孫紅娟，陳 仲，賀 迪，高 杉，王 擺，關(guān)曉燕，蔣經(jīng)偉，董 穎，周遵春

(1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點試驗室，遼寧 大連 116023； 2.凌海市達(dá)蓮海珍品養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，遼寧 錦州 121209 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動物門、海參綱、仿刺參屬，代表著原始后口動物，在進(jìn)化和發(fā)育生物學(xué)研究中占據(jù)重要地位[1]。仿刺參生活在潮間帶泥沙底質(zhì)區(qū)域，周圍環(huán)境中存在大量的病原體，這表明機(jī)體已經(jīng)進(jìn)化形成一套有效的免疫系統(tǒng)。無脊椎動物依賴于先天性免疫系統(tǒng)參與免疫反應(yīng)，主要通過細(xì)胞表面的模式識別受體(PRR)特異地識別病原相關(guān)分子模式(PAMP)，如蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、核酸和這些生物大分子的衍生物[2]。Toll樣受體(TLR)是一個在進(jìn)化上高度保守的免疫受體家族，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成[3]。Toll樣受體胞質(zhì)區(qū)是一個與白細(xì)胞介素-1(IL-1)受體家族具有高度同源性的TLR和IL-1受體結(jié)構(gòu)區(qū)域(TIR)，能夠募集含有TIR結(jié)構(gòu)的接頭蛋白參與信號傳導(dǎo)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種接頭蛋白，包括髓樣分化因子(MyD88)、類MyD88接頭(MAL)、誘導(dǎo)干擾素β且含有TIR區(qū)的接頭(TRIF)、TRIF相關(guān)接頭分子(TRAM)和含有Sterile α和armadillo基序的蛋白(SARM)，表明機(jī)體在受到病原體刺激后會產(chǎn)生與特定接頭蛋白相對應(yīng)的免疫應(yīng)答[4]。根據(jù)接頭蛋白的不同可以將TLR信號通路分為MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑。

SARM是最新被發(fā)現(xiàn)的TIR結(jié)構(gòu)蛋白，位于MyD88非依賴信號傳導(dǎo)途徑。該接頭蛋白從線蟲到哺乳動物中均為高度保守，基因序列包含2個SAM結(jié)構(gòu)域，1個C端的TIR結(jié)構(gòu)域和N端的ARM重復(fù)結(jié)構(gòu)域[5]。線蟲和文昌魚的相關(guān)研究表明，SARM參與了免疫應(yīng)答信號通路以及神經(jīng)發(fā)育的過程[6-8]。

目前已經(jīng)報道的仿刺參Toll樣受體信號通路相關(guān)基因有Toll、TLR3、MyD88、TRAF6、TRAF3、IRAK4、P105和Rel[9-13]，尚未見MyD88非依賴途徑接頭蛋白的相關(guān)報道。筆者通過克隆仿刺參SARM基因，分析其結(jié)構(gòu)序列和進(jìn)化地位，探索其在仿刺參免疫應(yīng)答和生長發(fā)育過程中的表達(dá)模式，為研究Toll樣受體信號通路的進(jìn)化及其在發(fā)育和免疫方面的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用仿刺參體質(zhì)量(6.4±1.1) g，取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院引育種中心。試驗之前暫養(yǎng)一周，水溫16～18 ℃，pH 8.3～8.5，鹽度29。試驗采用燦爛弧菌(Vibriosplendidus)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifacien)、希瓦氏菌(Shewanellabaltica)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)4種病原菌進(jìn)行免疫刺激試驗。各菌株在2216E培養(yǎng)基中，溫度28 ℃，150 r/min的條件下培養(yǎng)。當(dāng)密度達(dá)到108cfu/mL時，進(jìn)行刺激試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因全長克隆

參照動物組織RNA提取試劑盒(TIANGEN)說明書進(jìn)行仿刺參體腔細(xì)胞RNA提取。對總RNA的濃度和完整性進(jìn)行檢測，合格后用于后續(xù)試驗。利用Primer 5.0設(shè)計RACE特異引物(GSP)(表1)。試驗使用SMARTer 5′/3′RACE試劑盒(Clontech)對仿刺參SARM基因5′端進(jìn)行克隆,其反應(yīng)體系見表2。

表1 仿刺參SARM的 RACE引物

表2 仿刺參SARM的5′RACE PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。當(dāng)上述反應(yīng)沒有產(chǎn)生特異性條帶時，可以采用巢式PCR，用1 μL稀釋過的初級PCR 產(chǎn)物代替用于RACE的cDNAs。反應(yīng)程序和初級RACE PCR的相同。

