寧為民，溫崇慶，黃雪敏，柳敬旺，陳杰世，呂杰偉，梁華芳，薛 明

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088 )

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)自引進(jìn)我國(guó)以來(lái)創(chuàng)造了極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，優(yōu)質(zhì)苗種的供應(yīng)至關(guān)重要。凡納濱對(duì)蝦幼體培育期間極少甚至零換水，育苗水體環(huán)境相對(duì)封閉，加之餌料殘骸、排泄和代謝廢物積聚，易誘導(dǎo)水質(zhì)惡化和菌群失衡，造成病害暴發(fā)和幼體大量死亡[1-2]。近年來(lái)利用有益微生物開(kāi)展對(duì)蝦微生態(tài)育苗的研究和應(yīng)用日益增多，并取得了一定成效[3]。但常用水產(chǎn)益生菌如芽孢桿菌、光合細(xì)菌、乳酸菌和酵母菌等大多源自陸生環(huán)境，對(duì)海水的適應(yīng)能力較差，作用效果短。

海洋紅酵母泛指能適應(yīng)海水環(huán)境并帶粉紅、紅色或橙紅色的酵母菌，大多屬擔(dān)子菌門(mén)、微球黑粉菌綱、鎖擲酵母目、鎖擲酵母科、紅酵母屬(Rhodotorula)。紅冬孢酵母(Rhodosporidium)、鎖擲孢酵母(Sporidiobolus)和囊擔(dān)菌(Cystobasidium)等屬中的某些種與紅酵母屬種類(lèi)特征相近[4-5]，可視為廣義上的紅酵母。海洋紅酵母富含蛋白質(zhì)、糖原和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及不飽和脂肪酸、類(lèi)胡蘿卜素和葡聚糖等多種活性成分，懸浮性好，特別適宜作為海產(chǎn)動(dòng)物幼體的開(kāi)口餌料和整個(gè)幼體期的補(bǔ)充性餌料[6]。海洋紅酵母還具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、培養(yǎng)周期短、適應(yīng)能力強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是一類(lèi)較理想的水產(chǎn)益生菌[6-7]。海洋紅酵母作為益生菌提高對(duì)蝦生長(zhǎng)、存活和免疫等方面的研究已有一些報(bào)道[8-13]，商品化的海洋紅酵母制劑在對(duì)蝦育苗和養(yǎng)成期間也有一定程度的使用。但海洋紅酵母在對(duì)蝦幼體培育方面的研究報(bào)道較少[14]，而投菌量和投菌頻次對(duì)對(duì)蝦幼體的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

筆者在從海產(chǎn)動(dòng)物腸道分離鑒定紅酵母的基礎(chǔ)上，通過(guò)凡納濱對(duì)蝦幼體培育試驗(yàn)篩選最適菌株，進(jìn)而研究目標(biāo)菌投菌時(shí)間、劑量和頻次對(duì)幼體存活和變態(tài)的影響，為海洋紅酵母在對(duì)蝦幼體培育中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分離用海產(chǎn)動(dòng)物

凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、翡翠貽貝(Pernaviridis)、華貴類(lèi)櫛孔扇貝(Mimachlamysnobilis)和褐藍(lán)子魚(yú)(Siganusfuscescens)等，均為湛江地區(qū)海鮮市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的鮮活海產(chǎn)品。

1.2 海洋紅酵母的分離

將待分離動(dòng)物體表洗凈并按種類(lèi)分組，75%酒精體表消毒后無(wú)菌操作取出各組動(dòng)物腸道分別勻漿，各組勻漿液分別劃線或稀釋涂布于含有0.05%氯霉素的YPD培養(yǎng)基(葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母提取物1%，瓊脂粉1.8%，陳海水配制)，30 ℃培養(yǎng)5 d，每日觀察，并挑取帶有紅色或橙紅色的酵母單菌落于YPD平板劃線純化，純化后轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD斜面，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

純化的酵母菌再以YPD平板劃線，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察和記錄菌落特征，期間挑取少量菌體與0.1%堿性美蘭染液混勻，置于顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞個(gè)體形態(tài)特征，并通過(guò)測(cè)微尺對(duì)每株菌10個(gè)以上細(xì)胞測(cè)量個(gè)體大小，以寬(范圍)×長(zhǎng)(范圍)表示酵母菌大小。

