劉 林，何 麗，林長高，周 穎，隗黎麗

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045）

【研究意義】近年來，淡水水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日益嚴重，由此導(dǎo)致的藍藻水華污染問題已受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。一些常見的藍藻類如銅綠微囊藻和魚腥藻等可在其細胞內(nèi)部合成產(chǎn)生多種微囊藻毒素（microcystins，MCs）[1]，其中微囊藻毒素-LR（microcystin-LR，MC-LR）是MCs異構(gòu)體中最為常見且毒性最強的一種毒素[2]。已有研究表明MC-LR 可通過口、鰓或皮膚進入魚體內(nèi)，干擾魚類的正常生長發(fā)育，危害魚類種群安全。同時，MC-LR 進入魚體后還能通過食物鏈的生物富集對人類健康造成威脅[3]。魚類體表是抵御MC-LR 進入魚體的第一道防線，但且其體表上皮細胞無法形成角質(zhì)化，比哺乳動物體表上皮細胞更為脆弱[4]。因此，了解MC-LR 對魚類體表上皮細胞所造成的影響具有十分重要的生態(tài)學(xué)意義。【前人研究進展】MC-LR 可通過特定的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，即有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（organic anion transporting polypeptides，OATPs）主動轉(zhuǎn)運進入魚體內(nèi)[5]，并蓄積在肝臟、腎臟和性腺等組織器官中，從而產(chǎn)生多種毒性作用[6]。如Jiang 等[7]研究表明，MC-LR 可通過促進鯉魚肝臟中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，誘導(dǎo)魚體肝細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡，最終導(dǎo)致肝臟損傷。而Huang等[8]則指出，MC-LR暴露可對草魚腎細胞中細胞骨架相關(guān)基因的表達產(chǎn)生影響，導(dǎo)致細胞骨架發(fā)生解體或重排。除此之外，MC-LR還可通過誘導(dǎo)細胞自噬、線粒體損傷、細胞膜完整性喪失或脂質(zhì)過氧化等機制發(fā)揮毒性作用[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c】有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)：MC-LR可通過細胞膜擴散進入人表皮細胞中，并對細胞增殖、細胞骨架及細胞器結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。亦有研究[12]指出當動物體表受損時，MC-LR可更快的通過表皮滲透進入細胞中。這些研究提示MC-LR 接觸動物體表后產(chǎn)生的影響值得重視，但MC-LR 在魚類體表中的研究卻較為匱乏?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以鯉魚EPC 細胞作為魚類體表上皮細胞模型，采用MTT 法檢測MC-LR對EPC 細胞活力的影響，同時對MC-LR 暴露后的EPC 細胞顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)進行觀察，以期為進一步研究MC-LR對魚類上皮細胞的影響的機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

鯉魚EPC細胞由江西師范大學(xué)付建平老師饋贈。M199培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）及胎牛血清（FBS）購于BioInd 生物科技公司。青鏈霉素混合液（青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/L）、二甲基亞砜（DMSO）及MTT 購于索萊寶科技有限公司，其中MTT 用磷酸緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2～7.4，博士德生物科技公司）溶解至5×103mg/L，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?.5%戊二醛、1%鋨酸和丙酮等電鏡切片制作所用試劑購于賽維爾生物科技有限公司。MC-LR（純度＞95%，Taiwan Algal Sci?ence Inc）用超純水溶解至1×103mg/L的母液保存于-20 ℃?zhèn)溆?，使用前用細胞培養(yǎng)液（含10%FBS、1%青鏈霉素混合液和89%M199培養(yǎng)基）稀釋至所需濃度。

1.2 細胞培養(yǎng)

將細胞凍存管置于28 ℃水浴鍋中迅速解凍細胞，加入PBS后離心收集細胞，棄上清，再用PBS洗2～3遍后加入細胞培養(yǎng)液，吹散細胞制成單細胞懸液，將細胞懸液接種在75 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，置于28 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液。待培養(yǎng)瓶中的細胞密度生長至90%左右時，即可使用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代至96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測細胞活力