試驗使用3′-Full Race PrimeScripTMRTase試劑盒(Takara)對仿刺參SARM基因的3′端進(jìn)行克隆，首先使用已設(shè)計好的Outer Primer克隆其反應(yīng)體系(表3)。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min?？筛鶕?jù)實際情況適當(dāng)?shù)靥岣呋蚪档屯嘶饻囟?37～65 ℃)。在設(shè)置退火溫度時，最好使溫度維持在37～65 ℃。從延伸時間溫度來看，以1 min/kb為宜。當(dāng)上述反應(yīng)沒有產(chǎn)生特異性條帶時，可以采用Inner Primer進(jìn)行二次克隆(表3)。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表3 仿刺參SARM的3′RACE PCR反應(yīng)體系

1.2.2 組織和發(fā)育樣品

試驗所研究的組織包括：管足、體壁、腸道、呼吸樹和體腔細(xì)胞。取15頭健康仿刺參，每5頭為1組，分為3組，將每組中同一組織的混合樣放入1個含有RNA保存液的離心管中。4 ℃條件下保存12 h，后置于-80 ℃超低溫冰箱，用于組織表達(dá)分布研究。獲取仿刺參不同發(fā)育時期(受精卵、囊胚期、原腸期、小耳、中耳、大耳、樽型、五觸手和稚參)樣品，保存方法同上。

1.2.3 免疫刺激試驗

將300頭健康的仿刺參平均分為5組：對照組與4個菌刺激組。采用滅菌注射器對仿刺參進(jìn)行體腔注射，對照組每頭仿刺參注射100 μL滅菌海水，試驗組每頭仿刺參注射100 μL菌液。試驗采用的注射劑量參考仿刺參體腔細(xì)胞中免疫相關(guān)酶的應(yīng)答變化試驗[14]。注射4、24、48、72 h和96 h后解剖獲取體腔液，每組每個時間點隨機(jī)選取15頭，并隨機(jī)分成3份，樣品混合后在4 ℃，3000 r/min的條件下離心10 min，收集沉淀的體腔細(xì)胞。提取總RNA后使用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL，反轉(zhuǎn)錄RNA的總量不超過900 ng，添加RNase Free dH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 5 min，85 ℃ 5 s。經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA樣品保存在-20 ℃，用于qRT-PCR試驗。

熒光定量PCR使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)試劑盒，以Cytb作為內(nèi)參基因[15]，具體信息見表4。反應(yīng)體系：ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，cDNA模板1 μL，TB Green Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus) (2×Conc.)10 μL，正反引物各0.8 μL，dH2O 7 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 25 s，40個循環(huán)。每個反應(yīng)重復(fù)3次。

表4 仿刺參SARM熒光定量引物信息

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用美國國立生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測；采用在線工具Expert Protein Analysis Systerm(http://www.expasy.org/tools/)進(jìn)行核酸、氨基酸的翻譯，親水性等分析；采用蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及注釋平臺(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析；采用多重序列比對(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進(jìn)行序列相似性分析；氨基酸序列全長進(jìn)行Clustal W對比后采用MEGA 4.0軟件來構(gòu)建鄰接進(jìn)化樹, Bootstrap值設(shè)為1000次重復(fù)。根據(jù)qRT-PCR所獲取的Ct值，使用軟件REST 384 v.2 (Relative Expression Software Tool，REST)進(jìn)行分析，試驗組和對照組之間發(fā)生的表達(dá)變化采用隨機(jī)配對檢驗分析法計算得到[16]。相對表達(dá)量選取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的方式表示。當(dāng)P<0.05時，表明具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 仿刺參SARM基因的序列分析

通過RACE技術(shù)，獲得仿刺參SARM基因已知部分序列的3′和5′端的序列，拼接得到cDNA，全長為3874 bp，命名為AjSARM，GenBank登錄號MN906447。AjSARM基因的5′非編碼區(qū)131 bp，3′非編碼區(qū)1331 bp，開放閱讀框為2412 bp(圖1)。將完整的開放閱讀框進(jìn)行翻譯，結(jié)果顯示，AjSARM基因編碼803個氨基酸，預(yù)測分子量為89.97 ku，理論等電點為7.76，不存在跨膜結(jié)構(gòu)。BLASTX比對后發(fā)現(xiàn)，AjSARM基因與棘冠海星(Acanthasterplanci)SARM基因序列最為相似，核酸序列相似度為50%。

圖1 AjSARM基因的cDNA序列和預(yù)測的氨基酸序列全長Fig.1 Full-length cDNA sequences and deduced amino acid sequences of AjSARM gene

應(yīng)用SMART軟件對AjSARM蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，AjSARM蛋白由2個SAM結(jié)構(gòu)域以及1個C端的TIR結(jié)構(gòu)域組成(圖2a)。通過Swiss Model對AjSARM蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(圖2b)。

圖2 AjSARM蛋白的二級結(jié)構(gòu)(a)和三級結(jié)構(gòu)(b)示意Fig.2 Schematic diagram of the secondary structure (a) and tertiary structure of AjSARM(b) 圖2a中的數(shù)值表示AjSARM蛋白的氨基酸序列長度. The values in Fig.2a indicate the length of amino acids in AjSARM.

