韓玉梅，謝晶瑩，畢英杰，許淑娟，馮若飛

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030； 2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)是一種重要的人畜共患病原體，感染后可引起動物和人類發(fā)生腦炎和心肌炎，以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病和繁殖障礙等多種疾病[1]。2005年我國從病死仔豬和流產(chǎn)胎兒中分離到EMCV，表明我國存在腦心肌炎病毒的感染[2]。另外，多個國家和地區(qū)曾相繼報道EMCV感染后引起腦心肌炎的流行和爆發(fā)，給世界畜牧業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。由于本病毒在豬和人之間有密切聯(lián)系，通過對人群進(jìn)行EMCV抗體檢測，證實(shí)人也可以感染EMCV[5]，因此認(rèn)為EMCV感染具有潛在的公共衛(wèi)生學(xué)意義。EMCV是一個無囊膜單股正鏈的小RNA病毒，病毒衣殼由4個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成，其中VP1位于病毒粒子最表面，抗原性最強(qiáng)，且與病毒的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、受體吸附和脫殼有關(guān)[6-7]。

天然免疫是機(jī)體進(jìn)化過程中形成的免疫防御機(jī)制，是機(jī)體自我保護(hù)的第一道防線，也是獲得性免疫的基礎(chǔ)。病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)是最早被觸發(fā)的機(jī)制，主要識別的是病毒的核酸或病毒感染過程中產(chǎn)生的核酸類似物。這些PAMP可被宿主細(xì)胞的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別，誘發(fā)一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)限制病毒的增殖和傳播。

病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，病毒的核酸可以被Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs，如TLR3、7和9)、RIG-I樣受體(RIG-I like receptors，RLRs，如RIG-I和MDA5)和近年來發(fā)現(xiàn)的DNA受體(deoxyribonucleic acid like receptors，如DAI和IFI16)識別。其中，RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)和MDA5(melanoma differentiation associated protein 5)是相似的兩種受體，識別不同種類的病毒RNA，它們有著相同的下游信號分子MAVS(mitochondrial antiviral signaling)[8-9]。RIG-I和MDA5識別TRAF2/6(TNF receptor associated factor 2/6)活化IKK(IκB kinase)激酶復(fù)合物，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)；另一方面通過招募TRAF3和TBK1(TANK binding kinase 1)，促進(jìn)IRF3的磷酸化[10-11]。活化的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和IRF3(interferon response factor 3)進(jìn)入細(xì)胞核后，協(xié)同促進(jìn)Ⅰ型干擾素基因的表達(dá)。此外，感染病毒后，接頭蛋白STING(stimulator of interferon genes)與MAVS相互作用，招募TBK1(TANK binding kinase 1)，通過自身寡聚化形成MAVS-STING-TBK1-IRF3復(fù)合物， 促進(jìn)TBK1對IRF3的磷酸化激活，從而介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)[12-13]，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[14-15]。然而，病毒在長期進(jìn)化過程中，為了自身繁殖，通過多種策略來抑制或逃避宿主天然免疫應(yīng)答，不同病毒蛋白能夠通過不同方式拮抗天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而有效促進(jìn)自身在宿主細(xì)胞中的復(fù)制[16-17]。

對口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)的研究表明，VP1可通過與可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白結(jié)合抑制Ⅰ型干擾素反應(yīng)[18]，EMCV作為與FMDV具有相似結(jié)構(gòu)的病毒，其VP1的研究多集中于疫苗領(lǐng)域，其與宿主蛋白的反應(yīng)及參與干擾素信號通路的研究尚未報道。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建EMCV VP1真核表達(dá)載體，探索其對病毒增殖和干擾素信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與毒株

人胚腎細(xì)胞HEK293、豬腎細(xì)胞PK 15、EMCV PV21株(登錄號：X74312)均由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白酶、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；Trans-Blot Turbo Mini-size Transfer Stacks購自BIO-RAD公司；細(xì)胞總RNA提取試劑RNAiso plus、LA-Taq聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、pMD-18T vector購自TaKaRa公司；隨機(jī)引物、DEPC水購自生工生物工程(上海)股份有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；SYBR Green購自ABI公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent購自Invitrogen公司；Opti-MEM購自Gibco公司；鼠抗HA標(biāo)簽多克隆抗體購自北京全式金公司，鼠抗β-actin抗體購自Abcam公司；山羊抗鼠IgG-HRP購自Jackson公司；Hyper Singal高敏ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自四正柏公司；RIPA細(xì)胞裂解液及PMSF蛋白保護(hù)劑均購自碧云天生物技術(shù)研究所；大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞BL21、pCMV-HA載體由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 pCMV-HA-VP1表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

