譚美芳，譚 佳，曾艷兵，楊 群，李海琴

（江西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，江西南昌 330200）

【研究意義】近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展，現(xiàn)代豬場逐漸趨于集約化，養(yǎng)殖密度不斷擴大，豬的疫病特別是細菌性疫病的發(fā)生也逐漸頻繁，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來了巨大危害，因此控制和消滅規(guī)?；i場的常見細菌性疫病已成為當前能否促進養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[1-2]。豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是定植于豬上呼吸道的一種具有莢膜的革蘭氏陽性球菌，主要引起豬的腦膜炎、全身性敗血癥、胸膜肺炎、關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎等，部分血清型的菌株可引起多發(fā)性漿膜炎、流產(chǎn)和局部膿腫，在世界范圍內(nèi)流行，病發(fā)率和病死率均居高不下，是當前嚴重困擾我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的常見傳染性細菌病之一[3]。因此，檢測臨床健康豬群豬鏈球菌的攜帶情況以及病原菌對抗生素的耐藥情況，對于更好地監(jiān)控豬鏈球菌耐藥性、防治豬鏈球菌病以及有效防控豬鏈球菌的暴發(fā)具有重要意義。

【前人研究進展】表觀健康豬的鼻腔、扁桃體等是豬鏈球菌自然感染部位，不同日齡階段的豬對其均有易感性，其中新生仔豬、哺乳仔豬的發(fā)病率和致死率最高[4]。根據(jù)莢膜抗原成分，可將豬鏈球菌分為35個血清型（1～34、1/2），其中1、2、7 和9 型是豬的常見致病菌，而2 型豬鏈球菌被認為是分布最廣、致病性最強的一種血清型，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，也對人類的生命安全構(gòu)成威脅[5]。目前，生豬產(chǎn)業(yè)主要通過滅活苗和抗生素來預(yù)防和控制豬鏈球菌的感染，但單價疫苗免疫不能對多種血清型產(chǎn)生交叉保護作用，所以通過抗生素治療細菌感染仍是一種常見的手段。養(yǎng)殖戶通過在飼料中長期添加抗生素藥物或者直接肌肉注射來預(yù)防和處理未發(fā)病或已發(fā)病的豬群[6]。近年來，由于抗生素的濫用，特別是在動物飼料中添加抗生素及在疾病治療過程中不合理用藥，很容易造成細菌敏感性降低，產(chǎn)生耐藥菌株，增加細菌病的治療難度，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展[7]?？偨Y(jié)2000年以來的豬鏈球菌耐藥的報道，目前我國豬鏈球菌對氧氟沙星、阿莫西林、多西環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、萬古霉素、林可霉素、紅霉素、大觀霉素等均表現(xiàn)差異耐藥性[8]?！颈狙芯壳腥朦c】豬鏈球菌在江西省規(guī)模化豬場中的流行和耐藥情況尚不清楚。而且，當前對豬鏈球菌耐藥性的報道主要是針對發(fā)病豬群，對臨床上表觀健康豬群中攜帶的豬鏈球菌的耐藥性問題缺乏調(diào)查研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選定江西省部分大型規(guī)?；i場，調(diào)查臨床表觀健康豬群的豬鏈球菌流行率，對分離株進行耐藥性測定，旨在掌握該菌在省內(nèi)的流行現(xiàn)狀，為養(yǎng)殖場合理用藥提供科學依據(jù)和技術(shù)支持，以期科學有效地防控豬鏈球菌病在豬場中的蔓延和流行，降低養(yǎng)殖成本，促進經(jīng)濟效益最大化，同時從源頭上減少耐藥菌株的產(chǎn)生，降低耐藥菌株傳播的風險。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