將EPC 細胞以1.2×104個/孔接種于96 孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞鋪滿孔底，隨后棄去培養(yǎng)液，再分別加入0.05，0.5，5，50 mg/L MC-LR的細胞培養(yǎng)液于96孔板中，同時設(shè)置空白組和對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液。每孔加入100μL 培養(yǎng)液和20μL MTT，在培養(yǎng)箱中孵育4 h 后將培養(yǎng)液吸去，然后加入150μL DMSO，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育10 min。待孔板中的甲臢溶解后，用酶標儀在570 nm 波長處測定各孔吸光值，根據(jù)OD570值計算細胞活力（%）。同時，采用SPSS 25.0 軟件進行線性回歸分析，將試驗組細胞活力（%）作為響應(yīng)頻率，對照組細胞活力（100%）作為總數(shù)，MC-LR 處理濃度作為協(xié)變量，獲得MC-LR對EPC細胞的IC50（24 h）。細胞活力（%）計算公式如下：

1.4 電鏡切片制作與觀察

將EPC 細胞以4×105個/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)，待孔板中的細胞鋪滿孔底后，分別加入0、4.5 mg/L（1/4IC50）和18 mg/L（IC50）MC-LR的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡（江南XD-202）下觀察并拍照。棄去培養(yǎng)液，先用PBS 洗2～3遍后，再用胰蛋白酶消化并收集細胞，接著再用PBS 洗1～2遍，隨后加入2.5%戊二醛4 ℃下預(yù)固定4 h，再用PBS 沖洗，然后用1%鋨酸溶液于4 ℃后固定2 h，再經(jīng)梯度丙酮脫水，接著采用環(huán)氧樹脂812 包埋，Leica EM UC7 超薄切片機切片，最后用醋酸鈾和硝酸鉛雙染色，日立Hitachi-600透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及多重比較（Duncan），結(jié)果用“平均值±標準差”表示，以P＞0.05表示無顯著差異，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC-LR對鯉魚EPC細胞活力的影響

不同濃度MC-LR處理EPC細胞24 h后，細胞活力變化結(jié)果如表1所示。當MC-LR濃度為0.05 mg/L時，EPC 細胞活力與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；濃度為0.5 mg/L 和5 mg/L 時EPC 細胞活力顯著低于對照組（P＜0.05），當MC-LR 濃度為50 mg/L 時，EPC 細胞活力下降至25.138%，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。根據(jù)回歸分析計算得出MC-LR對EPC細胞的IC50（24 h）為18 mg/L。

表1 MC-LR對EPC細胞活力的影響Tab.1 Effects of MC-LR on EPC cell activity

2.2 MC-LR對鯉魚EPC細胞顯微結(jié)構(gòu)的影響

分別使用0，4.5，18 mg/L MC-LR 處理鯉魚EPC細胞24 h。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞呈梭形或不規(guī)則的多邊形，可以正常貼壁生長，細胞數(shù)量較多，形態(tài)比較整齊規(guī)則，細胞間距小，排列緊密（圖1A）；4.5 mg/L MC-LR 組細胞發(fā)生皺縮，并有少量細胞死亡（圖1B）；而在18 mg/L MC-LR 組中可觀察到細胞數(shù)量減少，多數(shù)細胞發(fā)生皺縮，已有部分死亡細胞失去固有形態(tài)，由多邊形或梭形變?yōu)閳A形，并脫離培養(yǎng)瓶底部，飄浮在培養(yǎng)液中（圖1C）。

圖1 MC-LR對EPC細胞顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of MC-LR on the microstructure of EPC cells

2.3 MC-LR對鯉魚EPC細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

利用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞胞質(zhì)致密；線粒體分布廣泛，形態(tài)正常，呈卵圓形，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)清晰完整（圖2A和B）。4.5 mg/L MC-LR 組細胞內(nèi)線粒體明顯腫脹，嵴排列紊亂、數(shù)目減少甚至溶解消失，呈現(xiàn)輕微空泡化。同時胞質(zhì)內(nèi)已出現(xiàn)少量脂滴（圖2C 和D）。18 mg/L MC-LR 組細胞胞質(zhì)可見圓形脂滴增大；線粒體同樣發(fā)生腫脹，嵴溶解消失，空泡化現(xiàn)象嚴重（圖2E和F）。

圖2 MC-LR對EPC細胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of MC-LR on the ultrastructure of EPC cells