1.3 碳源利用

參考文獻(xiàn)[15]的方法，取各酵母菌1 mL新鮮細(xì)胞懸液(約107cfu/mL)分別與冷卻至約42 ℃的碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻，凝固后用無(wú)菌小勺依次加入葡萄糖、乳糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、淀粉、蔗糖和肌醇作為碳源，30 ℃培養(yǎng)4 d。觀察記錄碳源周?chē)欠癯霈F(xiàn)生長(zhǎng)圈。結(jié)合碳源利用譜和形態(tài)特征對(duì)分離酵母菌株進(jìn)行分型。

1.4 酵母菌的分子鑒定

以酵母基因組DNA提取試劑盒(天根生化，DP307)，按操作說(shuō)明提取代表菌株的基因組DNA。參考Kopsahelis等方法[16]，以基因組DNA為模板，使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)擴(kuò)增5.8S-ITS基因；使用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)擴(kuò)增26S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5 μL；dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL；正反向引物(20 pmol/μL)各0.5 μL；基因組DNA 5 μL(10～100 ng)；Taq DNA聚合酶 0.2 μL(1 U/μL)；補(bǔ)充ddH2O至體積為50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

將5.8S-ITS和26S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物委托北京六合華大基因公司分別以ITS 1和NL1引物通過(guò)ABI 3730XL測(cè)序儀測(cè)序。將測(cè)得的序列通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核酸序列比對(duì)分析，進(jìn)行菌種鑒定。調(diào)取代表菌株及其最相似參考菌株與模式菌株序列，通過(guò)MEGA 5.0軟件采用鄰接法進(jìn)行聚類(lèi)分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 篩選試驗(yàn)

分離純化后的代表菌株(RY1～RY6)，分別通過(guò)YPD平板劃線，30 ℃培養(yǎng)2 d后用無(wú)菌海水從平板上洗下細(xì)胞，3000 r/min 離心10 min，棄上清液，再用無(wú)菌海水漂洗和離心一次，懸于海水中。通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌液含量，并調(diào)整各菌株使其母液細(xì)胞含量保持一致，即5×108個(gè)/mL，4 ℃存放，3 d內(nèi)使用。

試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦幼體取自湛江東海島某對(duì)蝦種苗場(chǎng)，由同池同批次受精卵孵化無(wú)特定病原的無(wú)節(jié)Ⅲ期幼體。幼體培育試驗(yàn)用海水為天然海水經(jīng)砂濾后蓄于同一池，放幼體前加入體積分?jǐn)?shù)20×10-6的甲醛消毒1 d，再曝氣處理1 d。采用16 L塑料桶，每桶加海水(鹽度29.5，pH 7.9)10 L和無(wú)節(jié)Ⅲ期幼體2000只，共設(shè)6個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組，每組3個(gè)平行，處理組根據(jù)所加酵母菌設(shè)為RY1～RY6組。當(dāng)幼體從無(wú)節(jié)Ⅵ期剛開(kāi)始向溞狀Ⅰ期變態(tài)時(shí)(90%以上幼體仍為無(wú)節(jié)Ⅵ期階段)，投喂螺旋藻粉(淯暉公司)和蝦片(英聯(lián)公司)作為餌料，同時(shí)處理組各桶分別加入對(duì)應(yīng)的酵母細(xì)胞母液2 mL，即加入水體后的初始酵母菌，密度均為105個(gè)/mL，此后每隔12 h補(bǔ)加等密度的酵母細(xì)胞，共補(bǔ)加2次，對(duì)照組始終不投菌。試驗(yàn)期間不換水，水溫保持在(31.5±1.0) ℃。各組按同樣方式管理和飼喂，每隔4 h投餌一次。但當(dāng)處理組補(bǔ)加酵母時(shí)，均停止投料，即補(bǔ)加酵母前后間隔8 h再投料，人為對(duì)幼體造成一定的間歇饑餓脅迫。定時(shí)觀察幼體存活情況，當(dāng)幼體完全變?yōu)闇袪睥蚱跁r(shí)，計(jì)數(shù)存活幼體，統(tǒng)計(jì)存活率。