1.1.1 健康豬群鼻拭子 樣本來自2017—2019年江西省遂川縣、南昌縣、萍鄉(xiāng)市和泰和縣4個市縣的5個規(guī)?；i場。在臨床健康的保育豬群中隨機挑選豬只總計314 頭，經(jīng)體積分數(shù)75%酒精棉擦拭豬鼻表面后，用無菌棉簽采集鼻液拭子總計314份。將鼻拭子保存在生理鹽水中，4 ℃冷藏運輸和保存。

1.1.2 參考菌株 本研究所用的陽性參考菌株為豬鏈球菌2型四川分離株SC19，由華中農(nóng)業(yè)大學分離，本實驗保存。根據(jù)美國臨床與實驗室標準學會（Clinical and laboratory standards institute，CSLI）推薦，藥敏實驗過程中的質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC6538，購自上海奧陸生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

PremixTaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA marker 購自大連Takara 公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、哥倫比亞CNA 瓊脂基礎(chǔ)、5%脫纖維綿羊血購自青島海博生物技術(shù)有限公司；新生牛血清（無噬菌體低內(nèi)毒素）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；細菌微量生化反應(yīng)管和革蘭氏陽性球菌藥敏試紙盒購自杭州濱和微生物試劑有限公司。引物由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.3 細菌分離培養(yǎng)及初步鑒定

用無菌接種環(huán)蘸取鼻拭子液，劃線接種至含5%脫纖維綿羊血的CNA 平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。選取具有溶血環(huán)、半透明、邊緣整齊的針尖狀小菌落進行革蘭氏染色，觀察形態(tài)。若鏡檢結(jié)果為散在的或短鏈狀的革蘭氏陽性球菌，則為可疑菌落，接種到新鮮的CNA血平板上繼續(xù)劃線純培養(yǎng)。細菌經(jīng)過純培養(yǎng)后進行生化鑒定，用微量生化反應(yīng)管進行糖發(fā)酵和其他生化實驗，觀察結(jié)果。選取部分疑似菌株，由武漢塞維爾生物科技有限公司通過掃描電鏡觀察細菌形態(tài)。

1.4 豬鏈球菌的PCR鑒定

用煮沸法制備細菌基因組DNA。鑒定豬鏈球菌16S rDNA 的引物、鑒定豬鏈球菌2 型cps2J基因的引物見表1。反應(yīng)體系（20 μL）為：2×Taqmixture 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL，ddH2O 6μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，共28 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物進行10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳。在所有的PCR 反應(yīng)中，SC19 的基因組用作陽性對照，ddH2O 作為陰性對照。

表1 本實驗所涉及的引物Tab.1 Primers used in this study

1.5 藥敏試驗

采用Kirby-Baner（KB）紙片擴散法檢測豬鏈球菌的藥敏情況：將細菌接種至含5%新生牛血清的TSA平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；用無菌棉簽蘸取3～5個單菌落，于1 mL生理鹽水中稀釋，將菌液濃度調(diào)整至0.5麥氏比濁度；另取無菌棉簽浸潤菌懸液，均勻涂布到新鮮TSA培養(yǎng)基表面；待平板室溫干燥5 min，用鑷子取藥敏片貼在瓊脂表面；貼好藥敏片后15 min內(nèi)，將平板在37 ℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)后取出平板，量取抑菌圈直徑，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼看不見細菌為限，判讀結(jié)果，以敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）報告。

2 結(jié)果

2.1 豬鏈球菌形態(tài)觀察

細菌在含新生牛血清的TSA固體培養(yǎng)基上生長良好，形成透明、濕潤、圓滑、邊緣整齊的小菌落，具有淡藍色熒光。在含5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24 h，呈均勻渾濁。在CNA血平板上呈現(xiàn)α溶血。革蘭氏染色結(jié)果顯示，豬鏈球菌在固體培養(yǎng)基上以單在和雙球菌為主，部分呈短鏈狀態(tài)（圖1a），在液體培養(yǎng)基中則以長鏈形態(tài)為主。通過掃描電鏡（50 000×）能觀察到卵圓形的細菌形態(tài)（圖1b）。