根據(jù)GenBank公布的EMCV(登錄號：X74312)序列，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì) VP1基因的表達(dá)引物，上下游分別引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和BglⅡ，正向序列為5′-GGAATTCGGATGGGAGTAGAAAACGCTGAAAAAG-3′；反向序列為5′-GAAGATCTTCACTCTAGCATCAAGACTCCAGC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。應(yīng)用RNA提取試劑盒提取EMCV的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。目的基因與載體pCMV-HA連接成功后送至西安擎科生物技術(shù)股份有限公司測序，將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCMV-HA-VP1。

1.2.2 Western blot 檢測蛋白表達(dá)

分別將HEK293和PK-15細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent將重組質(zhì)粒pCMV-HA-VP1 和空載質(zhì)粒pCMV-HA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，36 h后收集細(xì)胞檢測VP1表達(dá)。一抗為鼠抗HA多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；二抗為山羊抗鼠IgG-HRP，室溫孵育1 h，洗膜后，ECL顯色。

1.2.3 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)

分別用pCMV-HA-VP1和pCMV-HA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入70%丙酮(預(yù)冷)固定15 min，之后棄去固定液并加封閉液于37 ℃孵育1 h；棄去封閉液后加入鼠抗HA 抗體；PBS 洗4次，每次5 min，再加入山羊抗鼠IgG(Dylight594)二抗，37 ℃避光孵育1 h；PBS洗3次，每次5 min，進(jìn)行DAPI染核，避光染色5 min，用PBS洗2次后加入抗淬滅熒光衰減封片劑封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)

將重組質(zhì)粒pCMV-HA-VP1和空載質(zhì)粒pCMV-HA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h按100 TCID50感染EMCV，感染36 h后收集細(xì)胞，通過TRIZol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后利用本課題組前期建立的TaqMan實(shí)時熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行病毒拷貝數(shù)的檢測[19]。所需引物及探針序列見表1。

1.2.5 病毒感染力的測定(TCID50)

將HEK293細(xì)胞鋪在96孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到95%融合度時進(jìn)行接毒。將前期轉(zhuǎn)染VP1重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒感染EMCV后收集的培養(yǎng)上清用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋，即10-1、10-2……10-11，然后每孔加入100 μL病毒懸液，37 ℃孵育2 h后棄去毒液，無血清培養(yǎng)基清洗3次后，每孔補(bǔ)加200 μL含3%NBS DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在24、48、72、96和120 h觀察細(xì)胞，記錄細(xì)胞病變結(jié)果，每個病毒稀釋度做8個重復(fù)。根據(jù)96孔板細(xì)胞病變孔數(shù)判定毒價，重復(fù)3次。最后根據(jù)Reed-Muench兩氏法計(jì)算TCID50毒價。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測IFN-β與通路相關(guān)因子mRNA水平

用1 μg重組質(zhì)粒pCMV-HA-VP1和空載質(zhì)粒pCMV-HA分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后按100 TCID50感染(或未感染)EMCV，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后分別收集上清和細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)TRIzol提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于實(shí)時熒光定量PCR，檢測IFN-β與RLRs信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平，相關(guān)實(shí)時熒光定量PCR引物序列見表2。

表1 EMCV TaqMan探針法實(shí)時熒光定量PCR引物及探針

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

1.2.7 ELISA檢測IFN-β表達(dá)

參照ELISA試劑盒相關(guān)操作說明檢測上述實(shí)驗(yàn)收集的細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-β的含量。用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和D450值計(jì)算樣品中IFN-β表達(dá)量，相關(guān)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 CCK8檢測VP1對細(xì)胞的毒性影響

將不同濃度VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至24孔板HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，重懸后每個濃度4個平行轉(zhuǎn)接至96孔板，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染組，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)4 h，然后在酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測吸光度，參考CCK8試劑說明書計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 EMCV感染HEK293細(xì)胞對Ⅰ型IFN信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