1.6 菌株RY4投菌方式試驗(yàn)

參照1.5方法，制備菌株RY4細(xì)胞母液(109個(gè)/mL)，每桶加海水(鹽度29.2，pH 8.05)10 L和無(wú)節(jié)幼體Ⅲ期凡納濱對(duì)蝦幼體2400只。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)平行，各處理組編號(hào)、單次投菌量、投菌次數(shù)和投菌時(shí)的幼體期見(jiàn)表1。高劑量和低劑量多次投菌組即MH和ML組的兩次投菌間隔時(shí)間為24 h。

表1 海洋紅酵母RY4在凡納濱對(duì)蝦幼體培育時(shí)的投菌方式

參照1.5方法，試驗(yàn)期間不換水，水溫保持在(31.5±1.0) ℃。幼體從無(wú)節(jié)Ⅵ期開(kāi)始向溞狀Ⅰ期變態(tài)時(shí)，每隔4 h投喂蝦片和藻粉，各組投喂量保持一致。提前單次高劑量組在幼體無(wú)節(jié)Ⅳ期時(shí)就較其他組提前加入菌株RY4。其他處理組在初次投喂餌料(無(wú)節(jié)Ⅵ期)的同時(shí)開(kāi)始加入菌株RY4。幼體發(fā)育至溞狀Ⅰ～Ⅱ期和溞狀Ⅱ～Ⅲ期時(shí)，分別從每桶分3次隨機(jī)各取250 mL水樣，結(jié)合肉眼和解剖鏡觀察計(jì)數(shù)存活幼體及其發(fā)育階段，統(tǒng)計(jì)存活率和變態(tài)率。溞狀Ⅱ～Ⅲ期后繼續(xù)投喂蝦片和藻粉，尚未開(kāi)始投喂鹵蟲(chóng)(Artemiasalina)幼體或其他餌料，造成營(yíng)養(yǎng)受限脅迫。2 d后統(tǒng)計(jì)各組存活率，同時(shí)從各桶取水樣，分別以水樣原液及其10倍稀釋液0.1 mL涂布于含0.05%氯霉素的YPD平板，每個(gè)梯度3個(gè)平板，30 ℃培養(yǎng)5 d，計(jì)算水體酵母菌含量，并通過(guò)Pearson積矩法分析其與幼體存活率的相關(guān)性。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)各組幼體存活和變態(tài)率進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，若差異達(dá)顯著水平時(shí)以Duncan′s多重比較進(jìn)行不同處理間的顯著性分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05或0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋紅酵母的分離與形態(tài)特征

從不同海產(chǎn)動(dòng)物腸道中共分離得到19株紅酵母，根據(jù)菌落和細(xì)胞形態(tài)特征并結(jié)合碳源利用譜將其劃分為6個(gè)類(lèi)型。各類(lèi)型菌落特征、細(xì)胞大小、分離源及代表菌株見(jiàn)表2，其中類(lèi)型1、2、6分別只從翡翠貽貝、斑節(jié)對(duì)蝦和褐藍(lán)子魚(yú)腸道中分離；而類(lèi)型3、4、5則從2種或2種以上動(dòng)物腸道中分離到。6個(gè)類(lèi)型紅酵母在YPD培養(yǎng)基上的菌落均呈圓形，凸起，邊緣整齊，不透明，除類(lèi)型6菌落直徑較小外，其余類(lèi)型菌落直徑大小相近；類(lèi)型2、3、5的菌落表面均為光滑或較光滑，橙紅色；類(lèi)型4的菌落表面略顯干燥，粉紅色；類(lèi)型1 和類(lèi)型6菌落分別呈紅色和淡橙紅色，兩者細(xì)胞大小較其他類(lèi)型相對(duì)偏小。