3 討論與結(jié)論

3.1 MC-LR對鯉魚EPC細胞活力的影響

已有研究指出MC-LR的分子量較大且分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，通常較難通過質(zhì)膜擴散進入細胞，而肝細胞和腎上皮細胞等細胞中特有的OATPs轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可將MC-LR主動轉(zhuǎn)運進入細胞中[13]。因此，有關(guān)MC-LR對動物細胞活力的研究多集中在肝、腎細胞系中。在哺乳動物中，Chen等[14]曾提出0.2～12.8μmol/L MC-LR暴露24 h可導(dǎo)致人肝癌細胞活力受到抑制。在魚類中亦有研究表明，較低濃度MC-LR（0.001～0.1 mg/L）暴露24 h 后草魚腎細胞活力顯著提高[8]，對草魚肝細胞活力則無顯著影響[15]。近幾年來，有關(guān)MC-LR 對哺乳動物上皮細胞活力的研究也有相關(guān)報道。Kozdeba等[11]研究表明，MC-LR（10μmol/L）暴露24 h后未對人角質(zhì)形成細胞活力產(chǎn)生顯著影響，但當暴露時間持續(xù)至48 h 或96 h 時，細胞活力顯著下降。Zhou等[16]則提出12.5～50 μmol/L MC-LR 暴露24 h 可對大鼠小腸上皮細胞活力產(chǎn)生顯著抑制作用。然而，MC-LR 對魚類上皮細胞活力的影響卻鮮少報道。在本研究中，0.05 mg/L MC-LR 暴露24 h 未對EPC 細胞活力產(chǎn)生顯著影響，當MC-LR 濃度上升至0.5 mg/L 時，EPC 細胞活力被顯著抑制。而后隨著MC-LR濃度上升，EPC 細胞活力也隨之下降，這一結(jié)果與MC-LR 在大鼠小腸上皮細胞[16]和人支氣管上皮細胞[17]中的研究類似。在Lu等[18]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，MC-LR（10～150 mg/L）處理24 h可對斑馬魚肝細胞活力產(chǎn)生抑制作用，且隨著暴露濃度上升，細胞活力逐漸降低。這表明MC-LR 可對多種細胞系的活性產(chǎn)生抑制作用，且均存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

在本研究中，MC-LR 對EPC 細胞的IC50（24 h）較低，僅為18 mg/L。而在Liu 等[19]的研究中則表明MC-LR 對小鼠卵巢顆粒細胞的IC50為34 mg/L，MC-LR 對斑馬魚肝細胞的半數(shù)最大效應(yīng)濃度EC50（24 h）高達80.123 mg/L[18]。不同類型的細胞攝取MC-LR 的能力不同，這可能是導(dǎo)致MC-LR 對不同細胞的IC50或EC50存在差異的原因[5]。除此之外，細胞對MC-LR 的敏感程度還可能受到細胞培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式等因素的影響。因此，今后深入研究MC-LR 對魚類細胞的影響時，需從細胞類型、細胞培養(yǎng)方式或條件等方面進行綜合分析。

3.2 MC-LR對鯉魚EPC細胞顯微結(jié)構(gòu)的影響

利用光學(xué)顯微鏡觀察EPC 細胞發(fā)現(xiàn)，對照組EPC 細胞貼壁生長，形狀較為規(guī)則整齊；4.5 mg/L MCLR組細胞形態(tài)發(fā)生皺縮并觀察到少量細胞死亡；而18 mg/L MC-LR組中可觀察到部分細胞死亡，細胞形態(tài)變圓皺縮，漂浮在培養(yǎng)液中。這一結(jié)果與之前對其它細胞的研究比較相似，如馬軍國[20]將MC-LR（0.5～50μmol/L）暴露于肝癌細胞24～72 h后發(fā)現(xiàn)，隨著MC-LR 濃度升高及暴露時間延長，細胞形態(tài)由多邊形或梭形變?yōu)閳A形，細胞貼壁能力減弱并懸浮在培養(yǎng)基中。亦有研究表明，MC-LR（12.5、25μmol/L）暴露72 h可導(dǎo)致小鼠結(jié)腸癌細胞形態(tài)變圓，貼壁能力減弱[21]。以上研究表明，MC-LR可對細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響，今后亦可通過體內(nèi)試驗進一步探究MC-LR 的細胞毒性效應(yīng)。但有研究發(fā)現(xiàn)，人胚腎細胞和中國倉鼠卵巢細胞經(jīng)MC-LR（1 或5μmol/L）暴露30 min 后其顯微結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生明顯變化。當這兩種細胞經(jīng)OATPs過表達處理后，MC-LR暴露即可導(dǎo)致這兩種細胞形態(tài)發(fā)生皺縮，并脫離培養(yǎng)板底部[22]。這表明MC-LR對細胞顯微結(jié)構(gòu)的影響與細胞中OATPs含量同樣存在聯(lián)系。