圖1 豬鏈球菌形態(tài)（標尺：0.5μm）Fig.1 Morphology of S.suis

2.2 細菌的生化鑒定

實驗結(jié)果顯示，臨床分離的豬鏈球菌菌株對葡萄糖、核糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、乳糖、棉籽糖、阿拉伯糖、七葉苷、精氨酸、MR和VP的生化反應(yīng)結(jié)果差異很大，對糖的發(fā)酵不活潑，無規(guī)律不穩(wěn)定，難以作為分類依據(jù)。

2.3 豬鏈球菌PCR鑒定

本研究共采集到314 份表觀健康豬群的鼻拭子樣本。通過對豬鏈球菌特異性基因（16S rDNA）的PCR 鑒定，共計有112 株疑似菌株擴增到了294 bp 的目的基因片段（圖2），證實為豬鏈球菌，檢出率35.67%。對這112株豬鏈球菌再次進行PCR 鑒定，目的基因是豬鏈球菌2型特異性基因cps2J，目的片段大小為500 bp（圖3）。此次研究未檢測到豬鏈球菌2型菌株，檢出率為0%。

圖2 豬鏈球菌16S rDNA擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of S.suis 16S rDNA

圖3 豬鏈球菌2型的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification of S.suis type 2

2.4 豬鏈球菌流行病學分析

本次調(diào)查中，表觀健康豬群中的豬鏈球菌總檢出率為35.67%，各個規(guī)?；i場的檢出率統(tǒng)計學差異顯著（統(tǒng)計學方法：One-way analysis of variance，P＜0.001）（表2）。其中，南昌的規(guī)模豬場檢出率為62.86%，顯著高于其他地區(qū)（P＜0.001），萍鄉(xiāng)和泰和的3家規(guī)模豬場的細菌檢出率無明顯差異（P＞0.05）。不同地區(qū)的豬鏈球菌的檢出率結(jié)果見表2。

2.5 耐藥性監(jiān)測

用苯唑西林、青霉素G、紅霉素、大觀霉素、克拉霉素、萬古霉素、克林霉素、氯霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氟沙星、多粘菌素B、復方新諾明和呋喃妥因等16 種抗生素對分離鑒定出的豬鏈球菌菌株進行藥敏試驗，結(jié)果見表3。

表2 2017—2019年江西省規(guī)?；i場中SS流行情況Tab.2 The prevalence of SS in large-scale pig farms in Jiangxi Province from 2017 to 2019

藥敏試驗結(jié)果顯示，112株豬鏈球菌對數(shù)種抗生素的耐藥情況嚴重，有96.43%的菌株對克林霉素耐藥，91.96%的菌株對四環(huán)素耐藥。其次耐藥情況比較嚴重的是：克拉霉素耐藥率66.96%、紅霉素耐藥率66.07%、大觀霉素耐藥率53.57%。對于其他抗生素，豬鏈球菌菌株表現(xiàn)出高度或者中度敏感性，如對萬古霉素的敏感率可達99.11%，對青霉素的敏感率達96.43%，對米諾環(huán)素的敏感率為95.54%。

表3 SS分離株的藥敏試驗結(jié)果（n=112）Tab.3 The antibiotic susceptivity profiles of SS isolates

從統(tǒng)計結(jié)果看，地域因素對豬鏈球菌耐藥的影響也非常明顯（表4）。5個規(guī)?；i場分離的菌株，除對克林霉素、米諾環(huán)素、四環(huán)素和萬古霉素的耐藥或者敏感情況一致外，對其余12種抗生素的耐藥率差異較大。以紅霉素為例，5個豬場的耐藥率分別為58.33%、36.36%、75.00%、95.00%、92.86%，差異非常顯著（統(tǒng)計學方法：One-way analysis of variance，P＜0.001）。豬場A、豬場B、豬場D 與豬場E 都分離出對左氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、苯唑西林、諾氟沙星、復方新諾明耐藥的菌株，豬場C 則未分離出對這6 種抗生素耐藥的菌株。從該豬場分離出的菌株，對紅霉素、大觀霉素的耐藥率也與其他四家豬場的差異顯著。此外，在豬場B和豬場E均分離到對青霉素G耐藥的菌株，其余3家豬場則沒有分離到。