2.2 仿刺參SARM蛋白序列的進(jìn)化分析

為了對AjSARM蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化分析，將處于不同進(jìn)化地位的10個物種的氨基酸序列全長(表5)進(jìn)行Clustal W對比后使用MEGA 4.0版本中的鄰接方法構(gòu)建AjSARM蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1000次重復(fù)。研究結(jié)果顯示，AjSARM蛋白與棘冠海星、紫色球海膽的親緣關(guān)系最近(圖3)。

2.3 SARM基因在仿刺參不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)模式

實時熒光定量PCR試驗測得SARM基因在仿刺參不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)結(jié)果(圖4)。以管足為對照，AjSARM基因在體腔細(xì)胞中的表達(dá)量最高，其次是體壁、腸道、管足和呼吸樹。以稚參為對照，其他8個發(fā)育時期AjSARM基因的表達(dá)均上調(diào)。從小耳時期到五觸手時期，AjSARM基因的表達(dá)量較穩(wěn)定，均高于前3個時期。其中AjSARM基因在五觸手時期表達(dá)量最高，在稚參期表達(dá)量最低。

表5 不同物種SARM氨基酸序列

圖3 AjSARM蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of AjSARM 使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建AjSARM蛋白序列的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1000次重復(fù)；物種名縮寫及登錄號參考表5. Neighbor-joining tree of AjSARM is constructed by the MEGA version 4.0; the value of bootstrap is 1000 replicates; abbreviations and the accession numbers of SARM sequences are listed in Tab.5.

圖4 SARM基因在仿刺參不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)模式Fig.4 Expression of SARM in different tissues and developmental stages in sea cucumber A. japonicus a.SARM在不同組織中的分布，以管足(1×)為對照；b.SARM在不同發(fā)育階段的分布，以稚參(1×)為對照；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05). a.the distribution of AjSARM in different tissues, the expression level of AjSARM in tube feet as control (1×); b.the distribution of AjSARM at developmental stages, the expression level of AjSARM at juvenile stage as control (1×); * represent significant difference at the level of P<0.05 from the control.

2.4 不同病原菌刺激后仿刺參SARM基因的表達(dá)變化

通過4種病原菌對仿刺參進(jìn)行免疫刺激，采用實時熒光定量方法檢測體腔細(xì)胞中AjSARM基因在刺激后4、24、48 h和96 h的表達(dá)變化情況。在燦爛弧菌刺激組，AjSARM基因在4 h和24 h都下調(diào)，48 h上調(diào)后72 h又顯著下調(diào)，直到96 h才顯著上調(diào)。在假交替單胞菌組，AjSARM基因表達(dá)水平在注射后4、24 h和48 h均下調(diào)，到72 h表達(dá)水平開始上調(diào)，96 h表達(dá)水平顯著上調(diào)7倍。在希瓦氏菌組，AjSARM基因的表達(dá)變化情況和燦爛弧菌組相似，在4、24 h和72 h均處于下調(diào)表達(dá)，在48 h和96 h表達(dá)水平上調(diào)。在蠟樣芽孢桿菌組，AjSARM基因在4 h表達(dá)水平下調(diào)，隨后在24 h和48 h表達(dá)水平上調(diào)，在72 h表達(dá)水平小幅度下調(diào)后在96 h表達(dá)水平顯著上調(diào)。

圖5 仿刺參體腔細(xì)胞中AjSARM基因在4種病原菌刺激條件下的表達(dá)變化Fig.5 Relative expression levels of AjSARM in coelomocytes of sea cucumber A. japonicus challenged by four pathogens 試驗采用4種病原菌進(jìn)行體腔注射，劑量為100 μL/頭；AjSARM的相對表達(dá)量以Cytb的表達(dá)水平作為對照；柱形圖代表相對表達(dá)量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，*表示差異顯著(P<0.05). Four different pathogens are conducted by coelomic injection for each animal with 100 μL；relative expressions of AjSARM are normalized to the expression of Cytb; the histogram indicates mean expression level of 3 tested pools±SE; * represents significant difference at the level of P<0.05 from the control.

