降解核苷酸，參與DNA復制、DNA修復、DNA重組、細胞周期調(diào)控等細胞生物學進程[23]。含KH結構域的蛋白主要參與轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性、翻譯沉默和mRNA定位等[24]。同時結合本研究篩選到的轉(zhuǎn)錄因子，其中有3個轉(zhuǎn)錄因子TKI1(AT2G36960)、TCP7(AT5G23280)、STIMPY/ WOX9(AT2G33880)調(diào)控核內(nèi)復制，與染色質(zhì)代謝、分生組織生長和胚胎形成相關[18-19,21-22]。那么AtEXD很可能也參與植物體內(nèi)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，值得進一步深究。綜上，本研究結果為深度解析AtEXD的功能、探究其參與的細胞生物學進程打下了基礎。