表4 不同規(guī)模化豬場的SS耐藥情況分析Tab.4 Analysis of SS antibiotic-resistance results in different pig farms

2.6 豬鏈球菌多重耐藥檢測結(jié)果

表觀健康豬群所攜帶的豬鏈球菌的耐藥譜以多重耐藥為主。如表5所示，檢測的112株細菌中，5重耐藥菌有26株，占比23.21%；6重耐藥菌有28株，占比25.00%；7、8、9重耐藥菌的占比也較高。在此次試驗中，從豬場B分離出的編號為SS040的菌株，對左氟沙星、環(huán)丙沙星、苯唑西林、克林霉素、諾氟沙星、青霉素G、四環(huán)素、復方新諾明、多粘菌素B、紅霉素、克拉霉素等11種抗生素耐藥，對氯霉素和米諾環(huán)素2種抗生素中介。從豬場E分離出的編號為SS100的菌株，對左氟沙星、環(huán)丙沙星、苯唑西林、克林霉素、諾氟沙星、青霉素G、四環(huán)素、復方新諾明、多粘菌素B、紅霉素、克拉霉素、大觀霉素等12種抗生素耐藥。

112 株豬鏈球菌中，地域因素對豬鏈球菌耐藥譜的影響也非常明顯，來自相同豬場的菌株的耐藥譜比較接近，不同豬場間的耐藥譜差異較大。5家豬場分離出的豬鏈球菌普遍對克林霉素和四環(huán)素耐藥。除此之外，豬場A的12株分離菌主要對紅霉素、克拉霉素和大觀霉素耐藥；豬場B的44株分離菌主要對左氟沙星、環(huán)丙沙星、苯唑西林、諾氟沙星、復方新諾明、呋喃妥因和大觀霉素耐藥；豬場C的8株分離菌主要對呋喃妥因、紅霉素和克拉霉素耐藥；豬場D的20株分離菌主要對左氟沙星、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、紅霉素和克拉霉素耐藥；豬場E的28株分離菌主要對苯唑西林、諾氟沙星、復方新諾明、紅霉素和克拉霉素耐藥。

表5 SS菌株的多重耐藥性情況分析Tab.5 Analysis of multiple drug resistance of SS strains

3 討論與結(jié)論

伴隨我國養(yǎng)豬業(yè)集約化程度越來越高，細菌性疾病的發(fā)生趨勢逐漸復雜[1]。豬感染豬鏈球菌的病例也被頻繁報道[5,9]。豬鏈球菌屬于條件性致病菌，作為常在菌群可被感染豬、康復豬或健康豬攜帶。在一個被豬鏈球菌嚴重污染過的豬場，豬的帶菌率可達100%，但該病的發(fā)病率不同時期各不相同，通常情況下低于5%[10]。近幾年來，我國廣大農(nóng)牧區(qū)及許多養(yǎng)豬場出現(xiàn)了來勢猛烈、傳播快、病程短、死亡率高的敗血型鏈球菌病，造成了重大的經(jīng)濟損失[10]。南京農(nóng)業(yè)大學對華南地區(qū)屠宰群中豬鏈球菌的流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，401 份屠宰豬的扁桃體的陽性檢出率38.4%[11]。華中農(nóng)業(yè)大學動物疫病診斷中心對全國21 個省市送檢的12 452 份臨床病料進行細菌分離和鑒定，從中分離到致病菌3 926 株，其中豬鏈球菌占所分離細菌總數(shù)37.42%[12]。本研究對江西省省內(nèi)規(guī)?；i場進行豬鏈球菌的流行病學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌在臨床健康豬群中的檢出率為35.67%，與上述大規(guī)模的豬鏈球菌流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)一致。另外，本次調(diào)查中表觀健康豬群的鏈球菌2型檢出率為0%。2011—2012年，江西省疾病預(yù)防控制中心在曾發(fā)生過豬鏈球菌感染人的景德鎮(zhèn)市和崇仁縣開展健康豬攜帶豬鏈球菌的狀況調(diào)查，從301份鼻拭子和扁桃體樣品中分離2株豬鏈球菌2型，分離率也僅為0.66%[13]。據(jù)江蘇省獸醫(yī)研究所報告，江蘇地區(qū)健康豬群對豬鏈球菌2型42.6%的攜帶率[14]，這與上述兩次江西省的調(diào)查數(shù)據(jù)差異較大，可能是因為地區(qū)差異。