3 討 論

仿刺參是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害的發(fā)生成為限制其發(fā)展的重要因素。近年來對仿刺參免疫病害相關(guān)研究已經(jīng)成為熱點，包括基因的克隆[9-13,17-20]、轉(zhuǎn)錄組測序[21-24]和miRNA-mRNA相互作用[25-31]等研究。仿刺參TLR信號通路MyD88依賴途徑的研究比較深入，對于MyD88非依賴途徑的研究相對較少。在哺乳動物中，MyD88依賴途徑通過快速激活NF-κB和MAPK產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮免疫功能，MyD88非依賴途徑通過誘導(dǎo)IFN-β，緩慢激活NF-κB和MAPK產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮免疫功能[32]。在MyD88非依賴途徑中，TLR3和TLR4可以識別細(xì)菌或病毒所產(chǎn)生的PAMPs，通過TRAM或TRIF以及SARM的共同作用將信號傳遞給下游分子。在仿刺參轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)TRAM和TRIF的基因片段，但是鑒定到了SARM基因的部分片段，這一接頭分子的發(fā)現(xiàn)將為仿刺參MyD88非依賴途徑的研究奠定基礎(chǔ)。

3.1 仿刺參SARM基因的序列特征

SARM基因具有高度的保守性，從節(jié)肢動物到哺乳動物中均普遍存在[33-34]。筆者采用RACE法克隆獲得AjSARM基因的cDNA全長為3874 bp，開放閱讀框為2412 bp，編碼803個氨基酸。二級結(jié)構(gòu)由2個SAM結(jié)構(gòu)域以及1個C端的TIR結(jié)構(gòu)域組成，這和典型的SARM基因結(jié)構(gòu)域相比缺少了N端的ARM區(qū)。對紫色球海膽的SARM氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)也缺少ARM區(qū)，但是在棘冠海星中卻含有ARM重復(fù)序列。秀麗隱桿線蟲SARM基因的同源物TIR-1的N末端含有一段冗余序列，然而在文昌魚和人類中未出現(xiàn)，推測這段冗余序列在進(jìn)化過程中消失了[35]。仿刺參SARM基因的結(jié)構(gòu)差異是否會影響其功能，筆者通過熒光定量PCR技術(shù)對AjSARM基因在仿刺參不同發(fā)育階段和不同病原菌刺激后的表達(dá)模式進(jìn)行了探索，為解析AjSARM基因的功能奠定基礎(chǔ)。

3.2 仿刺參SARM基因的功能分析

研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲SARM(TIR-1)基因參與了嗅覺神經(jīng)的發(fā)育過程[6]。本試驗采用實時熒光定量PCR檢測AjSARM基因在仿刺參不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)AjSARM基因從受精卵開始到原腸胚期均為低表達(dá)，從小耳期開始至五觸手時期都是高表達(dá)。Bishop等[36]使用免疫學(xué)手段檢測了黑海參(Holothuriaatra)幼體的神經(jīng)發(fā)生，發(fā)現(xiàn)黑海參神經(jīng)起源于耳狀幼體的原腸胚頂端。AjSARM基因正是從仿刺參小耳期開始出現(xiàn)高表達(dá)的，推測該基因參與了仿刺參神經(jīng)發(fā)育的過程。

SARM基因不僅參與了秀麗隱桿線蟲神經(jīng)元發(fā)育過程，還能有效地參與免疫應(yīng)答[6-7]。在組織分布試驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，AjSARM基因在體腔細(xì)胞中的表達(dá)量最高。體腔細(xì)胞作為仿刺參重要的免疫效應(yīng)器，在應(yīng)對不同病原體刺激時能產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，因此試驗選取體腔細(xì)胞來檢測AjSARM基因如何應(yīng)對4種病原菌的刺激。在燦爛弧菌、假交替單胞菌和希瓦氏菌刺激組，AjSARM基因在4 h和24 h均為被抑制表達(dá)，然而在蠟樣芽孢桿菌組，24 h表達(dá)上調(diào)。除了希瓦氏菌組外，其他3個組的AjSARM基因在96 h表達(dá)量達(dá)到最高。AjSARM基因在應(yīng)對不同病原菌刺激后不同時間點所表現(xiàn)出的動態(tài)表達(dá)模式表明它參與了仿刺參體腔細(xì)胞免疫應(yīng)答的過程。

4 結(jié) 論

SARM基因作為MyD88非依賴途徑的接頭分子，在Toll樣受體信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。采用RACE法對仿刺參SARM基因進(jìn)行全長克隆，獲得cDNA全長為3874 bp，開放閱讀框為2412 bp，編碼803個氨基酸。對氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)存在TIR保守結(jié)構(gòu)域，但是和其他物種的SARM蛋白結(jié)構(gòu)存在一定的差異。筆者在mRNA層面對AjSARM基因的功能進(jìn)行了初步探索。采用實時熒光定量PCR方法對AjSARM基因在不同發(fā)育階段和不同病原菌刺激后的表達(dá)模式進(jìn)行分析，試驗結(jié)果表明，AjSARM基因參與了仿刺參的發(fā)育和免疫應(yīng)答的過程。本試驗不僅探索了仿刺參MyD88非依賴途徑接頭分子SARM的功能，豐富了仿刺參Toll樣受體信號通路研究，同時為棘皮動物免疫系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了科學(xué)依據(jù)。