EMCV感染HEK293細(xì)胞12 h后，IFN-β、MDA5、MAVS、TRAF3、TBK1和IRF3 mRNA顯著上升，感染24 h時IFN-β、MDA5、MAVS、TRAF3、TBK1和IRF3 mRNA顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示上述結(jié)果差異極其顯著(圖1-A)；而通過對病毒VP1蛋白的Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，病毒感染24 h能明顯檢測到VP1蛋白的表達(dá)(圖1-B)。以上結(jié)果提示，EMCV感染24 h后Ⅰ型IFN信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)下降可能與VP1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001.圖1 EMCV感染對Ⅰ型IFN信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的實(shí)時熒光定量PCR檢測Fig.1 Real time fluorescence quantitative PCR detected the mRNA level of type Ⅰ IFN signaling pathway related factor during EMCV infection

2.2 EMCV VP1蛋白表達(dá)驗(yàn)證及細(xì)胞活力檢測

利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCMV-HA-VP1，轉(zhuǎn)染后通過IFA實(shí)驗(yàn)證明VP1蛋白在HEK293細(xì)胞中表達(dá)(圖2-A)，表明構(gòu)建的VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，通過Western-blot用HA抗體和VP1抗體證明，VP1重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞(圖2-B)和PK-15細(xì)胞(圖2-C)中特異性表達(dá)。CCK8試劑盒分析發(fā)現(xiàn)，不同劑量(0.5、1.0、1.5 μg)VP1對細(xì)胞活力無影響(圖2-D)。綜上結(jié)果表明，VP1可在細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，并且對細(xì)胞無毒性作用。

2.3 VP1蛋白對EMCV體外增殖的影響

過表達(dá)VP1細(xì)胞感染EMCV后，實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，VP1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制顯著高于對照組(圖3-A)。TCID50檢測也得到相似結(jié)果(圖3-B)，說明VP1可顯著促進(jìn)EMCV在HEK293細(xì)胞中的增殖。

2.4 過表達(dá)VP1對Ⅰ型IFN信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

實(shí)時熒光定量PCR檢測VP1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中Ⅰ型IFN信號通路相關(guān)因子mRNA，結(jié)果如圖4所示，與空載對照組相比，VP1單獨(dú)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞可顯著抑制細(xì)胞IFN-β、RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1和IRF3的mRNA水平，表明EMCV VP1可抑制細(xì)胞Ⅰ型IFN信號通路的活化。

2.5 VP1對EMCV誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN信號通路活化的影響

實(shí)時熒光定量PCR檢測VP1對EMCV誘導(dǎo)的IFN-β與下游刺激基因的影響，結(jié)果如圖5所示。VP1轉(zhuǎn)染組經(jīng)EMCV誘導(dǎo)后，Ⅰ型IFN信號通路中相關(guān)因子MDA5、RIG-I、MAVS、TBK1、IRF3、IFN-β，以及干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)ISG15和ISG56 mRNA水平顯著低于空載EMCV感染組，表明VP1蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)可顯著抑制EMCV誘導(dǎo)Ⅰ型IFN信號通路相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平。

圖2 VP1在不同細(xì)胞中的表達(dá)與細(xì)胞活力檢測Fig.2 Expression of VP1 in different cell lines and cell viability detection

圖3 實(shí)時熒光定量PCR和TCID50檢測EMCV病毒拷貝數(shù)和病毒感染力Fig.3 EMCV virus copy number and virus titer were detected by real time fluorescence quantitative PCR and TCID50 assay

圖4 VP1對Ⅰ型IFN信號通路相關(guān)因子mRNA的影響Fig.4 Effect of VP1 on type Ⅰ IFN signaling pathway related factors mRNA expression

2.6 VP1對Ⅰ型IFN信號通路關(guān)鍵蛋白MDA5和MAVS表達(dá)的影響

VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后Western-blot檢測Ⅰ型IFN信號通路關(guān)鍵適配器分子MDA5和關(guān)鍵接頭蛋白MAVS的表達(dá)，與空載組相比，VP1的表達(dá)可明顯減少細(xì)胞內(nèi)MAVS蛋白的表達(dá)，但對MDA5表達(dá)無明顯影響(圖6)。結(jié)果提示，VP1可能通過靶向降低MAVS蛋白表達(dá)抑制RLR信號通路，進(jìn)而通過抑制IFN-β產(chǎn)生達(dá)到促進(jìn)病毒增殖的目的。圖7是根據(jù)本研究結(jié)論推測的EMCV VP1蛋白可能通過靶向調(diào)控MAVS抑制IFN-β信號通路的模式圖，但具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的探討和研究。