表2 6個(gè)類(lèi)型海洋紅酵母菌分離來(lái)源及形態(tài)特征

2.2 碳源利用結(jié)果

6個(gè)類(lèi)型酵母菌對(duì)8種碳源的同化測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。所有19株菌均能利用葡萄糖和蔗糖，但對(duì)肌醇、鼠李糖、乳糖和淀粉均不能利用。類(lèi)型2和3菌株碳源譜一致，均能利用棉子糖；類(lèi)型4和5菌株碳源譜一致，對(duì)L-阿拉伯糖也能利用；而類(lèi)型1和6酵母無(wú)法利用所測(cè)其他糖類(lèi)。

表3 海洋紅酵母分離菌株的碳源譜

2.3 酵母菌分子鑒定

6株代表菌的5.8S-ITS和26S rRNA基因測(cè)序后，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析顯示菌株RY2～RY5均與膠紅酵母(R.mucilaginosa)同源性最高，與其模式菌株的ITS和26S rRNA基因序列相似度均超99%。菌株RY1和菌株RY6分別與雙倒卵形紅酵母(R.diobovata)和斯魯菲亞囊擔(dān)菌(Cystobasidiumslooffiae)的同源性最高，菌株RY1與雙倒卵形紅酵母模式菌株的ITS和26S rRNA基因序列相似性分別為98.81%和99.65%；菌株RY6與斯魯菲亞囊擔(dān)菌模式菌株的ITS和26S rRNA基因序列相似性分別為98.03%和99.66%。6株代表菌與參考菌株的5.8S-ITS和26S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分別見(jiàn)圖1、圖2。兩個(gè)基因的發(fā)育樹(shù)均分為3個(gè)分支，即RY2～RY5與膠紅酵母歸為一類(lèi)分支；RY1和RY6分別與雙倒卵形紅酵母和斯魯菲亞囊擔(dān)菌聚為一類(lèi)。因此，菌株RY2～RY5均鑒定為膠紅酵母，RY1和RY6分別鑒定為雙倒卵形紅酵母和斯魯菲亞囊擔(dān)菌。

圖1 基于5.8S-ITS基因序列的海洋紅酵母系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of marine red yeasts based on 5.8S-ITS gene sequences GenBank序列登錄號(hào)顯示在括號(hào)內(nèi)；標(biāo)尺代表10%的序列差異. The sequences accession number in GenBank are shown in parentheses; the bar equals 10% sequence difference.

圖2 基于26S rRNA基因序列的海洋紅酵母系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of marine red yeasts based on 26S rRNA gene sequences GenBank序列登錄號(hào)顯示在括號(hào)內(nèi)；標(biāo)尺代表2%的序列差異. The sequence accession number in GenBank are shown in parentheses; the bar equals 2% sequence difference.

2.4 6株紅酵母對(duì)幼體存活影響

間歇饑餓脅迫條件下，與對(duì)照組相比，6株海洋紅酵母均能提高凡納濱對(duì)蝦溞狀Ⅱ期幼體存活率(圖3)。除膠紅酵母RY6組存活率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)外，其余5個(gè)菌株組存活率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。雙倒卵形紅酵母RY1、膠紅酵母RY2、膠紅酵母RY3和膠紅酵母RY5組間的存活率雖有一定波動(dòng)，但差異不顯著(P>0.05)。膠紅酵母RY4組平均存活率76.11%，高出對(duì)照組約40%，同時(shí)也顯著高于其他5個(gè)菌株處理組(P<0.05)，效果最佳。因此，確定膠紅酵母RY4作為進(jìn)一步試驗(yàn)的目標(biāo)菌。

2.5 膠紅酵母RY4投菌方式對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼體存活和變態(tài)影響