從臨床用藥的角度看，豬鏈球菌菌株對萬古霉素的敏感率最高，但是因為萬古霉素對機體的副作用較大（神經(jīng)損傷、腎功能損傷等），一般不建議作為抗生素療法的首選。β-內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素G）作為臨床上長期使用的殺菌藥物，仍然對豬鏈球菌保持著高度敏感性，是理想的治療或者預(yù)防豬鏈球菌病的抗生素。

過度使用抗生素而引起細菌耐藥發(fā)展速度加快是一個共識，抗生素的常態(tài)化使用（飼料添加劑，消毒劑，食品和飼料的防腐劑或凈化劑）被認定是耐藥菌產(chǎn)生和耐藥基因傳遞的主要因素[15]。研究數(shù)據(jù)表明，國內(nèi)豬鏈球菌對臨床使用頻率較高的抗生素耐藥情況嚴重，主要有四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素類、喹諾酮類以及磺胺類抗生素，并且出現(xiàn)了大量多重耐藥株[16]。本次試驗結(jié)果表明，省內(nèi)豬鏈球菌的耐藥情況已相當嚴峻。分離出的112株豬鏈球菌，至少對1種抗生素耐藥，多重耐藥菌株占大多數(shù)，甚至出現(xiàn)了11 重、12 重耐藥菌株。幾乎全部的菌株都對四環(huán)素耐藥，可能是由于四環(huán)素類抗生素被廣泛用于飼料添加劑，超標的劑量導致細菌選擇性進化，耐藥情況嚴重。此外，藥敏試驗結(jié)果顯示，已有耐青霉素的菌株出現(xiàn)，不容樂觀。耐藥菌株往往在抗生素超標使用的“選擇性壓力”下出現(xiàn)，因此強化養(yǎng)殖從業(yè)人員科學合理使用抗生素的意識非常重要。

通過此次調(diào)查結(jié)果可以看出，各個規(guī)?；i場的豬鏈球菌流行率和耐藥率差異較大，從側(cè)面反映出各個豬場養(yǎng)殖模式和管理的差異性，例如在日常生產(chǎn)過程中抗生素的選擇、使用情況等。為預(yù)防豬鏈球菌的發(fā)生，豬場應(yīng)注意改善環(huán)境條件，加強飼養(yǎng)管理，盡量減少致病的應(yīng)激因素[17]。臨床癥狀出現(xiàn)時，若選擇了對細菌不敏感的抗生素，導致治療過程費時費力，無效且增加成本，更易產(chǎn)生耐藥性[12]。因此，有條件的規(guī)模化豬場可以考慮定期分離菌株，進行藥敏試驗，一旦發(fā)病，盡快選擇敏感藥物合理使用，同時在發(fā)病期間對整個豬群進行藥物預(yù)防，使疫病得到有效控制，減少損失。規(guī)?；i場應(yīng)高度重視細菌耐藥性問題，通過實驗室摸清豬場致病菌種類，建立完善、合理的細菌性疾病監(jiān)測方案，防患于未然。

致謝：華中農(nóng)業(yè)大學胡巧博士和合作豬場對本研究給予了支持和幫助，謹致謝意!