3 討論

機(jī)體受到病原體感染時刺激細(xì)胞產(chǎn)生的IFNs是RLRs信號通路調(diào)控表達(dá)的一種重要的抗病毒因子[20]，而MAVS是RLRs信號通路中調(diào)控IFNs表達(dá)必需的接頭蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染MAVS基因敲除的小鼠時可導(dǎo)致小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞無法產(chǎn)生干擾素，使小鼠死亡率增加[21-22]。另外，大量研究表明，多種病毒通過靶向抑制MAVS表達(dá)阻止IFNs產(chǎn)生，如鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)的NS1蛋白通過與宿主MAVS蛋白的羧基端相互結(jié)合抑制IFNs信號通路的活化[23]。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus， HBV)的X蛋白通過與宿主MAVS蛋白相互作用下調(diào)IFNs產(chǎn)生[24]。B型GB病毒(GB virus B，GB-B)的NS3/4A蛋白通過裂解宿主MAVS蛋白影響其正確定位而抑制IFNs產(chǎn)生[25]。

同科病毒FMDV的研究表明，RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1會阻止宿主RNA感受器的激活，也可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)作為直接的先天免疫拮抗劑拮抗宿主細(xì)胞先天免疫防御機(jī)制[26-28]。已報道EMCV的干擾素拮抗蛋白有非結(jié)構(gòu)蛋白3C、2C及先導(dǎo)蛋白L等，研究表明，EMCV 2C蛋白可作為一種新型的Ⅰ型干擾素拮抗劑，其通過與MDA5相互作用抑制先天免疫反應(yīng)，EMCV 2C蛋白的V26氨基酸在抑制IFN-β信號通路中起著至關(guān)重要的作用[29]。EMCV的2B蛋白激活NLRP3 炎癥小體[30]。EMCV 3C蛋白干擾TANK-TBK1-IKKε-IRF3復(fù)合物，從而降低IFN-β的產(chǎn)生[31]。然而，有關(guān)EMCV結(jié)構(gòu)蛋白參與拮抗干擾素產(chǎn)生的研究尚未報道。

圖5 VP1對EMCV誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN信號通路相關(guān)因子mRNA的影響Fig.5 Effect of VP1 on EMCV induced type Ⅰ IFN signaling pathway related factors mRNA expression

圖6 Western-blot檢測VP1對MDA5和MAVS表達(dá)的影響Fig.6 Effects of VP1 on the expression of MDA5 and MAVS by Western-blot

圖7 EMCV VP1抑制IFN-β信號通路模式圖Fig.7 Pattern of EMCV VP1 suppressing IFN-β signaling pathway

本研究前期發(fā)現(xiàn)，EMCV感染HEK293細(xì)胞前期可誘導(dǎo)細(xì)胞顯著上調(diào)IFN-β與RLRs信號通路相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平，然而，在EMCV感染后期又呈顯著的抑制作用。參考FMDV病毒VP1蛋白拮抗干擾素信號通路活化的研究，發(fā)現(xiàn)EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1在EMCV誘導(dǎo)或單獨(dú)表達(dá)的情況下均能抑制IFN-β表達(dá)和Ⅰ型干擾素信號通路相關(guān)因子及其下游干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，這些結(jié)果表明，EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1參與IFNs拮抗作用。進(jìn)一步通過免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，VP1蛋白明顯抑制宿主MAVS蛋白的表達(dá)。對此研究結(jié)果我們推測，EMCV可能將宿主MAVS蛋白作為病毒逃避宿主天然免疫應(yīng)答的作用靶點(diǎn)。另外，自噬(autophagy)途徑或泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome system，UPS)是胞內(nèi)蛋白降解的主要方式[32]。結(jié)構(gòu)蛋白VP1在參與天然免疫應(yīng)答的過程中可能利用這些途徑降解了MAVS蛋白的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制RLRs信號通路活化和減少IFN-β產(chǎn)生，最終達(dá)到促進(jìn)EMCV體外增殖的目的，但具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討和研究。

4 結(jié)論

本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了腦心肌炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-VP1，并且實(shí)現(xiàn)了VP1蛋白與HA標(biāo)簽的融合表達(dá)。通過實(shí)時熒光定量PCR、ELISA和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，EMCV VP1蛋白顯著抑制IFN-β及其下游效應(yīng)基因的表達(dá)，同時初步發(fā)現(xiàn) EMCV VP1蛋白通過靶向降低 MAVS蛋白表達(dá)量抑制IFN-β信號通路的活化。本研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)腦心肌炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白參與機(jī)體免疫應(yīng)答，不僅豐富了腦心肌炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)研究內(nèi)容，同時為抗病毒藥物的應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)和研究思路。