不同投菌方式下，膠紅酵母RY4對(duì)凡納濱對(duì)蝦溞狀Ⅰ～Ⅱ期和溞狀Ⅱ～Ⅲ期幼體存活影響見(jiàn)圖4。溞狀Ⅰ～Ⅱ期，各組平均存活率均超過(guò)70%，且組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；溞狀Ⅱ～Ⅲ期，除多次低劑量和提前單次高劑量組存活率顯著高于單次高劑量投菌組(P<0.05)外，各組存活率間仍無(wú)顯著差異(P>0.05)。不同投菌方式下膠紅酵母RY4對(duì)溞狀幼體的變態(tài)影響見(jiàn)圖5。提前單次高劑量、單次高劑量和多次高劑量投菌組溞狀幼體的變態(tài)率均普遍高于其他各組。溞狀Ⅰ～Ⅱ期階段同一時(shí)間統(tǒng)計(jì)時(shí)，3個(gè)高劑量投菌組溞狀Ⅱ期幼體平均變態(tài)率均超過(guò)80%，多次高劑量組變態(tài)率更是高達(dá)95%，極顯著高于對(duì)照組(3.5%)(P<0.01)；多次低劑量組變態(tài)率也顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但與單次低劑量組間差異不顯著(P>0.05)；而單次低劑量組與對(duì)照組間變態(tài)率差異不顯著(P>0.05)。溞狀Ⅱ～Ⅲ期階段同一時(shí)間統(tǒng)計(jì)時(shí)，提前單次高劑量、多次高劑量和單次高劑量組溞狀Ⅲ期變態(tài)率均顯著高于對(duì)照組和單次低劑量組(P<0.05)，其中多次高劑量組的變態(tài)率最高(53%)；而單次低劑量、多次低劑量和對(duì)照組的變態(tài)率分別只有1.56%、4.46%和0，3組間差異不顯著(P>0.05)。多次低劑量組對(duì)溞狀幼體變態(tài)雖然也表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，但效果明顯弱于3個(gè)高劑量組?？梢?jiàn)，不同投菌方式下膠紅酵母RY4對(duì)溞狀幼體存活率總體上無(wú)明顯影響，但無(wú)論在投餌料前如無(wú)節(jié)Ⅳ期單次高劑量投菌，還是初次投餌料開(kāi)始(無(wú)節(jié)Ⅵ期)時(shí)單次高劑量或多次高劑量投菌，均能顯著促進(jìn)幼體變態(tài)。

圖3 6株海洋紅酵母對(duì)凡納濱對(duì)蝦溞狀Ⅱ期幼體存活影響Fig.3 Effects of six strains of marine red yeast on survival of zoea Ⅱ of Pacific white shrimp L. vannamei CK.對(duì)照組； RY1～RY6.海洋紅酵母菌株RY1～RY6處理組編號(hào).柱狀圖上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05，n=3). CK.control group; strains RY1—RY6.the numbers for treatment groups of marine red strains RY1—RY6. The different letters above the columns indicate significant differences (P<0.05, n=3).

圖4 膠紅酵母RY4對(duì)凡納濱對(duì)蝦溞狀幼體存活影響Fig.4 Effect of R. mucilaginosa RY4 on survival of zoea larvae of Pacific white shrimp L. vannamei CK.對(duì)照組； ML.多次低劑量組； SL.單次低劑量組； SH.單次高劑量組； MH.多次高劑量組； ESH.提前單次高劑量組; 柱狀圖上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05，n=4); 下同. CK.control group; ML.multiple low-dosage group; SL.single low-dosage group; SH.single high-dosage group; MH.multiple high-dosage group; ESH.early single high-dosage group; the different letters above the column indicate significant differences (P<0.05, n=4); et sequentia.

圖5 膠紅酵母RY4對(duì)凡納濱對(duì)蝦溞狀幼體變態(tài)影響Fig.5 Effect of R. mucilaginosa RY4 on metamorphosis of zoea larvae of Pacific white shrimp L. vannamei