3.3 MC-LR對鯉魚EPC細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

利用透射電子顯微鏡觀察EPC 細胞發(fā)現(xiàn)，對照組EPC 細胞胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)清楚，嵴排列整齊。而MC-LR 處理后的細胞胞內(nèi)線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)模糊，內(nèi)部發(fā)生降解，空泡化嚴重。這一結(jié)果與其它研究類似，如Zhao 等[23]研究表明，鯽魚經(jīng)注射MC-LR 3～48 h 后，低劑量組（20μg/kg）魚體肝臟細胞線粒體內(nèi)明顯空泡化，而高劑量組（200μg/kg）則表現(xiàn)為線粒體腫脹，線粒體基質(zhì)和嵴濃縮。Li 等[24]則提出：MCLR（200μg/kg）注射鳙魚24 h后可導(dǎo)致魚體肝臟細胞線粒體嵴擴張，當濃度上升至500μg/kg時則發(fā)生線粒體嵴和基質(zhì)的溶解消失。在哺乳動物中同樣發(fā)現(xiàn)，飲用水中添加MC-LR（0.005、0.03 mg/L）3個月后小鼠肝臟細胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)腫脹變形、內(nèi)部結(jié)構(gòu)喪失，外膜破裂等現(xiàn)象[25]。線粒體是機體調(diào)節(jié)細胞信號通路和功能的重要細胞器，細胞分化、細胞氧化還原、蛋白質(zhì)及脂類合成等生理過程都與線粒體有關(guān)[26]。同時，線粒體代謝在MC-LR 介導(dǎo)ROS 生成而導(dǎo)致細胞損傷的毒性作用機制中發(fā)揮了重要作用[27]。這些研究結(jié)果均表明線粒體是MC-LR 發(fā)揮毒性作用的重要靶標，今后還需圍繞線粒體進一步探討MC-LR對EPC細胞的毒性作用機制。

本研究中，隨著MC-LR 濃度的上升，EPC 細胞內(nèi)脂滴的出現(xiàn)也逐漸增加。在其它研究中也觀察到了類似現(xiàn)象，如Li 等[28]發(fā)現(xiàn)當太湖中MCs 的爆發(fā)時，鰱魚肝臟中MCs 可達6.84μg/g，且其肝臟中的脂滴累積明顯。亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)鰱魚或羅非魚經(jīng)注射（100μg/kg）MCs 48 h 后，其肝細胞中也可觀察到大量脂滴[29]。脂滴的形成與機體脂類合成與分解、細胞膜的形成以及多種信號傳導(dǎo)等過程密切相關(guān)[30]。脂滴還可作為細胞儲存脂質(zhì)的場所，當細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不足時，機體可利用脂滴分解獲得的脂肪酸為線粒體氧化過程供能[31]。MC-LR暴露后細胞內(nèi)脂滴的出現(xiàn)也預(yù)示了其可能對魚體細胞內(nèi)脂肪的合成代謝產(chǎn)生了一定影響。

MC-LR 暴露可對鯉魚EPC 細胞活力產(chǎn)生顯著抑制作用，并且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，此外，MC-LR 還可導(dǎo)致EPC 細胞形態(tài)皺縮、線粒體空泡化、脂滴的產(chǎn)生以及細胞死亡。本研究展示MC-LR 可能通過誘導(dǎo)EPC細胞線粒體損傷等機制發(fā)揮其細胞毒性效應(yīng)，但具體的作用機制還需進一步探討。