溞狀Ⅲ期后，因營(yíng)養(yǎng)受限脅迫，幼體陸續(xù)死亡，2 d后存活幼體均處于糠蝦Ⅰ期，但存活率均明顯下降(圖6)。對(duì)照組與單次低劑量組差異不顯著(P>0.05)，平均存活率分別只有2.1%和3.8%；多次低劑量、單次高劑量、多次高劑量和提前單次高劑量組存活率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中多次低劑量組平均存活率最高(16.67%)，但4個(gè)處理組間差異不顯著(P>0.05)。YPD平板計(jì)數(shù)糠蝦Ⅰ期各組水體酵母菌含量的結(jié)果見(jiàn)表4。多次高劑量組酵母菌含量最高，并顯著高于其他各組(P<0.05)；提前單次高劑量和單次高劑量組次之；多次低劑量組含量較少，但仍顯著高于對(duì)照組和單次低劑量組(P<0.05)；對(duì)照組酵母菌含量最低，但與單次低劑量組無(wú)顯著差異(P>0.05)。此外，YPD計(jì)數(shù)平板上，除對(duì)照組幾乎全部以及單次低劑量組大多數(shù)菌落為乳黃或白色酵母樣菌落外，其他各組平板上的酵母菌落絕大多數(shù)為粉紅色如膠紅酵母RY4樣菌落。除單次低劑量組外，其他投菌方式下膠紅酵母RY4均能以較高含量繼續(xù)存活于育苗水體。Pearson相關(guān)性分析顯示，糠蝦Ⅰ期各組幼體存活率與其水體酵母菌含量間呈現(xiàn)強(qiáng)的正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)0.9023)?？梢?jiàn)，在營(yíng)養(yǎng)受限條件下，糠蝦Ⅰ期幼體存活率主要取決于水體酵母菌尤其膠紅酵母RY4的含量。

圖6 膠紅酵母RY4對(duì)凡納濱對(duì)蝦糠蝦Ⅰ期幼體存活影響Fig.6 Effect of R. mucilaginosa RY4 on survivial of mysis Ⅰ larvae of Pacific white shrimp L. vannamei

表4 糠蝦Ⅰ期育苗水體酵母菌含量

3 討 論

3.1 對(duì)蝦育苗用紅酵母益生菌的鑒定與篩選

腸道微生物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、免疫和抗病起著重要作用[17-18]。自水產(chǎn)動(dòng)物腸道中分離和篩選益生菌不僅能更好地適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，也更容易定殖于宿主腸道[18-19]。紅酵母是海洋酵母的主要類(lèi)群之一，廣泛分布于不同海洋和海產(chǎn)動(dòng)物體表及腸道等環(huán)境[20-22]。雖然形態(tài)和生理生化特征常用于酵母菌的分類(lèi)，但對(duì)其準(zhǔn)確鑒定需要借助于核酸序列或脂肪酸圖譜等信息[20]。筆者自湛江地區(qū)幾種海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物腸道分離到19株海洋紅酵母，先根據(jù)形態(tài)和碳源利用特征將其分為6個(gè)類(lèi)型，再進(jìn)一步利用5.8S-ITS和26S rRNA 2種基因序列對(duì)代表菌株進(jìn)行鑒定并獲得一致結(jié)果。從分型和鑒定結(jié)果看，本試驗(yàn)鑒定的3種海洋紅酵母中，膠紅酵母最為優(yōu)勢(shì)，5種海產(chǎn)動(dòng)物腸道中都能分離到。齊瓊等[13，21-22]的研究也顯示，從不同海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物腸道中常分離到膠紅酵母。

膠紅酵母不僅在海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物腸道中普遍存在，也是水產(chǎn)益生菌中報(bào)道較多的海洋紅酵母[11,13,23]，但其在對(duì)蝦幼體培育中的應(yīng)用報(bào)道很少，且不同菌株間可能存在差異，如本試驗(yàn)鑒定為膠紅酵母的菌株，根據(jù)形態(tài)和碳源利用情況可分為4個(gè)類(lèi)型。另外，尚未見(jiàn)雙倒卵形紅酵母和斯魯菲亞囊擔(dān)菌用作對(duì)蝦益生菌的報(bào)道。筆者將4個(gè)類(lèi)型膠紅酵母及雙倒卵形紅酵母和斯魯菲亞囊擔(dān)菌代表菌株直接通過(guò)對(duì)蝦幼體試驗(yàn)，篩選目標(biāo)菌株，發(fā)現(xiàn)所有被測(cè)6株菌均能提高溞狀Ⅱ期幼體存活率，且5株具有顯著效應(yīng)，其中源自凡納濱對(duì)蝦腸道的膠紅酵母RY4表現(xiàn)最好。水產(chǎn)益生菌的篩選通常先根據(jù)待測(cè)菌的抑菌、胞外酶活性及對(duì)胃腸液耐受性等特征進(jìn)行體外測(cè)試，再進(jìn)一步通過(guò)飼養(yǎng)試驗(yàn)選擇和評(píng)價(jià)目標(biāo)菌株的益生效果[24]，這種方式適合對(duì)大量菌株進(jìn)行初篩。本試驗(yàn)則以溞狀Ⅱ期幼體存活率作為指標(biāo)，主要基于：(1)凡納濱對(duì)蝦溞狀Ⅱ期幼體容易出問(wèn)題而大量死亡，如經(jīng)常發(fā)生的溞Ⅱ綜合征[1,25]；(2)體外測(cè)試結(jié)果用于體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)常未表現(xiàn)出相應(yīng)效果，還可能遺漏真正有效的菌株，如有研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)在體外測(cè)試時(shí)雖不能拮抗病原弧菌，卻能有效促進(jìn)對(duì)蝦幼體變態(tài)和存活[26-27]；(3)尚未見(jiàn)海洋紅酵母對(duì)對(duì)蝦致病性的報(bào)道，通過(guò)對(duì)分離菌株分型去重后，筆者用于篩選的菌株只有6株。因此筆者直接以溞狀Ⅱ期幼體存活效果為篩選依據(jù)，能更有效選出目標(biāo)菌株。

3.2 投菌方式對(duì)膠紅酵母RY4作用效果影響

水產(chǎn)益生菌的投菌方式與其作用效果密切相關(guān)，特別是投菌劑量頗受關(guān)注[28]。投菌量不足，密度不夠，難以發(fā)揮作用，但盲目過(guò)量添加不僅增加使用成本，也可能適得其反，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物造成負(fù)面影響[28-29]。因此研究和優(yōu)化水產(chǎn)益生菌使用時(shí)的添加劑量、頻率以及投菌時(shí)間等至關(guān)重要。筆者設(shè)置高劑量、低劑量，多次、單次和不同幼體期的組合投菌方式來(lái)評(píng)估膠紅酵母RY4對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼體影響。結(jié)果表明，投菌劑量直接關(guān)乎膠紅酵母RY4在水體中的有效含量，最為關(guān)鍵的是，3個(gè)高劑量組均顯著促進(jìn)溞狀幼體變態(tài)和營(yíng)養(yǎng)受限時(shí)糠蝦Ⅰ期幼體存活，多次低劑量組也能顯著提高糠蝦Ⅰ期幼體存活率，但其對(duì)幼體變態(tài)效應(yīng)明顯弱于高劑量組。其次是投菌時(shí)間，在即將開(kāi)口攝食前(無(wú)節(jié)Ⅳ期)提前單次高劑量投菌組與無(wú)節(jié)Ⅵ期開(kāi)始的多次高劑量投菌組效果相當(dāng)。可見(jiàn)，適宜階段投菌不僅可減少投菌頻次，也可能有助于益生菌在水體和腸道中的定殖，特別是對(duì)蝦幼體在無(wú)節(jié)后期由內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)供給轉(zhuǎn)變?yōu)橥庠葱誀I(yíng)養(yǎng)攝入，開(kāi)口時(shí)幼體腸道處于原生態(tài)狀態(tài)，更易被加入的益生菌定殖，繼而對(duì)幼體后期的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮影響。

4 結(jié) 論

筆者自湛江地區(qū)海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物腸道分離鑒定了3種海洋紅酵母，其中膠紅酵母最為優(yōu)勢(shì)；饑餓脅迫下膠紅酵母RY2～RY5和雙倒卵形紅酵母RY1均能顯著提高凡納濱對(duì)蝦幼體存活，其中膠紅酵母RY4又明顯優(yōu)于其他菌株；應(yīng)用膠紅酵母RY4培育凡納濱對(duì)蝦幼體時(shí)，在早期幼體如無(wú)節(jié)Ⅳ期單次加入高劑量(5×105個(gè)/mL)，或首次投餌料開(kāi)始多次加入高劑量，可有效促進(jìn)幼體變態(tài)與營(yíng)養(yǎng)受限時(shí)的存活。

致 謝

感謝湛江市科壹水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司吳勇先生對(duì)本次幼體試驗(yàn)提供的幫助；感謝廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院劉嘉俊、譚勇賓、余瑋旭和陳賜觥等同學(xué)對(duì)本試驗(yàn)前期工作的協(xié)助。